Introduction
Dictyostelium의 discoideum은 식균 작용에 의해 촬영 박테리아 및 기타 미생물에 먹이 독방 토양 생활 아메바입니다. 그것은 그것의 발견 1 일 이후 연구의 주요 영역을했습니다 독특하고 놀라운 수명주기를 가지고있다. 다세포 개발 2과 화성 3의 분자 기준에 초기 관심은 곧 세포 운동성, 세포 극성, 선천성 면역에 초점을 맞춘 연구에 의해 보완되었다. 또한, D. discoideum는 생물 의학 연구 4,5를위한 모델 시스템으로 도입되었다.
최근에, 우리는 D. 설립 discoideum 단백질 품질 관리 (PQC) -6,7- 시스템을 연구하기위한 새로운 시스템이있다. 그 프로테옴 단백질 품질 관리 8에 도전을 제기 응집 경향 프리온과 같은 단백질이 풍부한된다. D. 여부를 조사하려면 discoideum은 매우 AG를 제어하는 특별한 분자 메커니즘을 개발했다회중하기 쉬운 프로테옴 우리는 정상적인 성장 조건 하에서 스트레스 동안 모두 응집 경향 마커 단백질의 거동을 연구 하였다. 이러한 열 응력 등의 응력 조건은, 단백질 미스 폴딩 (9)의 속도를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 따라서, 우리는 온도 변화를 유도하고, 동시에 마커 단백질의 동작을 수행 할 수있는 시스템을 찾았다. 이를 위해, 우리는 열 단 삽입 (냉각 실)를 사용하여 펠티에 제어형 가열 라이브 세포 이미징을 조합. 이 방식은 우리가 일정하고 균일 한 온도를 유지하기 위해뿐만 아니라 신속하면서도 정확한 온도 변화를 유도 할 수 있었다.
라이브 세포 이미징 D. 생물학적 다양한 공정을 연구하는 데 사용되는 discoideum. 그러나,이 방법은 두 가지 한계에 직면 해있다. 첫째, 세포 따라서 개별 셀의 추적, 높은 운동성을 표시하고 시야에서 마이그레이션하는 경향이 종종 넓은 지역의 영상을 필요로한다. 세포 이동성 수한천 오버레이 (10)에 의해 감소 될 수 있지만, 이러한 조건으로 인해 생존의 감소로 장기 촬상에는 적합하지 않다. 둘째, D. discoideum 세포는 세포 라운딩과 유사 분열 체포 (11) 결과 사진 독성에 특히 높은 감도를 보여줍니다. 이전 프로토콜은 라디칼 스 캐빈 및 노출 시간 (12)의 감소와 같은 아스 코르 빈산을 첨가하여이 문제를 해결. 관심의 단백질이 낮은 수준으로 발현과 약한 형광 신호를 표시하는 경우 후자는 중요 할 수 있습니다. 저자는 또한 에어컨의 영상 또는 목적 및 현미경 스테이지 (12)을 포함 온도 조절 배양 상자를 사용하여 하나 21 ° C의 온도를 일정하게 제공하는 것이 좋습니다.
여기에서는 23 ℃로 설정된 냉각 실을 사용하여 개선 된 온도 제어 방법을 설명한다. 우리 셋업 촬상 동안 상당히 광 독성에 대한 저항성을 향상시킨다. 이것높은 노출 시간 및 더 높은 여기 광 강도의 사용을 허용한다. 시간 간격은 묘화 위치의 수 및 사용되는 노광 시간에 대한 균형 잡힌해야 이것은, 저속 촬상 중에 특히 중요하다. 결상 위치의 수를 증가시킬 가능성이 넓은 묘화 영역의 범위를 허용하고 더 긴 시간 동안 각 셀의 추적을 용이하게한다.
Protocol
1. 셀 준비
- 성장 세포
- D. 성장 조직 배양 플레이트의 조명 아래 23 ° C에서 AX 매체에 discoideum 세포. 75 % 컨 플루 위의 높은 밀도에서 세포를 유지하지 마십시오.
주 : 최적의 응답은 열 스트레스를 들어, 세포가 기하 급수적 성장기에 있어야하고 정지상 도달 안된다. - 영상 전날, 1 × 104 세포 / ml 낮은 형광 매체 (LFM)로 분할 세포.
주의 :이 단계는 AX 매체에 의한 백그라운드 형광을 감소시킬 필요가있다. 배양 시간이 2 시간을 최소한으로 줄일 수있다. 그러나, AX 매체에 용해 소체 여전히 2 시간 후에 약간의 배경 신호를 생성 할 수있다.
