Automatisert Kvantifisering og analyse av Cell Telle prosedyrer ved hjelp ImageJ Plugins

Abstract

The National Institute of Healths ImageJ er et kraftig, fritt tilgjengelig bildebehandling suite. ImageJ har omfattende partikkel analyse algoritmer som kan brukes effektivt for å telle ulike biologiske partikler. Ved å telle et stort antall celleprøver, presenterer den hemocytometer en flaskehals med hensyn til tid. Likeledes, teller membraner fra migrasjon / invasjon analyser med ImageJ plugin celleteller, men nøyaktig, er usedvanlig arbeidskrevende, subjektiv, og beryktet for å forårsake håndleddet smerte. For å møte dette behovet, har vi utviklet to plugins innenfor ImageJ for den eneste oppgaven av automatiserte hemocytometer (eller kjent volum) og migrasjon / invasjon celle telling. Begge plugins stole på evnen til å tilegne seg høy kvalitet mikrografer med minimal bakgrunns. De er enkle å bruke og optimalisert for rask telling og analyse av store utvalgsstørrelser med verktøy innebygde analyseverktøy for å hjelpe kalibrering av teller. Ved å kombinere hovedprinsipps av celleteller med en automatisk telling algoritme og post-telling analyse, øker dette i stor grad den letthet med hvilken migrasjons analyser kan bli behandlet uten tap av nøyaktighet.

Introduction

In vitro celle-telling er en viktig grunnleggende teknikk i et bredt spekter av vev kultur eksperimenter. Nøyaktig bestemmelse av antallet celler i en kultur er avgjørende for eksperimentell reproduserbarhet og standardisering ^1,2. Celletelling kan utføres manuelt ved hjelp av en hemocytometer samt bruke en rekke automatiserte metoder, hver med sine egne fordeler og ulemper ^3,4,5. De fleste av de automatiserte metoder for celletelling tilhører en av to klasser, de som bruker Coulter-prinsippet eller strømningscytometri. Coulter counter dra nytte av celler elektrisk motstand for å bestemme celleantallet og størrelse. De er raske, nøyaktige og billigere enn flowcytometere. Imidlertid blir de sjelden brukt for bare celletelling på grunn av sin betydelige kostnader sammenlignet med manuell telling ^3. Flowcytometere, på den annen side, er dyre, men de har mange anvendelser som for eksempel celletelling, analyse av cellene form, structure og måle intern celle markører ^4,5. Maskiner som bruker en av disse to prinsippene er tilgjengelig fra mange produsenter. Manuell telling er rimelig, men tidkrevende og under skjevhet mens automatiserte metoder kommer med en brøkdel av den tiden som er nødvendig for manuell telling, men ved hjelp av dyre maskiner ^6.

Andre vanlige cellekultur prosedyrer er in vitro cellemotilitet analyser, nemlig cellemigrasjon og invasjon ^7. Migrasjon og invasjons analysene blir ofte brukt for å undersøke celle motilitet og invasivitet som reaksjon på et kjemotaktisk respons. I tillegg er de mye brukt til å studere embryonisk utvikling, differensiering, inflammatorisk respons, og metastasering av flere celletyper ^7-11. Celler som har migrert eller invadert gjennom den porøse membran i en migrasjonsanalyse kan kvantifiseres på to forskjellige måter. For det første, ved farging av cellene med et fluorescerende fargestoff, dissosiasjon from membranen, og kvantifisering ved anvendelse av en fluorescerende leser ^12. En begrensning ved denne fremgangsmåten for mengde er at ingen registrering kan holdes tilbake av membranene, og det er ingen mulighet for videre analyse ^13. Den andre kvantifisering metoden for migrert / invaderte celler til å bli faste og farget med fluorescerende fargestoff eller mer vanlig, med cytologiske fargestoffer som krystallfiolett, toluidinblått fargestoff eller hematoxylin; Da cellene er kvantifisert manuelt ved hjelp av inverterte mikroskopiske bilder av disse membranene som er en svært tidkrevende oppgave ^12,13.

For å overvinne ulempene ved manuell celletelling, ble to pålitelige og nøyaktige automatisert celle tellere for cellekonsentrasjon og for migrering analyse utviklet. Disse automatiserte celleteller algoritmer ble utviklet for ImageJ som en plugin bruker Oracles Java programmeringsspråk. ImageJ er et offentlig og allment brukt bildebehandlingsverktøy utviklet av National Institute of HeaLTH (NIH) ^14,15; derfor skriver disse plugins for ImageJ muliggjør enkel integrasjon i det biologiske samfunnet.

Automatisering av celletelling sikrer høy gjennomstrømming og reproduserbarhet i forhold til manuell telling. Selv om andre tilgjengelige software og plugins kan brukes til å beregne cellekonsentrasjonen gjennom bildeanalyse ^5,16,17, Cell Konsentrasjon Kalkulator plugin er rask og kan også håndtere fortynninger av celler og behandlinger. Dessuten kan alle resultater og beregninger fra disse to tellerne lagres og eksporteres. De to plugg som er beskrevet i denne artikkelen er optimalisert for bruken av et fasekontrastmikroskop for levende celle avbildning og stort synsfelt (hel membran capture) avbildning for migrering analyse membraner ved anvendelse av en dissekere omfang. De plugins er fritt tilgjengelig for nedlasting med instruksjoner fra: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. sammensatt mikroskop og kamera Setup (Cell Konsentrasjon kalkulator)

