Introduction
Dictyostelium discoideum er enslig jord levende amøber som lever av bakterier og andre mikroorganismer, som er tatt opp av fagocytose. Den har en unik og bemerkelsesverdig livssyklus som har vært et viktig område for forskning siden den ble oppdaget en. Den tidlige interesse for flercellet utvikling 2 og molekylære grunnlaget for chemotaxis tre ble snart supplert med studier som fokuserer på cellemotilitet, celle polaritet, medfødt immunitet. I tillegg D. discoideum ble innført som et modellsystem for biomedisinsk forskning 4,5.
Nylig etablerte vi D. discoideum som et nytt system for å studere proteinet kvalitetskontroll (PQC) systemet 6,7. Dens proteom er beriket i aggregering utsatte prion-lignende proteiner, som er en utfordring for protein kvalitetskontroll 8. For å undersøke om D. discoideum har utviklet spesielle molekylære mekanismer for å kontrollere den svært agforsamlingen utsatt proteom- studerte vi oppførselen til aggregering utsatt for markørproteiner både under normale vekstbetingelser og under stress. Spenningstilstander, for eksempel varmebelastning, kan brukes til å øke frekvensen av proteinet misfolding 9. Derfor søkte vi et system hvor vi kan indusere temperaturendringer og samtidig følge oppførselen til markørproteiner. For dette formålet, kombinert vi levende celle bildebehandling med Peltier-kontrollert oppvarming ved hjelp av en varmetrinn innsats (kjølekammer). Denne metoden tillot oss å opprettholde en konstant og jevn temperatur, så vel som å indusere en hurtig, men likevel nøyaktig temperaturendringer.
Levende celle avbildning blir brukt til å studere en rekke biologiske prosesser i D. discoideum. Men denne tilnærmingen står overfor to hovedbegrensninger. Først cellene viser en høy motilitet og har en tendens til å migrere ut av betraktningsfeltet, således sporing av individuelle celler krever ofte avbildning av et stort område. Cellen mobilitet kanreduseres med Agar overlegg 10, men disse forholdene er ikke egnet for langsiktig bildebehandling på grunn av en nedgang i levedyktighet. Sekund, D. discoideum celler viser en særlig høy følsomhet for fototoksisitet, noe som resulterer i celleavrunding og mitotisk stopp 11. Tidligere protokoller løst problemet ved tilsetting av askorbat som en radikaler og reduksjon av eksponering ganger 12. Sistnevnte kan være kritisk dersom proteinet av interesse er uttrykt på lave nivåer og viser en svak fluorescens signal. Forfatterne foreslår også å gi en konstant temperatur på 21 ° C, enten ved bildebehandling i en luftkondisjonerte rom eller ved hjelp av temperaturkontrollerte ruge bokser, som dekker mål og mikroskop scenen 12.
Her beskriver vi en fremgangsmåte med forbedret temperaturkontroll ved hjelp av et kjølekammer innstilt ved 23 ° C. Under bildebehandling vår set-up øker betydelig motstand mot foto-toksisitet. Dentillater bruk av høyere eksponeringstider og høyere eksitasjon lysintensitet. Dette er av særlig viktighet i løpet av time-lapse avbildning, som de tidsintervaller som må være nøye balansert mot antall posisjoner avbildes og eksponeringstiden som brukes. Muligheten for å øke antall avbildes stillinger gjør det også mulig dekning av en større bildeområdet og muliggjør sporing av individuelle celler i løpet av en lengre tidsperiode.
Protocol
1. Cell Forberedelse
- voksende celler
- Grow D. discoideum celler i AX-medium ved 23 ° C under lys i vevskulturplater. Unngå å holde cellene ved høye tettheter over 75% konfluens.
NB: For optimal effekt av varmestress, cellene trenger å være i den eksponensielle vekstfasen, og bør ikke ha nådd stasjonær fase. - Dagen før bildebehandling, dele celler i lav fluorescens medium (LFM) til 1 x 10 4 celler / ml.
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å redusere bakgrunns fluorescens forårsaket av AX medium. Inkubasjonstiden kan reduseres til et minimum på 2 timer. Imidlertid kan vesikler tatt opp i AX medium fortsatt generere noen bakgrunnssignal etter to timer.