- D. 성장 조직 배양 플레이트의 조명 아래 23 ° C에서 AX 매체에 discoideum 세포. 75 % 컨 플루 위의 높은 밀도에서 세포를 유지하지 마십시오.
- 현미경에 대한 준비 세포
- 촬영하기 전에 LFM에서 조직 판에서 수확 세포와 유리 바닥 접시에 세포의 적절한 수를 전송합니다.
참고 : 일반적으로,1 × 10 5 세포 / ㎖ 충분하다; 실험 장치 (8 시간 이상) 긴 촬상 기간을 필요로하는 경우에는, 셀 번호 신중 D. 같이 조정될 필요 discoideum 세포는 발달주기에 전환과 영양분이 낮은 동안 휴대 번호가 높은 경우 스트리밍 집계하기 시작합니다. - 세포가 20 분 동안 정착하도록 허용합니다. 조심스럽게 새로운 배지로 사용되는 매체를 대체하여 비 정착 세포를 제거합니다.
- 촬영하기 전에 LFM에서 조직 판에서 수확 세포와 유리 바닥 접시에 세포의 적절한 수를 전송합니다.
2. 이미지
주 : 프로토콜 넓은 필드 시스템뿐만 아니라, 공 초점 현미경 설정에 사용될 수있다. 목적을 덮는 온도 제어 배양 상자 현미경 스테이지의 사용은 유용하면서도 온도 제어에 필수적이지 않다. 열 응력 행하면 배양 상자의 온도는 40 ° C로, 실험 예에서 사용 된 높은 온도로 설정된다. 그렇지 않다면, 온도는 25로 설정되어있는6; C. 온도 변화는 촬상시의 온도의 변화가 초점에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 시스템은 적용 할 수 있도록 사전에 이루어져야한다.
주 : 촬상 동안, 온도가 냉각 실을 사용하여 제어된다. 비 스트레스 세포 이미징의 기본 온도는 23 ° C이다. 열 스트레스 조건, 온도를 원하는 수준으로 적절하게 증가된다. 냉각 실의 피에조 소자는 온도 변화에 빠르게 응답 할 수있다. 그러나, 이미지의 초점은 (는 온도 변화에 따라 최대 20 ㎛, 이탈 가능)이 약간 변화된다. 사용한 현미경 하드웨어 자동 초점이 장착되어 있지 않으면 서, 이와 같이 재 초점은 화상 획득의 첫 번째 분 내에 요구된다.
- 비 응력 조건 하에서 화상 취득
- 23 ° C에서 비 스트레스 조건에서 이미지 세포는보기의 6 분야 (영상 범위)의 최소 취득.
참고 : 비 스트레스 조건은 visualiz 될 수 있습니다에드 대표 스틸의 짧은 시간 경과 (5 ~ 30 분) 또는 취득을 기록하여 하나. 각 조건 또는 셀 라인보기의 6 분야 (영상 범위)의 최소 취득.
주 : 각 셀이 관심이있는 경우, FOV의 중앙에 각 셀의 위치와 중앙에서 관심 셀을 포함하는 FOV 가진 3 × 3 타일 D. 시리즈를 녹화한다. discoideum 세포 운동성 및 FOV에서 마이그레이션 것이다. 단, 3 × 3 타일 시리즈 잠재적으로 관심있는 셀이 탐색 영역을 증가시키고, 이것은 ~ 6 시간의 경과 기간의 추적 유지된다. - 셀의 전체 부피를 캡처 1-0.25 μm의 단계에서 최대 7 ㎛ 인 Z-스택을 획득.
- 세포의 총 수를 평가하는 기준 시야 화상을 취득.
- 23 ° C에서 비 스트레스 조건에서 이미지 세포는보기의 6 분야 (영상 범위)의 최소 취득.
- 열 스트레스에 대한 이미지 수집
- 제조업체의 지시에 따라 30 ℃까지 냉각 실의 온도를 조정한다. </ 리>
- 온도 표시부가 원하는 값에 도달 한 후에, 시야 채널 수동 촛점과 저속을 시작하기 전에 기록 된 모든 영상 범위를 확인한다.
- 시점 간 5-10 분의 시간 간격으로 열 응력의 4 시간 동안 시간 경과를 시작한다. 올바른 처음 두 시점의 취득시 초점 확인합니다.
- 복구시 이미지 획득
- 열 스트레스 후, 다시 23 ° C까지 온도를 감소 조정하고 수동으로 집중할 수있는 온도 표시 될 때까지 기다립니다.
- 10 ~ 20 분 시간 간격으로 8 ~ 10 시간 동안 복구 단계에서 기록 시간 경과 영화. 올바른 처음 지점의 인수 동안 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.