1. Øk pære lysstyrken til full med lyset innstillingsknappen, bytt til 4X objektiv, og sikre fase kontrast filtre er valgt.
   MERK: Enhver omvendt fasekontrastmikroskop for vev kultur med en mørk bakgrunn, for eksempel, PhP fasekontrast, kan benyttes følgende standard mikroskop og kamera prosedyrer.
2. Innenfor mikroskop programvare, angi bildefangstinnstillinger til standardverdier.
   MERK: Se mikroskopet brukerveiledning for å finne plasseringen av disse innstillingene.
   1. Sett 'lysstyrke', 'kontrast', og 'metning' til 100% og "gamma" og "gain" til 1.0.
      MERK: Avhengig av programvaren, 'lysstyrke' og 'kontrast' kan misligholde til en verdi fra 0% i stedet for 100%.
   2. Sett bilder som skal fanges opp i svart og hvitt med den høyeste oppløsningen tilgjengelig påe (1600 x 1200 piksler (px) eller høyere).
      MERK: En 'metning' fra 0% er tilstrekkelig dersom en svart og hvit innstillingen er utilgjengelig.
3. Plasser en standard hemocytometer på mikroskopet scenen og ta et bilde som vist i (figur 1A); Dette er den "Volume Kalibrering bilde '. Juster eksponering tidspunkt etter behov.

2. Bildevolumkalibrering

1. Åpne ImageJ og fra Plugins menyen, starte Cell Konsentrasjon Calculator (CCC) plugin, f.eks Plugins> Analyzer> 'Cell Konsentrasjon Calculator ".
   1. Hvis høyresiden "Bilde Volume Kalibrering 'panel ikke er synlig, klikk på" Kalibrering "for å vise det.
2. I ImageJ, åpne 'Volume Kalibrering bilde' fra trinn 1.3 ( "Fil"> "Open ') og i CCC klikk' Få Bilde Dimension" -knappen.
   MERK: Dette vil fylle inn både Image Width ogHøyde tekstbokser med bildeoppløsningen i piksler automatisk.
3. I ImageJ, velger du "Rett Linje Tool" ved siden av utvalg verktøy og tegne en rett linje tvers over hele lengden av hemocytometer primære (P) kvadratet vist i (figur 1B) ved å klikke og dra markøren.
   1. Trykk på "M" -tasten for å vise resultater vindu som inneholder de rette målinger linjer. Skriv inn verdien fra kolonnen Lengde inn i "P-plassen Lengde 'tekstboks i CCC (figur 1B).
   2. Klikk på "Regn Bilde Volum-knappen for å skrive ut bildevolumet i bilde Volume tekstboksen. Alternativt, hvis volumet av bildet er allerede kjent, skriver volumet i NL inn bilde Volume tekstboksen.
4. Klikk på "Lagre" -knappen.
   MERK: Den plugin er nå kalibrert.

3. kameraets eksponering Calibration

1. Etter celle høsting fortelling via hemocytometer, last 10 mL av celler i et kammer av hemocytometer og plasser det i mikroskop scenen.
2. Ved hjelp av de samme innstillingene fra trinn 1.2, justere eksponeringstiden slik at bakgrunnen linjene i hemocytometer forsvinne.
   1. Justere fokus, slik at det indre av cellene er mørkere enn cellemembranen, noe som indikerer fokus inne i den sentrale tverrsnittet av cellen og ikke polene.
   2. Ytterligere justere eksponeringen slik at cellene ikke blir overeksponert og ligner de som er vist i (figur 1C).
      MERK: Lett synlige hemocytometer linjer er akseptabelt. Det anbefales å lagre eller registrere disse innstillingene for å opprettholde nøyaktighet og reproduserbarhet.

4. Image Acquisition

1. For hver celle prøve, for å last 10 mL i begge kamre i hemocytometer øke statistisk inferens strøm ^2. Plasser hemocytometer på mikroskopet scenenfor bildebehandling.
   MERK: Oppløsningen og forstørrelse av hvert bilde må være den samme som "Volume Kalibrering bilde '. Den plugin teller alle bildene av alle valgte mappen; holde bilder som skal telles sammen i samme mappe.
   1. Hvis et filnavn automatisk økning funksjonen er tilgjengelig, slå den på og sørge for at hvert bilde vises ikke etter fangst for å øke gjennomstrømningen.
      MERK: Manuelt lagre og lukke hvert bilde vil drastisk forsinke prosessen. Se i mikroskop brukerhåndbok for informasjon om tilgjengeligheten av en auto-tilvekst funksjon.
   2. Fange minst tre ikke-overlappende bilder av den sentrale regionen av hemocytometer selv om mer (5-10) anbefales for å øke nøyaktigheten.
      MERK: Unngå både de øvre og nedre områder av de kammer som celler har en tendens til å øke i tetthet på begge steder. Ta det samme antall bilder for hvert kammer. Dette er nødvendig for riktig funksjon av plugin under telling.

