Um método baseado em flutuabilidade da determinação dos níveis de gordura no<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Aqui apresentamos um método para medir os níveis de gordura organismais no terceiro estádio (L3) fase larval de Drosophila melanogaster. Este método explora a relativamente baixa densidade de tecido adiposo para diferenciar entre as larvas com reservas de gordura alterados. A análise à base de empuxo é uma valiosa ferramenta para a triagem rápida, reprodutível e econômico.

Resumo

Drosophila melanogaster é um sistema experimental chave no estudo da regulação da gordura. Atualmente, existem inúmeras técnicas para medir os níveis de gordura armazenada em Drosophila, mas a maioria é cara e / ou trabalhosa e tem limitações claras. Aqui, apresentamos um método para determinar de forma rápida e barata os níveis de gordura do organismo em larvas de Drosophila L3. A técnica baseia-se nas diferenças de densidade entre tecidos gordurosos e magros e permite a detecção rápida de fenótipos gordurosos e magros. Verificamos a acurácia desse método por comparação com o percentual de gordura corporal determinado por extração lipídica neutra e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS). Além disso, descrevemos protocolos detalhados para a coleta e sincronização de larvas, bem como receitas experimentais relevantes. A técnica apresentada abaixo supera as principais deficiências nos métodos de quantificação de lipídios mais amplamente utilizados e fornece uma maneira poderosa de rastrear larvas L3 de forma rápida e sensível para fenótipos de regulação de gordura, mantendo a integridade das larvas. Este ensaio tem amplas aplicações para o estudo do metabolismo e regulação da gordura usando Drosophila.

Introdução

Drosophila melanogaster tem sido usado por mais de um século no estudo da genética e outras questões biológicas básicas. Nas últimas décadas, tem-se tornado claro que a Drosophila é uma ferramenta poderosa para o estudo de muitas doenças humanas. Como 70 - 80% de genes associados a doenças humanas têm uma mosca ortólogo identificado ^1-4, um sistema de Drosophila fornece ainda traduzível simplificado em que para estudar doenças complexas. Metabolismo, em particular, beneficiou de tal estudo. Não só são os genética do metabolismo bem conservadas entre moscas e seres humanos, mas os órgãos e tipos de células relevantes são também muito semelhantes ^2,5. Por exemplo, o corpo de gordura das lojas da mosca ambos triacilglicerídeos (TAG) e de glicogênio, funções análogas às realizadas no fígado de mamíferos e adiposo branco tecido ^6. Usando Drosophila como modelo para a obesidade humana melhorou muito a nossa compreensão dos lípidosmetabolismo e a genética da obesidade ^7. A fase larval de desenvolvimento é particularmente útil para o estudo da segregação de nutrientes para o armazenamento ou utilização, uma vez que é dedicado a alimentação e o armazenamento de energia para ser usado durante pupariation.

Atualmente, existem muitos métodos quantitativos diferentes de determinar os níveis de armazenamento de gordura em Drosophila. O método mais amplamente utilizado é o ensaio colorimétrico acoplado (CCA) ^8,9. CCA foi desenvolvido para determinar os níveis no soro humano TAG e opera-se na premissa de que o glicerol libertado a partir da espinha dorsal de triglicéridos vai passar por várias reacções, resultando numa reacção de acoplamento de redox gerar um produto colorido. Absorbância de comprimentos de onda específicos da luz é então medido para determinar a quantidade inicial de glicerol presente. No entanto, o glicerol pode também ser libertada da mono e diacilglic�idos além de TAG e, portanto, pode não ser uma medida precisa da stored gordura corporal ^9. Além disso, o pigmento do olho de moscas adultas esmagadas podem interferir com algumas leituras de absorbância e complicar resultados ^9,10. Portanto, a CCA deve ser acompanhado e validado por cromatografia em camada fina (TLC), que permite a separação da maior parte das famílias de lípidos que podem ser quantificados por densitometria ^10,11. Contudo, algumas classes de lípidos como os esteróis não podem ser analisadas e deve ser quantificado de forma diferente ^12. Espectrometria de massa (MS) é uma maneira precisa para quantificar todas as classes principais de lípidos celulares ^12,13. No entanto, os processos de extracção de lípidos necessários para analisar por MS são tanto demorado (mais levando quase completo de um dia) e dispendioso. Aqui apresentamos um método alternativo para determinar rápida e barata níveis do organismo de gordura nas larvas L3 de Drosophila melanogaster.