3. 이미지 분석
주 : 세포질 병소 형질 세포 수를 정량화 세포의 총 수 및 각 시간 세포질 병소와 세포의 수를 평가하기틀. 때문에 시야 이미지에서 세포를 분할의 어려움, 정량화 수동으로 수행해야합니다. 이하에서, 데이터 분석이없는 화상 처리 패키지 ((http://fiji.sc/Fiji). 이것은 "셀 카운터"(http://fiji.sc/Cell_Counter) 플러그인을 필요 대해 설명한다.
- 세포의 수를 평가
- "파일"및 "열기"를 클릭하여 밝은 이미지 필드 스택 (XYT)를 넣습니다.
- 은 "카운터에서 셀"플러그인 (- "셀 카운터" "플러그인")을 엽니 다. "초기화"를 클릭하여 이미지 스택을로드합니다.
- 해당 상자에 체크하여 카운터의 적절한 유형을 선택합니다.
참고 : 전체 세포의 수와 세포질 초점과 셀 카운터로 2 형에 대한 카운터로 사용 1을 입력합니다. 모든 세포를 계산합니다. - "저장 마커"를 클릭하여 마커를 저장합니다.
- 세포질 초점 가진 세포의 수를 평가
- <리>는 형광 이미지 hyperstack (XZYT) ( "파일"- "열기"를)로드하고 "Z-프로젝터"(이미지 / 스택)를 사용하여 최대 강도 투사합니다.
- 은 "카운터에서 셀"플러그인을 엽니 다. "초기화"를 클릭하여 결과 이미지 스택 (XYT)를 넣습니다.
- "로드 마커"를 클릭하여 마커를로드합니다.
주의 : 기준 영상과 형광 스택의 파일 이름이 동일해야합니다. 필요한 경우, 이미지 스택을 초기화하기 전에 적절하게 이름을 바꿉니다. - 해당 마커 유형을 선택합니다 (3.1.3 참조) 세포질 초점으로 세포를 계산합니다. 기존의 마커는 각 셀의 위치에 대한 지침으로서 사용될 수있다.
- "결과"를 클릭하여 슬라이스 당 카운트의 수를 검색하고 추가 계산을 위해 다른 곳에서 수를 저장합니다.
Representative Results
상술 한 촬상 프로토콜 아메바 D. 응집하기 쉬운 형상의 프리온 단백질의 거동을 분석하는데 사용될 수있다 열 응력시 discoideum.도 1은 30 ° C (도 1b) 및 응력 회복 후 6 시간에서의 열 스트레스 2 시간 후 정상적인 성장 조건 (도 1A)하에 세포에서 GFP 표지 된 폴리 글루타민 단백질 Q103의 분포를 도시 정상적인 성장 조건 (그림 1C)에서 성장. 30 ° C에 23 ° C의 온도 상승시, Q103-GFP 마커 구조를 반점에 확산 분포 합체. 상온에서 스트레스 릴리스과 성장에 따라, 이러한 구조는 용해. Q103-GFP의 재분배 및 열 응력 - 유도 세포질 병소 형성 이미지 분석을 이용하여 정량화 할 수있다.도 2a는 피지 플러그인 "C를 사용하여 각각의 영상 범위의 분석을 도시엘 카운터 ".도 2b는 열 스트레스 반응의 정량화를 도시한다.이 계속 열 응력 수가 세포질 Q103-GFP의 초점은 증가. 열 스트레스 중에는 단백질 품질 관리 (PQC) 시스템 따라서 aggregation- 압도 것을 보여준다 이러한 프리온과 같은 단백질 Q103 같은 경향 단백질이 세포질 초점 점점 집계 가용성 상태로 유지 될 수 없다. 세포는 특징 라운딩 표시,도 1b에 도시 된 바와 같이. 응력 제거 후 세포질 병소의 감소 응집 제안 단백질 용해시킨다.
이미징 품질은 초기 셀 밀도에 민감하다. (3)도 적절한 초기 세포 밀도 (도 3A) 및 높은 초기 세포 밀도 (도 3b)을 비교하여, 응력 복구 후에 셀의 예를 도시한다. 초기 셀 밀도가 너무 높게 된 경우 셀 스타도 3b에 도시 된 바와 같이 테드 스트림을 형성한다. 세포와 이후의 정량화에 어려움을 부과하는이 초점면 밖으로 이동했다.