   5. Bildetelling og fortynninger

   1. I CCC, klikk på "Count Cells 'og observere Velg Directory dialogboksen. Velg en mappe som skal telles.
   2. Observer prøven antall input-boksen når du har valgt en mappe. Skriv inn antall bilder som er tatt per kammer, dvs., 4.1.2, og klikk "Ok". Den plugin vil nå telle alle jpg, tiff og png bildene i den valgte mappen i alfabetisk rekkefølge.
      MERK: Hvis du klikker på "Sample Viewer" -knappen vil bringe opp Sample Viewer-vinduet viser informasjon om de telles prøvene. Prøve konsentrasjonen er den gjennomsnittlige konsentrasjonen av alle bilder som er tatt per kammer. Prøver med dimensjonsløs konsentrasjoner kan legges til denne listen, for eksempel tillegg av et medikament eller lite molekyl behandling.
      1. Recount celleprøver dersom konsentrasjonene varierer betydelig innenfor tellinger av de samme prøvene (seksjon 4).
         MERK: For å beregne fortynninger for alle than regnet-prøvene, bruker CCC automatisk formelen C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Bruk scenario av seeding 15.000 celler per 200 mL i 30 brønner på en 96-brønns plate + en ekstra:
      1. Still tekstboksen til høyre for C2 etiketten til 15.000 og konsentrasjonen volum tekstboksen 200, endrer den tilstøtende kombinasjonsboksen enhet til 'ul'.
         MERK: plugin til slutt vil beregne konsentrasjonen i celler / ml.
      2. Kontroller at volumet kombinasjonsboksen har V2 valgt (endelig volum) og i tekstboksen til høyre angir 6200 (200 mL x (30 + 1)), velge "ul" i volumenhet kombinasjonsboksen.
   4. Klikk "Beregn Fortynning" for å legge til den gjeldende inngått fortynning til venstre listeboksen.
      NB: For hver fortynning tilsatt, vil bli løst for hver prøve, og som vises i treet diagrammet til høyre. Dobbeltklikk på hver oppføring for å utvide.
   5. Ved å klikke than 'Lagre' knappen under "Sample Viewer-knappen for å skrive til fil alle data og fortynninger.
   6. MERK: Disse dataene kan gjenopprettes når som helst ved å klikke på 'Load' og velge den lagrede filen.

   6. Migrasjon og Invasion (Counter)

   1. Utfør migrasjon og invasjon analyser ved hjelp av standard Boyden kammermetode ^7-9.
   2. Etter cellene har migrert / invadert, forsiktig fjerne mediene innenfor innsatsen ved å snu og forsiktig tapping. Transportere bort overflødig media levd opp til bunnen av membranen ved å berøre kanten til et papirhåndkle.
      MERK: Ikke berør membranen seg til håndkle, dette kan løsne følges celler.
   3. Fest og beis cellene som rapporterte ^7-9 i en 24-brønns plate satt opp med hver rad inneholder ~ 500 mL av en annen løsning, for eksempel, Fixative, Stain 1, Stain 2, og dobbelt destillert vann (DDH ₂ O). Fyll en ny plate med 1x PBS to plassere innsatser på før du skjærer.
   4. Vask innsatser ved å plassere dem i brønner fylt med DDH ₂ O og fylle innsatsen med DDH ₂ O. Tapp vannet før pensling bort celler ved inversjon.
   5. Bruk en ren bomulls applikator for å fjerne un-migrert / un-invaderte celler fra toppen av membranen tar seg ikke å skade membranen. Være grundig rundt kantene av membranen.
   6. Skjær membranen ved hjelp av en barberhøvel eller en skalpell og nøye overføre membran (opp ned) på et rent glass lysbilde.
   7. Legg en liten dråpe monteringsløsning under og på toppen av membranen og dekk med et tynt dekkglass.
      MERK: Unngå å fange bobler i monteringsløsning for å bevare nøyaktigheten av teller.

   7. Dissecting Omfang og Camera Setup

   1. Slå på mikroskop lyskilde og kamera.
      MERK: Se mikroskopet brukerhåndbok for detaljerte instruksjoner.
   2. Viddhin mikroskopet programvare, satt bildefotografering innstillinger til standardverdier.
      MERK: Hvis det finnes en gjennomsnittsfunksjon, er en verdi av fire anbefalte. Dette er et godt kompromiss mellom graden av gjennomsnitts og bildefangsten. Likeledes kan en liten grad av skarphet øke bildegjengivelse.
      1. Sett 'lysstyrke', 'kontrast', og 'metning' til 100% og "gamma" og "gain" til 1.0.
         MERK: Avhengig av programvaren, 'lysstyrke' og 'kontrast' kan misligholde til en verdi fra 0% i stedet for 100%.
      2. Sett display (real-time) og registreringsoppløsning til sine maksimale innstillinger (1600 x 1200 piksler og 2592 x 1944 piksler, henholdsvis).
         MERK: Skjermoppløsningen kan justeres etter behov om oppdateringsfrekvensen er for lav. Lavere oppløsning vil gjøre det vanskeligere å fokusere nøyaktig, men øke oppdateringsfrekvensen.
   3. For den fasen av dissekere omfang, bruk en solid hvit background; et sort eller glass bakgrunn er utilstrekkelig.
   4. Bruk oven scenen lyskilde, fortrinnsvis fra to fleksible LED-lys til høyre og venstre side av scenen.
      MERK: En under scenen lyskilde lyser porene innenfor migrasjon analysen membran som kan negativt påvirke nøyaktigheten av etterfølgende punkter.
   5. Plasser en ferdig migrasjon analysen membran lysbilde på scenen. Ser på bildet i sanntid vises av programvare, justere forstørrelsen med zoomjusteringsrattet slik at kantene på en enkelt membran er bare innen kameraets synsfelt.
      MERK: Plassering lysbildet på en glassplate overtop den hvite bakgrunnen scenen gjør det lettere å manøvrere lysbildet for bildebehandling.
   6. Juster lyskilde stillinger (7.6.1) og eksponeringstider for å reprodusere så nær som mulig den ideelle bildet vist i figur 2A. Avhengig av lysstyrken, bør eksponeringstider på 5-60 ms være tilstrekkelig.
      NOTAT:Målet er å produsere et bilde med så lite bakgrunnsfarge som mulig og et jevnt belyst membran uten å redusere bildegjengivelse, dvs. overeksponering fører til tap av synlige celler.
      1. Plasser venstre og høyre lyskilder i en liten vinkel i forhold til raset. Dette vil bidra til å fjerne bakgrunn flekken og kromatiske avvik. Prøv å holde hver lyskilde direkte motsatt til den andre.
         MERK: Selv om manøvrering hver lyskilde på plass, slå den andre av. Dette bidrar til å sentrere av belysningsarealet på membranen i seg selv lettere og mer nøyaktig.
   7. Fjern lysbildet og hvitbalanse bildet ved hjelp av en enkelt knapp klikk i mikroskop programvare.
      MERK: Mikroskopet er nå kalibrert. Lagre så mange innstillinger som mulig for fremtidig bruk og ta notat av lyskilde posisjoner og intensitet.