O método apresentado a seguir explora a diferença de densidade entre o tecido gordo e de tecido magro. fa MammalianT tecido tem uma densidade de aproximadamente 0,9 g / mL, enquanto ¹⁴ músculo esquelético como uma densidade de 1,06 g / mL de ^15. Esta diferença significa que os animais com lojas mais elevados de gordura terá densidade mais baixa do que os animais com lojas mais baixos de gordura, o que permitirá que eles flutuem melhor numa solução de densidade fixa. Esta propriedade permite a triagem extremamente rápido de um grande número de animais, enquanto sendo tanto barato e não-invasiva. Análise à base de flutuabilidade foi usado tanto para confirmar os fenótipos de alterar reguladores conhecidos de níveis de gordura, bem como para identificar novos reguladores genéticos neurológicos e da obesidade ^16,17.

Protocolo

1. recolher os ovos das moscas com genótipos de interesse

NOTA: cruzes Ideal consistem de 150 moscas virgens e, pelo menos, 75 do sexo masculino. colecções de material deve ser composto de pelo menos 200 moscas.

1. Prepare placas de uva.
   1. Adicionar 37,5 g de agar a 1,5 L de água destilada num balão de 4 L.
   2. Autoclave mistura agar / água durante 50 minutos a 121 ° C (250 ° F).
   3. Enquanto a água / mistura de ágar é autoclave, adicionar 50 g de sacarose e 500 ml de sumo de uva e agita-se com uma barra de agitação numa placa de agitação aquecida até que a sucrose é dissolvido.
   4. Desligue o fogo e continue mexendo para esfriar a mistura de suco de uva / sacarose para abaixo de 70 ºC. Teste a temperatura interna com um termómetro de álcool.
   5. Adicionar 3 g de Drosophila agente anti-fúngicos (por exemplo, Tegosept) para aquecer o sumo de uva mistura / sacarose e agitar para dissolver.
   6. Quando a água / mistura de ágar está fora da autoclave, permitir que o balão arrefecer ao toque agitando ocasionalmente.
   7. Combinar / mistura de ágar água e suco de uva mistura / sacarose e mexa até ficar bem misturado.
   8. Usar uma pipeta serológica para adicionar 8 - 10 ml da mistura de uva para a tampa de uma pequena placa de petri (estilo 35 x 10 mm). Permitir que a mistura para coroar maior do que a altura das paredes da tampa para formar uma forma convexa.
   9. Permitir placas de uva arrefecer durante 2 horas à temperatura ambiente e, em seguida, armazenar em um recipiente hermético a 4 ºC.
2. Prepare pasta de levedura.
   1. Adicionar 6 ml de solução tampão de fosfato (PBS) a 4 g de fermento seco activo vivo em um tubo de 50 ml e misturar com uma espátula até ficar liso.
   2. levedura loja colar a 4 ºC.
3. Adicionar uma pequena dose (cerca de 1/8 colher de chá) de pasta de levedura para o meio de uma placa de uva. Alisar quaisquer arestas com uma espátula.
4. Coloque placas de uva em uma incubadora até que tenham atingido a temperatura ambiente.
5. Transferir moscas de interesse em uma placa da câmara de coleta de ovos e local de uva wpasta de levedura om virada para dentro na parte superior. Tape placa de uva para a câmara de coleta de ovos para evitar que a placa cair. Certifique-se de escrever informações importantes sobre o genótipo e data na parte inferior da placa de uva.
6. Derrubar a câmara de coleta de ovos para permitir que as moscas colocar ovos na placa de uva.
7. Coloque uma caixa ou cobertura sobre as câmaras de coleta de ovos e colocá-los em uma incubadora a 25 ºC.
8. Permitir moscas colocar ovos para 4-6 hr.
9. Terminar a recolha, tendo a placa de uva para fora da câmara de coleta de ovos e transferir as moscas de volta para a sua garrafa de alimentos. Use uma espátula para limpar qualquer pasta levedura excesso da placa de uva. Loja placa de uva em um prato maior petri em uma incubadora umidificada a 25 ºC durante ~ 24 h.