설명 된 방법은 전술 한 바와 같이 온도 - 유도 변화를 모니터링하는데 사용될 수있다. 또한,도 4. 생리적 성장 온도에서 묘화시 광 독성을 감소시키기 위해 사용되는 공기 조절 실에서 온도 제어없이 묘화 냉각 실 (도 4A)에서 23 ° C에서 묘화 셀과 셀 비교를 나타내고, 설정 될 수있다 25 ° C (그림 4B)에. 온도 제어 조건 묘화하지 않을 경우, 여기 광에 지속적으로 노출되면, 세포를 모아. 세포 모양의 변화는 스트레스를 나타내는한다.
그림 1 :
그림 2 : 열 유도 세포질 병소 형성의 정량 무료 이미지 프로세싱 패키지 피지 및 플러그인 "셀 카운터"를 사용하여 세포의 (A) 분석.. 세포의 총량 (유형 1, 블루 이의 마커)는 시야 화상으로 결정된다. 마커는 GFP 채널 및 결정 세포질의 초점과 세포 (제 2 형, 빨간색 카운터 마커)의 수에로드됩니다. (B) 초점의 정량 30 ° C에서 열 스트레스의 3 시간, 23 ° C에서 스트레스 복구의 3 시간 후. (N =보기, 오차 막대 = SD의 4 분야) 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림.
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그림 4 :. 광독성 효과에 온도 제어의 효과 (A) 세포는 23 ° C에서 온도 제어와 10 분 동안 몇 군데 (0.5 μM, 샘플 두께 8 μm의 간격)보기, Z-스택, 시간 경과의 6 분야 (총 시간이 10 분 경과 한 분), GFP 채널 (0.07 msec의 노출 시간, 10 %의 레이저 강도) RFP 채널 (0.1 msec의 노출 시간, 10 %의 레이저 강도). 세포는 광독성 스트레스와 관련된 특성 형태 학적 변화의 징후를 표시하지 않습니다. (B)는 전지 (A와 동일한 조건) 온도 제어없이 10 분 동안 묘화. 세포는 스트레스를 나타내는, 광독성 유도 라운딩의 증상을 나타낸다. 스케일 바는 10 μm의 =. 세포는 100X / 1.4의 개구 수 (NA)를 가진 대물 현미경에 기초하여 시스템에 묘화 하였다. 이미지는 1 × 1 비닝을 사용하여 1024 X 1024 픽셀 파일로서 CCD 카메라로 수집 하였다.4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜에 열 유도 응력에 응답하여 특정 관심 단백질의 거동을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 30 ° C까지 승온 열 스트레스 반응을 유발하는 것으로보고하고 D. 이러한 조건에서 생존 한 discoideum는 현저하게 감소된다.
수정
프로토콜은 동일한 응력 조건 하에서 다양한 단백질의 거동을 비교하기 위해 수정 될 수있다. 이를 위해, 같은 형광 태그와 다른 단백질을 발현하는 세포가 이러한 네 개의 챔버 접시 (섹션 1.3.1)로 다중 - 웰 접시에 옮기고있다. 프로토콜은 또한 GFP 또는 RFP 같은 다른 마커 단백질과 함께 공동 발현하는 세포에 적용 할 수있다. 이 단백질의 품질 관리 (PQC) 시스템의 다른 구성 요소의 동작을 모니터링하는 데, 예를 들어 수있다. GFP-태그 집계 마커 다른 RFP-태그 PCQ 성분을 발현하는 세포를 다중 웰을 사용하여 관찰 할 수있다이미징 걸려. 이것은 동일한 응력 조건 (온도 증가 / 감소, 온도 증가 / 감소 구간의 속도) 보장 및 비교 연구를 허용한다.
또한, 프로토콜은 열 스트레스 반응에 PQC 시스템의 영향을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 구성 요소의 활성은 이러한 녹아웃 또는 과발현 유전 도구를 사용하여 발현 수준을 변화시킴으로써 또는 시판 특정 억제제 (6)을 이용하여 변조 될 수있다. 프로 테아 좀은 성장 배지로 MG132 (100 μM) 또는 인 lactacystin (10 μM)를 첨가함으로써 억제 할 수있다. 샤프론의 Hsp90는 젤다 나 마이신 (6 μM) 또는 라디 (10 μM)를 사용하여 억제 할 수있다. 우리가 지금까지 우리의 실험 설정에서 억제 효능을 확인하지 수 있지만 보호자 인 Hsp70은 VER-155088으로 억제 할 수있다. 억제제 촬상 하루 전에 첨가되어야하고, 세포를 14 시간 동안 배양 하였다.