   8. Image Acquisition og Flatfield

   1. I programvaren, settfangst mappeplassering, og fange ett bilde per membran. Navn bildene følger den generelle malen av: Navn - ###, f.eks Control - 001.tif, Control - 002.tif, Test narkotika - 001.tif, og så videre.
      MERK: For beste bilderesultater, lagre bildet filtypen som TIFF fremfor andre lossy formater som JPEG.
      MERK: Bilder som ikke følger den generelle malen vil fortsatt bli regnet, men vil ikke være gjenstand for automatisk gruppering og flat Fielding.
      1. Hvis flatfield korreksjon er ønskelig, for hvert lysbilde finne et tomt område og ta en Blank bilde etter navnekonvensjonen: Navn - Blank.
         MERK: En blank er et område på lysbildet som inneholder ingen membran og representerer bakgrunnsbelysning.
      2. Umiddelbart før bildebehandling, flate hver membran ved å legge press over dekkglass og fjerne så mange fanget bobler som mulig.
   2. I ImageJ, gå til Plugins og åpne TC plugin; f.eks Plugins> Analyser> & #39; Transwell Counter '.
   3. Innenfor TC, klikk på 'Flatfield knappen og observere Velg Directory dialogboksen. Velg mappen der membranen bildene ble lagret.
      MERK: Bare bilder som er lagret med den generelle malen ovenfor vil automatisk bli flatfield korrigert og lagret i en ny mappe kalt Flatfield innenfor den valgte mappen. Se figur 2B for et eksempel på en flatfield korrigerte bildet.

   9. konfigurasjonsinnstillinger

   1. Åpne en migrasjon analysen membran bilde i ImageJ ( 'File'> 'Open') og velger Bilde> Juster> 'Color Terskel ...'. Observer Threshold vinduet Color justere hvilke farger vil bli filtrert ut av bildet.
      1. Nederst i vinduet, satt Terskelverdier metode for å 'Shanbhag', Terskel farge til "hvite", og Color plass til "RGB" (rød grønn blå); uncheck Mørk bakgrunn hvis valgt.
      2. Juster toppenglidere ved å klikke og dra markører til 0 og bunn glidere til 255 (la de nederste glidebryterne på 255). Sørg for at bildet er helt hvitt.
   2. Juster de grønne og røde topp glidere til bare de kjernene er synlige.
      MERK: Innstillingene valgt vil variere helt på cellen flekken brukes. Se figur 2C.
   3. I TC plugin, innspill verdiene av RGB-topp glidere til de tilhørende konfigurasjonsinnstillinger 'RGB Threshold' tekstbokser. Klikk "Legg til / endre" -knappen, og overskrive konfigurasjonen.
      1. La størrelsesområdet Nedre og Øvre verdier på 1 - Infinity.
   4. Innenfor konfigurasjonsinnstillinger panelet klikker du "Lagre" for å skrive innstillingene til harddisken.

   10. Telle bilder og kalibrering

   1. Åpne TC plugin (8.2) og klikk på "Count Folder" og observere Velg Directory dialogboksen. Velg mappen som skal telles ennd vente til den er ferdig.
   2. Hvert telt-prøven blir automatisk lagt til hovedtabellen. Nøkkel kolonner er "Greven", "Kvalitet" og "kalibrere? '.
      MERK: un-kalibrert Count er antall partikler per membran innenfor området som vises i kolonnen 'Areal range'.
      MERK: Kvalitet varierer fra ca -0,8 til 1,7; Q ≥ 0,5 er akseptabelt.
      1. Observere en hake i "Calibrate? kolonnen hvis et bilde er flagget for kalibrering basert på sin likhet med de ideelle beregninger.
         MERK: Både kvalitet og kalibrering kan tyde på at de aktuelle innstillingene er muligens utilstrekkelig. Hvis du etter riktig 'Color Terskelverdier' ​​og 'Størrelse Ranges' er valgt ut og kalibrering er fortsatt foreslått, inspeksjon av den opprinnelige og telles bildene bør være den siste determinant av en gyldig teller.
   3. Velg alle prøvene i tabell Merket for kalibrering.
      1. Høyreklikk i tHan tabellen, og velg Recount> 'Foreslått størrelse'. Dette vil fortelle om bildene med en foreslått minimum partikkel-området.
      2. Høyreklikk igjen og velg "Show Plot '. Observer hyppigheten spredningsplott av partikkel områder. En ideell bilde vil ha en graf likner en lang høyre-tailed normalfordeling, dvs. klokkekurve. Se figur 3B.
      3. Juster nedre Size Range, hvis nødvendig, ved å velge prøven, høyreklikke og velge Recount> 'Manuelle innstillinger ". Observere dialogen manuelle innstillinger. Angi ønskede innstillinger, og klikk Count å fortelle bildet med de nye innstillingene.
   4. For å justere teller manuelt, velger prøvene, høyreklikke på tabellen, og velg "Åpne bilde med teller". Observer originalbildet med røde markørene representerer hver partikkel telles ved plugin.
      MERK: Recount> 'Vis telles binære bildet "kan være nyttig å sjekke hvor godt jegindivid celler blir løst av farge terskel.
      1. For å legge til en teller, hold 'Ctrl' og venstreklikk. Observere en markør ved markørposisjonen som vil bli lagt til prøvene totalt teller. For å fjerne en markør, høyreklikk på bildet. Den plugin vil fjerne markøren nærmest markøren.
      2. For å fjerne en gruppe av markører, kan du bruke et utvalg verktøy i ImageJ å velge en region av interesse (ROI). Mens du holder Ctrl, høyreklikk på bildet og alle merkene inne i ROI vil bli fjernet. Observer celle nummer i 'Greven' kolonne.