- Grow D. discoideum celler i AX-medium ved 23 ° C under lys i vevskulturplater. Unngå å holde cellene ved høye tettheter over 75% konfluens.
- Forbereder celler for mikroskopi
- Før avbildning, høste celler fra vev platen i LFM og overføre et tilstrekkelig antall celler i glassbunn retter.
MERK: Vanligvis1 x 10 5 celler / er ml tilstrekkelig; imidlertid, hvis det eksperimentelle oppsett krever lange perioder avbildnings (lengre enn 8 timer) celle nummer må justeres nøye, som D. discoideum celler vil overgangen til utviklingssyklusen og begynne å streame og aggregat hvis celle tall er høy mens næringsstoffer er lavt. - La cellene til å betale for 20 min. Fjern ikke-bosatte celler ved nøye erstatte brukte medium med frisk medium.
- Før avbildning, høste celler fra vev platen i LFM og overføre et tilstrekkelig antall celler i glassbunn retter.
2. Imaging
MERK: Protokollen kan brukes på vidvinkel systemer samt i konfokalmikroskopi oppsett. Bruken av et temperaturkontrollert inkubasjon boksen dekker målene og mikroskopet scenen er nyttig, men ikke avgjørende for temperaturkontroll. Temperaturen av inkubasjonen boksen er satt til den høyeste temperatur som brukes i eksperimentet, for eksempel til 40 ° C hvis varmestress blir utført. Hvis ikke, blir temperaturen satt til 256 C. Temperaturendringer bør gjøres på forhånd slik at systemet til å tilpasse seg, som endringer i temperatur under bildebehandling kan påvirke fokus.
MERK: Under avbildning blir temperaturen styres ved hjelp av et kjølekammer. Standard temperatur for avbilding av ikke-stresset-celler er 23 ° C. For varmestressbetingelser blir temperaturen økes tilsvarende til det ønskede nivå. Den piezo-elementet i kjølekammeret kan reagere meget raskt til temperaturforandringen. Imidlertid vil fokus av bildene endres litt (det kan avvike opp til 20 mikrometer, avhengig av temperaturen skift). Dermed manuell omstilling er nødvendig i løpet av de første minuttene av bildeopptak, med mindre brukt mikroskop er utstyrt med en hardware autofokus.
- Image oppkjøpet under ikke-stressede forhold
- Bilde celler under ikke-stresset forholdene ved 23 ° C, erverve minimum 6 synsfelt (FOVs).
MERK: Ikke-spenningstilstand kan være visualized enten ved å spille inn en kort time-lapse (5-30 min) eller oppkjøp av representative stillbilder. For hver tilstand eller cellelinje erverve et minimum 6 synsfelt (FOVs).
NB: I tilfelle individuelle celler er av interesse ved å plassere de respektive cellene i midten av FOV og registrere en 3 x 3 flis serie med den FOV som inneholder celler av interesse i midten D.. discoideum celler er bevegelige og kan migrere ut av FOV. Imidlertid øker den 3 x 3 flis serie området potensielt utforsket av cellen av interesse og det gjenstår spor for intervallperioder ~ 6 timer. - Erverve z-stabler med maksimalt 7 pm i 1-0.25 um trinn for å fange opp hele volumet av cellen.
- Erverve en referanse lysfelt-bilde for å vurdere det totale antall celler.
- Bilde celler under ikke-stresset forholdene ved 23 ° C, erverve minimum 6 synsfelt (FOVs).
- Bilde oppkjøp for varmestress
- Juster temperaturen i kjølekammeret til 30 ° C i henhold til produsentens instruksjoner. </ Li>
- Etter temperaturdisplayet har nådd ønsket verdi, refokusere manuelt i den lyse feltet kanal og kontrollere alle innspilte FOVs før du starter time-lapse.
- Starter en tidsforsinkelse i 4 timer for varmestress med et tidsintervall på 5-10 min mellom tidspunktene. Kontroller korrekt fokusering under kjøpet av de to første tidspunkter.
- Image oppkjøpet under utvinning
- Etter varme stress, redusere temperaturen tilbake til 23 ° C, vent til temperaturdisplayet for å justere og refokusere manuelt.
- Rekord time-lapse filmer i restitusjonsfasen etter 8-10 timer i 10-20 min tidsintervaller. Kontroller korrekt fokusering under oppkjøpet av det første tidspunktet.