2. Transferência de larvas para Experimental Food

1. Preparar alimentos experimental.
   NOTA: Esta receita de alimentos baseia-se no estoque Bloomington receita center ^18. mudanças importantesincluem a quantidade de levedura para optimizar o valor nutritivo dos alimentos aumentou como avaliado pela temporização de vagar fase (entre 112-120 horas após a recolha de ovos a 25 ° C). Embora tenhamos encontrado esta receita ideal para a saúde e desenvolvimento da nossa larvas experimental, qualquer receita comida é dada calibração aceitável com controlos positivos e negativos, cujos exemplos estão listados na etapa 3.10.
   1. Meça 1.600 ml de água destilada.
   2. Misturar 134 g de farinha de milho, 10,6 g de Drosophila Agar de Tipo II, e uma parte da água (~ 500 ml) numa proveta de 1 L. Misturar durante 2 minutos com um misturador da mão motorizado.
   3. Misturar 70 g vivo de levedura activa seca, 18,4 g de farinha de soja, 84,8 g de extracto de malte, e uma parte da água (~ 500 ml) em 1 L de outra proveta. Misturar durante 2 minutos com um misturador da mão motorizado.
   4. Redemoinho cada copo e despeje em um frasco de 4 L. Use água restante para lavar os copos e adicione para o balão.
   5. Medir 140 ml de xarope de milho claro e adicionar ao frasco, misture agitando.
   6. Autoclave durante 50 min a 121 ° C (250 ° F) no ambiente líquido.
   7. Após autoclavagem, despeje comida em um 4 L copo e deixe esfriar. Ajudar o processo de resfriamento através de mistura com um misturador da mão motorizado.
   8. Depois do arrefecimento do balão suficiente para tocar, adicionar 8,8 ml de ácido propiônico e 16,8 ml de solução de agente / etanol Drosophila anti-fúngicos. Misture bem. (Adicione solução de agente de Drosophila anti-fúngicos, adicionando 380 g Drosophila agente anti-fúngico a 1 L 200 etanol de prova e mexendo em uma placa quente até dissolver, certificando-se a solução não exceda 70 ºC.)
   9. Pour alimentos em frascos até que o alimento é de aproximadamente 1 polegada de profundidade e deixa-se arrefecer à TA, durante 2-3 h. Ligue frascos e armazenar em uma incubadora a 25 ºC. Use dentro de uma semana.
2. Mergulhar uma espátula várias vezes para a camada de topo do frasco de alimento a nota. Isso vai ajudar as larvas de toca e alimentar.
3. 22-24 horas após a coleta de ovos temended, use um pincel pequeno para recolher 50 primeiro instar larvas (L1) do mesmo tamanho aproximado. Coloque as larvas no alimento experimental. Limpe o pincel em um laboratório de limpeza e garantir que não há nenhuma larva restante no pincel antes de continuar para outro genótipo.
4. Coloque frasco de larvas numa incubadora a 25 ° C e deixa-se desenvolver.