   11. Lagre / Åpning Resultater og eksport til CSV

   1. I TC, gå til menylinjen og klikk på "File"> "Lagre resultater". Observer dialog Resultater Lagre boksen. Velg et navn og destinasjon og klikk 'Lagre'.
      1. Bruk "Fil"> "Åpne resultater" for å laste inn en fil som inneholder alle dataene som vises i hovedtabellen, including tomten.
         MERK: Resultatene fil lagrer kataloger bildene er lagret i Hvis de originale bildene flyttes etter lagring, 'Åpne originalbildet "og" Åpne bilde med teller' funksjoner vil mislykkes..
      2. For å tilbakestille bildekatalogen, velger prøvene, høyreklikk på tabellen, og velg "Reset bildekatalog". Observer Velg Directory dialogboksen. Velg den nye mappen, og hvis bildene eksisterer, vil katalogene tilbakestilles. Re-lagre resultater filen.
   2. Slik lagrer du en kommaseparerte verdier (CSV), i menylinjen velger du "Fil"> "Export to CSV". Dette gir en fil med prøver som er organisert i grupper med statistiske gjennomsnittet teller og standard feil av gjennomsnittet; oppsettet er utformet for rask graf i felles grafiske programmer.
      MERK: De statistiske grupper er basert på de gruppene som er opprettet i TC.
      1. Dersom prøvene følge den generelle navngiving mal, velger prøvene å være grouped, høyreklikk og velg "Auto gruppering". Dette legger prøver med den samme "navn" til den samme gruppen. Med eksempelet Control - 1, Control - 2, behandling - en, behandling - 2: begge kontrollene ville bli lagt til i gruppen "Control" og behandlinger til "behandling".
      2. Legg prøver manuelt til grupper ved å dobbeltklikke prøvens 'Gruppe' celle og skrive inn gruppenavnet. Velg prøvene som skal legges til denne gruppen, høyreklikk og velg "Legg til gruppe".

Representative Results

Cell Konsentrasjon Kalkulator

Figur 1 viser den totale prosessen med CCC kalibrering og tellbar image oppkjøpet. Figur 1A og 1B viser P-plassen kalibrering bilde og beregning av P-plassen lengde i piksler. CCC bestemmer cellekonsentrasjon i et gitt volum med formelen:

En hemocytometer P-kvadrat har et volum på 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) og gitt denne konstant, kan det totale bildevolumet beregnes etter konvertering til piksler mm. Figur 1C er en ideell tellbar bilde med fokus celler som viser den karakteristiske fasen belysning og ingen bakgrunn hemocytometer graderinger. Til slutt, den spredningsplott av Figure 1D viser en sterkt korrelert, manuell kontra automatisert telling av celler fra 57 bilder tatt over ulike eksperimenter og celletyper, inkludert HTR8, ES-2, og Swan71. Av notatet, øvre del av konsentrasjonen var ~ 5,6 x 10 ⁶ celler / ml med lave enden av ~ 2,3 x 10 ³ celler / ml (≈ 5 celler per bilde). Det er foreslått at hvis teller er under 10-15 celler pr bilde, bør prøven være opphengt i et mindre volum for å øke statistisk styrke.

Oppkjøp og prosessering av bilder for migrasjon analysen Counter

Hundrevis av migrasjon analyse membraner ble fotografert over mange eksperimenter, som alle ble sådd med Human trophoblast cellelinje HTR8, Swan71, eller eggstokkreft cellelinje ES-2. Av disse bildene, flere ble valgt til å representere et spekter av kategorier fra svært dårlig til utmerket kvalitet basert på lysstyrke, klarhet og farge på stained-celler, og graden av bakgrunnsfarging og uønskede partikler (støy). Ved hjelp av disse bildene, de RGB Threshold fargeinnstillinger (≈ 150, 120, 0) bestemt (figur 2C) og brukes som en baseline i alle etterfølgende utviklingen av algoritmen. Målet var å maksimere atom farge til total fargeforhold, dvs. bør flertallet av fargede piksler være innenfor cellekjerner. Den øvre panel i figur 2A viser det ideelle bildet lysstyrke, cellekjerner klarhet og farge, og ubetydelig bakgrunnsstøy. Lysstyrken på bildet er viktig å sikre at det er en stor nok kontrast mellom celle og bakgrunn for å produsere en svart og hvit binære bildet.

Dersom denne forskjellen ikke er oppfylt, kan store eller uforutsigbare områder telles med ImageJ Analyser Partikler funksjon; beste fall er en helt hvit bakgrunn. I opposisjon, den nedre panel av Fifigur 2A har ekstrem bakgrunnsfarging og celler som er nesten utvisket. Membraner med denne graden av flekker vil mest sannsynlig gi upålitelige resultater fra migrasjon analysen telleren.

I noen tilfeller kan øke lysstyrken til det ideelle nivået påvirke bildekvaliteten ved å overeksponere bildet. Tilsvarende kan høy eksponering eller lysstyrke produsere systemiske kromatiske effekter med progressiv eller uregelmessig lyse og mørke områder. Med flatfield korreksjon, kan disse effektene reduseres eller fjernes helt, som vist i Figur 2B (øvre vs. nedre panel). Videre er flatfield korrigering en god måte å utjevne lysstyrken av flere membran bilder.