3. Bildeanalyse
NB: For å kvantifisere antallet celler som cytosolisk foci, vurdere det totale antall celler og antall celler med cytosolisk foci i hver gangramme. På grunn av vanskeligheten med å segmentere celler fra lyse felt bilder, må kvantifisering må gjøres manuelt. I det følgende er dataanalyse beskrevet for gratis bildebehandling pakken ((http://fiji.sc/Fiji). Det krever plugin "celleteller" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Vurdering av totalt antall celler
- Legg den lyse feltet bildestakk (XYT) ved å klikke på "File" og "Open".
- Åpne "celleteller" plugin ( "Plugins" - "Cell Counter"). Laste bildet stabelen ved å klikke på "Initialize".
- Velg riktig type tellere ved å krysse av i den aktuelle boksen.
MERK: Bruk type 1 som teller for total antall celler og type 2 som teller for celler med cytosolic foci. Tell alle cellene. - Redd markører ved å klikke på "Lagre Markers".
- Vurdere antall celler med cytosolic foci
- <li> Last inn fluorescens bilde hyperstack (XZYT) ( "File" - "Open") og gjøre en maksimal intensitet projeksjon bruke "Z-projektoren" (Bilde / Stacks).
- Åpne "celleteller" plugin. Legg den resulterende bildestakk (XYT) ved å klikke på "Initialize".
- Last markørene ved å klikke på «Last Markers".
FORSIKTIG: filnavnene på referansebildet og fluorescens bunken må være identiske. Om nødvendig, endre navn på tilsvarende før initialisering bildet stabelen. - Velg riktig markør type (se 3.1.3) og telle celler med cytosolic foci. De eksisterende markører kan brukes som veiledning for plassering av individuelle celler.
- Hent antall tellinger per skive ved å klikke på "Resultater" og lagre teller andre steder for videre beregninger.
Representative Results
Den beskrevne avbildningsprotokollen kan anvendes for å analysere oppførselen til aggregering utsatte prion-lignende proteiner i amøbe D. discoideum under varmebelastning. Figur 1 viser fordelingen av GFP-merket polyglutamine protein Q103 i celler under vanlige vekstbetingelser (figur 1A), etter 2 timers varmestress ved 30 ° C (figur 1B), og etter 6 timer med spenning utvinning og vekst ved normale vekstforhold (figur 1C). Ved en temperaturøkning fra 23 ° C til 30 ° C, coalesces den Q103-GFP markør fra en diffus fordeling til punktformet strukturer. Ved spenningsavlastning og vekst ved normal temperatur, er disse strukturene oppløses. Omfordeling av Q103-GFP og dannelse av varme stress-indusert cytosolic foci kan kvantifiseres ved hjelp av bildeanalyse. Figur 2A viser analysen av enkelt FOVs hjelp Fiji og plugin "Cell counter ". Figur 2B viser kvantifisering av varmen stressrespons. Dette viser at cytosoliske Q103-GFP foci økning i antall med fortsatt varmestress. Under varmestress, er overveldet, og dermed aggregation- protein kvalitetskontroll (PQC) system utsatt proteiner som prion-lignende protein Q103 ikke kan opprettholdes i en oppløselig tilstand og i økende grad aggregat i cytosol foci. cellene viser også en karakteristisk runding, som vist i figur 1B. reduksjonen av cytosolisk foci etter stressfjernelse antyder at den aggregerte proteiner er oppløst.
Den bildekvalitet er følsom for den opprinnelige celletetthet. Figur 3 viser et eksempel på celler etter belastning bedring, sammenligner passende initial celletetthet (figur 3A) og høy initial celletetthet (figur 3B). Dersom den initielle celletettheten var for høy, celler stjerneted for å danne strømmer som vist i figur 3b. Denne som medfører vanskeligheter på den etterfølgende kvantifiseringen som cellene har beveget seg ut av brennplanet.
Den beskrevne fremgangsmåte kan brukes til å overvåke temperaturinduserte endringer som er beskrevet ovenfor. Den kan også brukes til å redusere bilde-toksisitet når avbildning ved fysiologisk veksttemperatur. Figur 4 viser en sammenligning av celle avbildes ved 23 ° C i et kjølekammer (figur 4A) og celler som avbildes uten temperaturkontroll i en luftkondisjonerte rom, sett til 25 ° C (figur 4B). Ved konstant eksponering for eksitasjonslyset, cellene runde opp når den ikke er avbildet ved temperaturkontrollerte forhold. Denne endringen i celleform indikerer stress.