3. Determinar os níveis de gordura em larvas

1. Preparar soluções.
   1. Prepare 1 L de 10x estoque PBS.
      1. Adicionar 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, e 2,4 g _de KH ₂ PO ₄ a 800 ml de água num copo de 2 L contendo uma barra de agitação. Mexa com nenhum calor até que todos os sais são incorporados. Traga o pH a 7,4. Aumenta o volume a 1 litro com água.
   2. Preparar 2 L de PBS 1x. Adicionar 200 ml de solução 10x estoque PBS a 1.800 ml de água.
   3. Utilize este estoque de 1x PBS para fazer 20% w / v de sacarose.
2. Retire o frasco de larvas doincubadora uma vez lá são 20 - 40 larvas andando até as laterais do frasco (geralmente no quinto dia após a coleções de ovos). Gravar a data e o tempo do ensaio, bem como o número de larvas errante.
3. Preparar a solução experimental por adição de 11,5 ml de PBS e 9 ml de sacarose a 20% a um tubo de 50 ml.
4. Adicionar 20% de sacarose para o frasco até que seja 0,5-1 polegada a partir do topo do frasco.
5. Use uma espátula para mexa delicadamente até a camada superior de alimento para as larvas livres que ainda estão escavando no alimento. Todas as larvas vão subir até a superfície da solução de sacarose.
6. Utilize uma pinça para gentilmente transferir as larvas para a concentração inicial de sacarose a partir do passo 3.3.
7. Usar uma espátula para agitar suavemente as larvas nesta solução.
8. Tapar o tubo cónico e upend várias vezes para misturar bem a solução.
9. Destape o tubo cônico e agite para criar um vórtice suave.
10. Permitir que as larvas de resolver, ou flutuar para o topo a solução ou SiNKing para a parte inferior. Espere 2-5 min para as larvas para resolver.
    NOTA: Se ainda houver larvas que são definitivamente não quer flutuar ou afundar, escolher uma linha para usar como ponto de corte para rotular as larvas ou como um floater ou uma chumbada. Aplicar este mesmo critério a todos os genótipos. Usamos o ângulo na parte inferior do tubo cónico como a fronteira. ADP ou SIR2 ¹⁷ larvas mutante pode ser utilizado como um controlo positivo e ¹⁹ LSD2 mutantes pode ser usado como um controlo negativo para a calibração do ensaio.
11. Grave o número de larvas flutuante e a concentração específica testada.
12. Adicionar 1 ml de sacarose a 20% à solução experimental para aumentar a sua densidade.
13. Repita os passos 3,7-3,10. Grave o número de larvas flutuante e esta nova concentração.
14. Continuar passos 3.12 e 3.13 até, pelo menos, 95% das larvas são flutuante.
15. Use uma pinça para recolher todas as larvas em um prato dissecção preenchido com PBS.
16. Obslarvas Erve sob um microscópio e nota se houver qualquer pequena larva, pré-pupa, pupa, ou quaisquer outras diferenças entre genótipos.
    NOTA: O ideal é que todas as larvas devem aparecer homogênea e, ao mesmo estágio de desenvolvimento. Nós só temos observado medições de gordura consistentes nestas condições.
17. Registe o número total de larvas.
18. Utilizando uma pinça, transferir 10 larvas para um laboratório limpe para secar. Rotular um tubo de microcentrífuga e colocar 10 larvas no tubo.
19. Flash congelar as larvas em nitrogénio líquido. Armazenar o tubo à temperatura de -20 ºC.

Resultados

A Figura 1 representa um exemplo de como o ensaio baseado em flutuabilidade pode detectar ambas as lojas mais elevados e mais baixos de gordura em larvas geneticamente manipuladas. A Figura 1A mostra que a excitação ou silenciamento de um certo subconjunto de neurónios (E347) no cérebro das larvas induz menor teor em gordura e maior lojas, respectivamente. O mesmo fundo genético de controlo foi utilizado em ambos os casos. A Figura 1B mo...

Discussão

Há uma grande variedade de técnicas que têm sido desenvolvidos para medir os níveis de lípidos ^8-10. No entanto, cada um destes métodos é fornecido com alguns dos principais inconvenientes que são resolvidos pelo ensaio baseado em flutuabilidade descrito acima. Em primeiro lugar, este ensaio é extremamente rápida. O teste de um gradiente de concentração total não leva mais de 30 - 60 min. Esta é uma grande melhoria sobre a maioria das técnicas correntemente em uso. Por exemplo, a quantif...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Suco de Uva
Sacarose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Etanol			200 prova
Levedura de padeiro	Fleichmann's
Yellow Farinha de Milho	Quaker		Enriquecida Degerminada
Drosophila Agar Tipo II	Apex	66-104
Farinha de Soja	ADM Specialty Ingredients	062-100
Extrato de Malte	Breiss	5748
Xarope de Milho	Karo
Ácido Propiônico	VWR	U330-09
Cloreto de sódio	Fisher	50147491
Fosfato de potássio monobásico	Sigma	P5655-100G
Fosfato de sódio anidro	Fisher	S3933
Cloreto de potássio	Fisher	P330-500
Placa de Petri de 35 x 10 mm	Fisher	08-757-100A
50 ml Cônico	Fisher	50-869-569

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