Kalibrering og validering av migrasjon analysen Counter

For å hjelpe osser i bedre avgjøre om migrasjon analysen membran bildene oppfyller de nødvendige kriteriene for nøyaktig telling, to kvalifiseringskamper ble utformet, kalt bildekvalitet (Q), og kalibrering anbefaling (CR). Viktigere, begge kvalifiseringskamper, som navnet CR antyder, er anbefalinger bare og fungere som guider snarere enn absolutte dommere i countability av hvert bilde. Både Q og CR er basert på beregninger av hyppigheten spredningsplott av partikkelområdet (10.3.2). For forenkling, kan en beregning betraktes som de forskjellige former av den kurve som utgjør den frekvens plottet. Den ønskede beregning av en tilstrekkelig Q (≥0.5) ble bestemt ved den observerte tilnærmet normal fordeling av cellestørrelsen. Vanligvis, celler som er uløselig fra hverandre, over-farget, eller bare spesielt stor, forskyve skewedness til en høyre-tailed normalfordeling (Figur 3B). Som sådan, er dette den ideelle beregningen av en typisk kalibrert bilde. Medtilsetning av bakgrunnsstøyen, som normalt fører dette til et stort antall partikler i 1-5 pikselområde område (figur 3A). For å beregne plottet beregninger, blir dataene utstyrt med ti Savitzky-Golay utjevnede kurver med forskjellig polynom grader produsert av Dr. Michael Thomas Flanagan Java Scientific Library (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga / java /). I hovedsak skaper flere punkter i den omtrentlige regionen i hvert ytterpunkt. Gjennom en rekke tetthet klase kart over lokale minima og maksima, kan et generelt bilde av tomten beregninger bli beregnet som en sortert liste, dvs. minimum, maksimum, minimum / maksimum overlapping, ..., n ^th ytterpunkt. I korthet, i hvilken grad de utjevnede kurvene passer til frekvensdata bestemmer hvor tett pakket i ekstrempunkter. Jo større gruppering av ikke-overlappende ytterpunkter, blir større Q. I teorien representerer Q samlet bilde klarhet basert på than fordeling av ulike partikkelstørrelser.

Hvorvidt boolsk CR er sant eller ikke, avhenger av rekkefølgen av ekstrem. Fra figur 3A, vil den ordnede listen være minimum, maksimum, og en sekvens av overlappende ytterpunkter basert på egenskapene til den Savitzky-Golay kurve. Siden figur 3A representerer en ukalibrert bilde, denne generelle sekvens for Extrema flagg CR som sanne, noe som tyder på at brukeren at bildet kan trenge kalibrering. Fremover, kan det ses at fra figur 3B, vil denne listen være identisk, men med utelukkelse av den første minimum. Dermed beregningene av ideelle ukalibrerte og kalibrert bildene ble bestemt. Avvik fra disse beregningene vil generelt flagge et bilde for kalibrering og redusere Q ≤ 0, slik som tilfellet er med høy bakgrunnsstøy membran i figur 3C. Bruk av disse kvalifiseringer til et utvalgav beskjeden til utmerkede bilder, med hensyn til lysstyrke og bakgrunnsstøy, er det klart at kalibrerte bilde teller er betydelig nærmere manuelle tellinger enn ukalibrerte (1,9% ± 0,3 vs. 21,7 ± 2,9%, henholdsvis figur 3D, E). Gitt den generelle høye kvaliteten på bildene er valgt for analyse (ukalibrert = 0,71 ± 0,04; gjennomsnitt ± SE), det var en forventet moderat økning bare i Q etter kalibrering ( = 0,90 ± 0,04). Til sammen tyder Q den generelle countability potensialet i et bilde, mens CR er en sterk indikator på om kalibreringen er vellykket eller ikke.

Timing Sammenligninger av begge celle Konsentrasjon Counter og migrasjon analysen Counter

Figur 4A sammen CCC kalibreringstiden mellom Bruker 1 og 2. Som forventet, Bruker 1 var vesentlig raskere enn Bruker to, sammen, tar i gjennomsnitt omtrent fem minutter for CCC kalibrering. For å sammenligne manuell hemocytometer telling og automatiserte priser, ble den manuelle hastigheten for telling ved hjelp av et telleapparat teller i forhold til den tid det tok for å ta ni bilder av hemocytometer kammeret og tellet i CCC (figur 4B). Et typisk cellekonsentrasjon på 1,15 x 10 ⁶ celler / ml ble anvendt for å sammenligne tidsberegning, som fører til et gjennomsnitt på 1 x økning i gjennomstrømningen. Denne hastighet vil variere avhengig av antall celler lastes inn ihemocytometer som den totale tiden det tar å ta bilder og behandle dem er uavhengig av celle nummer.

Til slutt, timings omfatter image oppkjøpet av membraner, kvantifisering i TC, og manuelle justeringer av disse bildene ble målt i figur 4C. Spesielt ble 12 migrasjon analyse membraner med lavt celletall (Totalt = 10,571 celler) og betydelig bakgrunnsfarging og cellerester valgt å legge til rette for et worst case scenario som ville kreve manuelle justeringer i celle nummer. Dette gjenspeiles i figur 4C justering (ADJ) kolonnen der det tok i gjennomsnitt 13 minutter for å fjerne uønskede teller og legge tapte celler. Til sammenligning til manuell telling, ble optimal celletellingsprisene bestemmes med celleteller; høykvalitets membran bilder med høy celletetthet ble anvendt (resultater ikke vist). Dette ga en gjennomsnittlig maksimal hastighet mellom Bruker 1 og 2 på 9,1 x 10 ³ celler / t(~ 2,5 celler / s). Ved hjelp av disse tallene, ble membranene fra figur 4C telles 4.4x raskere med TC enn det som forventes ved maksimal manuell hastighet. Tidsbesparelsen er direkte avhengig av celle nummer og bildekvalitet, ved å telle migrasjons membraner som kreves liten eller ingen justering og høy celletetthet (~ 7000 celler / membran), TC genererte celletellinger 1,395x raskere enn den maksimale manuell hastighet.