Figur 1:
Figur 2: Kvantifisering av varme-indusert cytosolic foci dannelse (A) Analyse av celler ved hjelp av gratis bildebehandlings pakke Fiji og plugin "celleteller".. Den totale mengden av celler (type 1, blå benke markører) bestemmes i den lyse felt bilde. Markørene er lastet inn på GFP-kanalen og antall celler med cytosolisk foci (type 2, røde benke markører) bestemmes. (B) Kvantifisering av brennpunkter etter tre timer for varmestress ved 30 ° C og 3 timer med stress gjenoppretting ved 23 ° C (n = 4 synsfelt, error bar = SD). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
.jpg "/>
Fig. 4: Virkning av temperaturkontroll på fototoksiske effekter (A) Celler avbildes i 10 minutter med temperaturkontroll ved 23 ° C: 6 synsfelt, z-stabel (avstand 0,5 uM, prøvens tykkelse 8 mm), tidsforløp (total tid 10 min, forløp 1 min), GFP kanal (0,07 msek eksponeringstid, 10% laser intensitet), RFP kanal (0,1 msek eksponeringstid, 10% laserintensitet). Celler viser ingen tegn til de karakteristiske morfologiske endringer knyttet fototoksisk stress. (B) Celler avbildes i 10 minutter uten temperaturkontroll (samme betingelser som i A). Celler viser tegn på fototoksisk indusert avrunding, noe som indikerer stress. Scale bar = 10 mikrometer. Cellene ble fotografert med et system basert på et mikroskop med en 100x / 1,4 numerisk apertur (NA) objektiv. Bildene ble tatt med en CCD-kamera som 1024 x 1024 pixel filer ved hjelp av 1 x 1 binning.4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen er beskrevet her kan brukes til å studere oppførselen til et bestemt protein av interesse som respons på varmeinduserte stress. Temperaturøkning til 30 ° C er rapportert å utløse varmestressrespons og under disse betingelser levedyktighet av D. discoideum reduseres markert.
modifikasjoner
Protokollen kan modifiseres for å sammenligne adferden til andre proteiner under de samme stressbetingelser. For dette er celler som uttrykker ulike proteiner med samme fluoriserende tag overført til multi-brønn retter, for eksempel fire kammer retter (seksjon 1.3.1). Protokollen kan også anvendes på celler ko-uttrykker proteiner med forskjellige markører, slik som GFP eller RFP. Dette kan for eksempel brukes til å overvåke oppførselen til forskjellige komponenter i protein kvalitetskontroll (PQC) system. Celler som uttrykker GFP-merket aggregering markør og ulike RFP-merket PCQ komponenter kan observeres ved hjelp av multi-brønndisket for bildebehandling. Dette gir de samme spenningsforholdene (hastighet for temperaturøkning / reduksjon, varighet av temperaturøkningen / reduksjon) og gjør det mulig for komparative studier.
Videre kan protokollen brukes til å studere innvirkningen av PQC systemet på varmestressrespons. Aktiviteten av komponentene kan moduleres ved å forandre ekspresjonsnivåer ved hjelp av genetiske verktøy som knock-out eller overekspresjon eller ved å bruke kommersielt tilgjengelige spesifikke inhibitorer 6. Proteasomet kan bli inhibert ved tilsetning av MG132 (100 uM) eller laktacystin (10 pM) til vekstmediet. Den anstand HSP90 kan hemmes ved bruk geldanamycin (6 mm) eller radicicol (10 mm). Den anstand Hsp70 kan hemmes med VER-155 088, selv om vi ikke kunne bekrefte effekten av hemming i våre eksperimentelle innstillinger så langt. Inhibitorer bør legges en dag før avbilding og cellene blir inkubert i 14 timer.
Criti cal trinn i protokollen
Den kritiske trinn for vurdering av varme-indusert forstyrrelse er staten av cellene før bildebehandling eksperimentet. Studier i gjær viste at celler som utvikler resistens mot en rekke miljømessige påkjenninger under stasjonær fase 13. Vi har også observert minimal respons til anvendt varme stress hvis D. discoideum celler hadde nådd stasjonær fase før bildebehandling. Derfor er å opprettholde en konstant celletall <5 x 10 5 celler / ml kritisk.