Criti 프로토콜 내 칼 단계
열 - 유도 교란의 평가를위한 중요한 단계 촬상 실험 이전의 셀의 상태이다. 효모의 연구는 세포가 정지상 (13) 동안 환경 스트레스의 다양한 저항을 얻을 것으로 나타났다. 우리는 또한 D. 경우 적용 열 스트레스에 최소한의 응답 성을 관찰 discoideum 세포는 이전의 이미지로 고정 단계에 도달했다. 따라서, 일정한 세포 수를 유지 <5 × 105 세포 / ㎖가 중요하다.
또한, 높은 셀 번호 D. 식물의 사이클에서 천이를 유도 할 수있다 따라서 스트레스를 가열하는 다른 반응으로 이어질 수 있습니다 기아 경로를, 트리거, 발달주기에 discoideum. 높은 세포 수는 열 스트레스 스트리밍 후의 회복 단계에 도달하고 전지가 초점 이동 응집 세포 데이터 분석을 방해 할 수있는 경우 (도 4 참조).
콘텐츠 ">는 기술의 한계포커스의 손실은 프로토콜의 병목 현상이다. 온도 변화 동안, 초점면은 즉시 온도를 변경 한 후 시간에 재 집속 설명서를 요구하는 대폭 전환 할 수있다. 포커스의 점프 때때로 시점 사이의 시간이 높고, 특히, 소프트웨어의 오토 포커스에 의해 극복하기에는 너무 극단적 일 수있다. 사용한 현미경 하드웨어 자동 초점이 장착되는 경우,이 병목 현상이 회피 될 수있다.
기존 방법에 대하여 기술의 중요성
이러한 에어컨 방, 목적 및 현미경 스테이지 또는 온도 제어 단계와 대물 옷깃을 덮는 온도 제어 배양 상자의 사용과 같은 기존의 셋업에 비하여, 냉각 실의 사용은 주위의보다 정확한 제어를 제공한다 온도. 냉각 실의 펠티에 소자는 일정하고 균일 한 템을 유지할 수 있습니다실험 설정을 통해 가능한 온도. 고전적인 설정에서, 지역의 온도 차이는 서로 다른 관측 결과로 이어질 수 있습니다. 고전 셋업 특히 강온 유도 온도 변화에 매우 느리게 적응하면서 또한, 온도에 의한 변화에 신속하고 빠르게 응답 할 수있다. 냉각 실의 펠티에 소자는 또한 15 ° C, 40 ° C로서 도달 온도가 매우 어렵다되는 고전 설정보다 더 넓은 온도 범위 (15 ~ 40 °의 C)을 커버 할 수있다.
Dictyostelium의 discoideum은 사진 독성에 특히 민감하다. 이전의 연구는 광 독성을 감소 소제로서 아스코르브 산을 사용했다. 그러나, 긴 촬영 기간이 추가 보완이 필요합니다. 또, 아스코르브 산의 사용이 주목기구는 항산화 보조 식품에 의해 영향을받지 않는다 연구에 제한된다. 우리는 온도 제어 이미징 appr 대안으로 사용될 수 제안oach는 광 독성을 최소화하고 더 독성을 감소 아스코르브 산의 첨가와 조합 될 수있다.
광독성 효과는 냉각 실을 사용하여 23 ° C의 일정하고 균일 한 온도를 제공함으로써 최소화 될 수있다. 온도 조절 장치를 이용하여 묘화 셀들은 긴 시간 동안 광 독성, 휴대 라운딩 적은 징후를 나타낸다. 이것은 또한 높은 강도, 작은 시간 간격 또는 뷰 (영상 범위)의 더 필드 이미징을 할 수 있습니다.
일반 응용 프로그램
고온에서 열 스트레스가 다른 열 스트레스 반응 (14)을 트리거하기 위해 도시되었다. 따라서, 34 ℃ 이상 37 ℃로 온도를 증가시키는 것은 다른 반응을 유도 할 수있다. 적용된 온도 응력에 더하여, 특정 응력 상태의 지속 기간은 열 응력 즉각적인 응답 또는 장기 적응 학습하도록 변형 될 수있다.
일반적으로, 설명 된 프로토콜이 될 수있다응용 프로그램의 다양한 세트로 확대했다. 정확한 온도 제어는 상당히 광 독성을 감소시키기 때문에, 프로토콜은, 또는 짧은 시간 간격과 함께 낮은 발현 수준으로 단백질을 가시화 등 높은 노출 시간 및 / 또는 더 높은 여기 광 강도를 요구 설정에 사용될 수있다 시간 경과 이미징 동안 이미징, 예를 들어, 사이. 또한 전체 셀에 걸쳐 물체를 이미징하는 것이 유리할 수있다, 예를 들어, 미세 소관, 이러한 설정은 광학 Z 섹션 높은 번호를 필요로.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
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