Figur 1: Cell Konsentrasjon Kalkulator. (A) Fasekontrast mikrofotografi av den sentrale primære kvadratet av hemocytometer tatt ved 40X total forstørrelse. Scale bar representerer 200 mikrometer. (B) En beskjæres versjon av bildet fra (A) som viser hva lengden å måle på hemocytometer. Den Resultater vindu Lengde Kolonnen ble fremhevet for enkel identifisering. Yellow bar= 1 mm. (C) En ideell micrograph av en hemocytometer inneholder HTR8 celler etter mikroskop og programvarekalibrering på 40X total forstørrelse med en oppløsning på 1600 x 1200 piksler. Scale bar = 200 mikrometer. (D) Et spredningsdiagram sammenligne manuelle tellinger ved hjelp av ImageJ plugin Cell Counter forhold til automatiserte tellinger av de samme bildene ved hjelp av cellekonsentrasjonen Kalkulator. n = 57 bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Migrasjon analysen motvirke representative bilder. (A) Den øvre panelet er en åttedel del av en total membran som viser et ideelt bilde med minimal bakgrunns; Scale bar = 200 mikrometer. Denedre felt inneholder et bilde med sterk bakgrunnsfarging som alvorlig påvirker nøyaktigheten av den automatiske telle; Scale bar = 585 mikrometer. (B) Den øvre panel representerer et mørkt bilde av god kvalitet som produserte feilaktige tellinger. Den nederste skjermen er et tellbar versjon av det samme bildet etter flatfield korreksjon. Skala barer = 593 mikrometer. (C) Den øvre panel representerer en forstørret visning av en typisk membran. Den nedre panelet er det samme bildet etterfulgt av ønsket ImageJ farge thresholding (RGB Threshold = 150, 120, 0) for å fjerne inter bakgrunn og det meste av synlig farget cytoplasma. Alle bildene ble tatt på 1.35X total forstørrelse med en kalibrert dissekere omfang med en oppløsning på 2592 x 1944 piksler fra flere migrasjon analyse invasjoner av HTR8 farget med hematoksylin. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å viewa større versjon av dette tallet.

Figur 3: Kalibrering og validering av migrasjon analysen c ounter. (A) Typisk eksempel på en ukalibrert bilde av høy kvalitet. (B) Den kalibrerte versjon av (A) ved hjelp av migrasjon analysen disken er Recount> 'Foreslått størrelse'. (C) En typisk frekvens plotting av en lav bildekvalitet membran med betydelig bakgrunnsflekker eller samlet mørke. (D) Et spredningsdiagram sammenligne manuelle tellinger ved hjelp av ImageJ plugin celleteller og migrasjon analysen teller automatiserte teller. (E) Et søylediagram som viser gjennomsnittlig prosent forskjell på kalibrert mot ukalibrerte automatiserte teller. Dataene er gjennomsnitt ± SE. P <0,0001, n = 30, uparet t-test med Welch er correDette skjer. De samme bildene ble brukt til D og E. Kalibrering av begge var ferdig med Recount> 'Forslag size "og Recount>' manuelle innstillinger 'for å begrense minstemål regnet og fargegrense. Ingen manuelle count justeringer ble gjort ved hjelp av "Åpne bilde med teller 'funksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Timing av Cell Konsentrasjon Counter og migrasjon analysen teller bruk. (A) Sammenligning av CCC kalibrerings ganger (trinn 1 og 2) mellom Bruker 1 (CCC / TC ekspert) og Bruker 2 (CCC / TC nybegynner). (B) Manuelle celletellings ganger ble fordelt på fem forsøk og uttrykt i cellene telles per min. autoc tellinger ble beregnet ved å ta gjennomsnittet ganger for å ta ni bilder av en hemocytometer kammer og telles med CCC. Cellekonsentrasjon som ble benyttet var ~ 1,15 x 10 ⁶ celler / ml. Dataene er gjennomsnitt ± SE. n = 5. (C) Transwell Counter timings ble sammenlignet over tre kategorier: oppkjøpet (ACQ, trinn 7 og 8), kvantifisering (Ant, trinn 10.1-10.3.3 bruker standardinnstillingene) og manuell justering (Adj; skritt 10.4 -1.4.2). Membranene kvantifiseres hadde en høy grad av bakgrunnsfarging og rusk for å kreve betydelig manuell justering for nøyaktige tellinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Kritiske Steps, feilsøking og begrensninger

Selve innholdet av automatiserte beregningsmetoder, spesielt de av partikkelanalyse, nødvendiggjør matematisk evne til å definere disse partiklene. Derfor nøyaktigheten av både Cell Konsentrasjon Kalkulator og migrasjon analysen telleren er majorly avhengig av bildegjengivelse, det vil si hvor nært tatt bilde ligner på celleprøve eller migrasjon analysen membran. Det er derfor av største betydning for å følge mikroskop og tilhørende programvare kalibreringsprotokoller som best som mulig. Dette inkluderer å begrense bakgrunnsstøy, redusere uønskede partikler, fange lys og jevnt i fokus bilder, og sparer i ikke-lossy filformater som TIFF. Dermed begge plugins er sannsynlig å produsere feilaktige resultater dersom disse kravene ikke er oppfylt. Det er derfor alltid lurt å dobbeltsjekke celler for å finne ut om de passer visuelle forventninger når i dobbt. Hvis ja resultatene ikke samsvarer, sammenligner originalbildet med det binære bildet kan hjelpe belyse problemet (10.4 note). I noen tilfeller kan mørkere migrering analysebilder inneholde store områder som er blitt tellet på grunn av pikselverdier som ligger innenfor farge terskelgrenser. Generelt vil bruk av en flatfield bilde fjerne mørke og blotchiness og forhindre de fleste uønskede teller på grunn av kromatiske uregelmessigheter.