Videre kan høy celleantall indusere overgang fra den vegetative syklus av D. discoideum til utviklingssyklus, og dermed utløser sult veier, som kan føre til en forskjellig respons på varmestress. Dersom høyt celleantall er nådd i restitusjonsfasen etter varmestress, streaming og samles cellene kan forstyrre dataanalyse som cellene beveger seg ut av fokus (se figur 4).
innhold "> Begrensning av TechniqueTapet av fokus er flaskehalsen av protokollen. Under temperaturendringer, kan fokusplanet skifte drastisk, noe som krever manuell omstilling i en tidsperiode umiddelbart etter endring av temperatur. Hoppet i fokus kan noen ganger være for ekstrem til å bli overvunnet av programvare autofokus, spesielt hvis tiden mellom tidspunktene er høy. Men hvis det brukes mikroskop utstyrt med en maskinvareautofokus, denne flaskehalsen kan omgås.
Betydningen av teknikken i forhold til eksisterende metoder
Sammenlignet med eksisterende oppsett som bruk av rom med klimaanlegg, temperaturkontrollert ruge bokser som dekker målene og mikroskop scene eller temperaturkontrollerte etapper og objektive krager, bruk av et kjølekammer gir en mer presis styring av omgivelses temperatur. Peltier-elementet i kjølekammeret kan opprettholde en konstant og jevn temratur gjennom hele forsøksoppsettet. I klassisk oppsett, kan lokale temperaturforskjeller fører til forskjellige observasjons utfall. Videre kan det reagere raskt og hurtig til induserte endringer i temperatur, mens klassiske oppsett tilpasse seg meget langsomt for å induserte temperaturendringer, særlig senke temperaturen. Peltier-elementet i kjølekammeret kan også dekke et bredere temperaturområde (15-40 ° C) enn klassiske oppsett, som strekker temperaturer slik som 15 ° C eller 40 ° C er meget vanskelig.
Dictyostelium discoideum er spesielt følsomme for foto-toksisitet. Tidligere studier brukes askorbat som gatefeier å redusere foto-toksisitet. Men lange bilde perioder trenger ekstra tilskudd. Dessuten er bruken av askorbat begrenset til undersøkelser hvor mekanismen av interesse ikke påvirkes av antioksidant supplement. Vi foreslår at temperaturkontrollert avbildning kan brukes som et alternativ ca.oach å minimalisere fototoksisitet og kan være kombinert med tilsetning av askorbat for ytterligere å redusere toksisitet.
Fototoksiske effekter kan minimaliseres ved å tilveiebringe en konstant og ensartet temperatur på 23 ° C ved hjelp av et kjølekammer. Celler avbildes med temperaturkontroll viser færre tegn på foto-toksisitet, slik celle avrunding, for en lengre tidsperiode. Dette gjør også bildebehandling med høyere intensitet, mindre tidsintervaller eller flere synsfelt (FOVs).
allmenngjørings
Varmebelastning ved høyere temperaturer har vist seg å utløse en annen varmestressrespons 14. Derfor øker temperaturen til 34 ° C eller 37 ° C kan forårsake en forskjellig respons. I tillegg til den anvendte temperatur stress, kan varigheten av en bestemt spenning situasjon modifiseres for å studere den umiddelbare responsen eller langvarig tilpasning til varmestress.
Generelt kan den beskrevne protokollen bliutvidet til et bredt sett av anvendelser. Fordi den nøyaktige temperaturkontrollen i betydelig grad reduserer foto-toksiske effekter, kan protokollen som brukes i miljøer som krever høye eksponeringstider og / eller høyere eksiteringsfrekvenser lysintensiteter, for eksempel for visualisering av proteinene med et lavt ekspresjonsnivå, eller i kombinasjon med korte tidsintervaller mellom bildebehandling, for eksempel i løpet av time-lapse imaging. Det kan også være fordelaktig for å avbilde objekter som strekker seg over hele cellen, for eksempel, mikrotubuli, da disse innstillinger krever et høyt antall optiske z-seksjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M.
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K.
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S.