Gitt disse mulige og relativt vanlige problemer, er det viktig å følge standard bildeintegritet retningslinjer som de er foreslått av Nature Publishing Group og andre ^13. For å holde teller konsekvent, bør eventuelle korrigeringer av ett bilde skal anvendes likt for alle andre. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til kontrast, metning, lysstyrke, gain, filtre som gjennomsnitts og skarphet, og fargefiltre. Justering av gamma bør unngås da det gjelder en ikke-lineær endring av pixel farge og så kan påvirke hvert bilde forskjelligly ^14. Når du søker en felles eksponeringstiden til bilder med få celler (<1000), kan dette føre til overeksponering og tap av bildegjengivelse. Omvendt kan en membran med tusenvis av celler krever høyere eksponeringstider for å unngå undereksponering. Følgelig er det beste praksis å justere bilder så lite som mulig, og bare når det er nødvendig, for å opprettholde den høyeste bildegjengivelse oppnåelig.

Selv med en high fidelity bilde, kan true partikkeltellinger være alvorlig skjev av uønskede partikler. Ved bruk av cellekonsentrasjonen kalkulator, hvis prøven inneholder betydelige mengder av celleavfall, spesielt fra områdene som ligner på de av suspenderte celler, kan dette føre til ujevnheter resultatet. I noen tilfeller kan dette hindre at automatisk analyse dersom avfallet ikke kan minimeres. Likeledes, for å migrasjon assay-membraner som inneholder høye nivåer av bakgrunnsfarging av samme farge farget celler eller unremoved celler fra baksiden av membranen, vil sannsynligvis produsere jegnNøyaktighetsradius resultater. Disse uønskede partikler kan normalt fjernes på flere måter: øke lys lysstyrke eller eksponering kilde tid, endrer farge thresholding å være strengere, eller fjernes manuelt via 'Åpne bilde med teller' (10,4). Det er viktig å merke seg at denne protokollen gir optimal bildekvalitet som kreves for CCC og TC for å opprettholde nøyaktighet. Imidlertid er TC stand til å telle bilder av betydelig mindre kvalitet, varierende forstørrelser, eller forskjellige farge flekker, vanligvis bare krever mer tid brukt på manuelle justeringer (10.4).

Under kalibrering av enhver migrasjon assay membranen bilde er det viktig å ta hensyn til oppløsningen av bildet og den relative størrelsen av cellene. Som tidligere beskrevet, bildekvalitet (Q) og kalibrering anbefaling (CR) er avhengig av frekvens tomten beregninger av partikkel-området. Av de bildene som ble analysert, tar hver celle opp i gjennomsnitt 1/100000 avhele bildeområdet. Ved bruk av bilder av bare millioner av piksler med en liten celle størrelsesforhold, variasjonen i celle størrelse er også liten. Det vil si, variansen kan bare variere 10-60 px. Men etter hvert som celleområdet til bildearealforhold blir større, fordelingen av cellestørrelser øker, noe som reduserer kurtose av cellestørrelsen normalfordelingen ved å redusere frekvensen av et gitt område. Dette i sin tur kan gjøre automatisk beregning av cellearealet mer vanskelig eller umulig fordi et bestemt minimumsareal ikke kan bestemmes. Tilsvarende gjelder dette også for bilder med få antall celler hvor frekvensen til forskjellige cellestørrelser kan være meget lav (<50). Som et resultat, når analysere bilder med forskjellige oppløsninger enn de som brukes i denne undersøkelsen eller forskjellige fordelinger av cellestørrelse, manuell identifisering av cellestørrelsesområde kan være nødvendig (10.3.3).

Betydning og fremtidige retninger

Den ImageJ plugin celleteller ble opprinnelig reledessuten økt i 2001 av Dr. Kurt De Vos og har fungert som en stift for manuell celle telling i dag. For å fortsette utviklingen av fritt tilgjengelige verktøy for det biologiske samfunnet, Cell Konsentrasjon kalkulator og migrasjon analysen mottilbud neste trinn i gratisverktøy for å bidra til å øke gjennomstrømningen og inter-eksperimentell reproduserbarhet av migrasjon analyser. Sluttresultatet av migrasjon analyser er svært avhengig av antall celler sådd. Ergo en pålitelig celletall er en nødvendighet for reproduserbarhet. På denne måten CCC tilbyr både økt nøyaktighet som følge av høyere statistisk sikkerhet av cellekonsentrasjon og kortere telletider bevare celle helse.

Videre sluttresultatet av begge plugins er en telling av celle nummer og ikke en relativ indeks som fluorescens. Diverse andre protokoller finnes det tiltak fluorescens etter farging, men disse metodene lider av mangel på sensitivitet ^13. Adobe Photoshop har sin egen partikkelanalyse tool men programmet må kjøpes for bruk og tilbyr ikke etter telling analyse tilgjengelig fra migrasjon analysen teller ^20. Begge plugins stole på partikkeltelling funksjonen fra ImageJ og dermed kan endres av sluttbrukeren ved å redigere makroer brukes av ImageJ. Dette gir større fleksibilitet for brukeren å utvide omfanget av plugins til andre partikler ved å opprette nye makroer. Videre utvikling for å øke bredden i tellbar partikler og innlemme sluttbruker bidrag er det neste logiske skrittet. Ved å kombinere de viktigste prinsippene for celleteller med en automatisert telling algoritme og post-telling analyse, øker dette i stor grad brukervennligheten som migrasjonsanalyser kan behandles uten tap av nøyaktighet. De plugins er fritt tilgjengelig for nedlasting med instruksjoner fra: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required