É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An

14.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/54757

⸱

14 de novembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cell Morphology and Molecular Neurobiology, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.

Resumo

desenvolvimento neuronal adequada e função é o pré-requisito do desenvolvimento e do cérebro adulto. No entanto, os mecanismos subjacentes à formação altamente controlada e manutenção de redes neuronais complexas não estão completamente compreendidos, até agora. As questões em aberto sobre neurônios na saúde e na doença são diversas e alcance da compreensão do desenvolvimento básico para investigar patologias relacionadas com humanos, por exemplo, doença de Alzheimer e esquizofrenia. A análise mais detalhada dos neurónios pode ser realizado in vitro. No entanto, os neurônios estão exigindo células e precisam do apoio adicional dos astrócitos para a sua sobrevivência a longo prazo. Esta heterogeneidade celular está em conflito com o objectivo de dissecar a análise de neurónios e astrócitos. Apresentamos aqui um ensaio de cultura de células que permite a co-cultura a longo prazo de neurónios e astrócitos primários puros, que partilham o mesmo meio definido quimicamente, sendo fisicamenteseparados. Nesta configuração, as culturas sobreviver por até quatro semanas e o ensaio é adequado para uma diversidade de investigações relativas a interação neurônio-glia.

Introdução

Ao longo das últimas décadas, a interpretação geral da função neuroglia evoluiu a partir da atribuição de um apoio meramente no sentido de um papel regulador activa a respeito da função neuronal 1. Por causa de seu impacto importante na homeostase cerebral na saúde e na doença 2, os astrócitos são de especial interesse para a comunidade científica. Nos últimos anos, uma diversidade de estudos concentraram-se em interacções neurónio-glia in vivo e in vitro 3. No entanto, a maioria dos sistemas de cultura não permitem a análise em separado de ambos os tipos de células e de seus respectivos secretomes.

Várias abordagens explorar o co-cultivo direta dos neurônios e da glia para alcançar a sobrevivência duradoura e de desenvolvimento da rede neuronal fisiologicamente relevante 4-6. O presente protocolo atinge os mesmos objetivos, mantendo ambos os tipos de células separadas fisicamente 7. Em comparação com conditioned média se aproxima de 8,9, o nosso sistema permite estudar a comunicação bidirecional entre neurónios e astrócitos. A expressão de moléculas de sinalização segregadas pode ser monitorizada, enquanto as células maturam no meio compartilhado. Esta possibilidade é especialmente relevante, tal como astrócitos libertam factores solúveis, tais como citoquinas, factores de crescimento e moléculas da matriz extracelular 10,11, regulando desse modo o crescimento neuronal e função 7,12. Assim, foi demonstrado que a adição de trombospondina de células do gânglio retinal in vitro, induz a formação de sinapses 13. No entanto, outros fatores ainda desconhecidos são necessárias para tornar as sinapses funcionais 13. Além disso, as moléculas liberadas por astrócitos têm de ser identificados, a fim de compreender a base de interações neurônio-glia.

A cultura de neurónios e astrócitos primários de ratinho e rato foi previamente descrito 14-16. Aqui nósapresentar uma ferramenta elegante e versátil para combinar ambos os tipos de células em uma abordagem co-cultura indirecta. Uma vez que as duas culturas são fisicamente separadas mas que partilham a mesma forma, o impacto de neurónios, astrócitos e as moléculas solúveis, podem ser analisados ​​separadamente, criando assim uma ferramenta poderosa para estudos de interacção Neuron-glia.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os experimentos com camundongos estavam em conformidade com a Lei alemã e da Sociedade Alemã de diretrizes neurociência da criação de animais. As comissões de cuidados de animais e utilização do Bochum Ruhr-University concederam as licenças apropriadas.

1. Preparação e Cultivo de Cortical astrócitos

Nota: Conclua estas etapas do protocolo, pelo menos, 7 d antes de prosseguir para as próximas etapas, como as culturas de astrócitos devem desenvolver em monocamadas confluentes antes que os neurônios estão preparados. astrócitos primários são derivados de culturas gliais mistos obtidos a partir de filhotes de rato ao redor dia pós-natal (P) 0-3. Três cérebros (6 córtices) por frasco T75 são para ser usados.

  1. Prepara-se o meio de astrócitos, completando de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro de v / v de cavalo e 0,1% v / v de gentamicina sob condições estéreis. Armazenar o meio a 4 ° C durante até 2 semanas.
  2. Brasão 3x T75 frascos with 10 ug / ml de poli-D-lisina (PDL; em água-cultura de grau célula) durante pelo menos 1 h a 37 ° C na presença de 6% v / v de CO2. Após o revestimento, os frascos de lavagem duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover catiões não ligados, e adicionar 9 ml de meio de astrócitos.
  3. Para a preparação dos cérebros, adicionar Solução Salina Equilibrada de Hank 10 ml (HBSS) para 1x 10 centímetros de Petri e 1 ml de HBSS a 1 x 15 mL tubo (independentemente do número de cérebros que vai ser utilizado). Manter um par de tesouras cirúrgicas, 2 pinça fina e um binóculo ao alcance para o procedimento.
  4. Decapitar 3 filhotes rapidamente com as tesouras cirúrgicas e recolher as cabeças em um vazio placa de 10 cm.
    1. Realizar a preparação dos córtices sob a binocular. Utilizando duas pinças finas, remover a pele dorsal a partir do crânio na linha mediana, a partir do pescoço para cima em direcção ao nível dos olhos. Depois disso, o cérebro com os seus vasos sanguíneos é visível sob o crânio.
    2. Fixar a cabeça na extremidade rostral com um par de fórceps e inciso linha média do crânio, começando na extremidade posterior. Posteriormente, cortaria a direita e as metades esquerda do crânio para expor o cérebro.
    3. Fechar a ponta do fórceps e posicioná-lo sob ventral do cérebro. Levantar o cérebro fora do crânio e transferi-lo para o HBSS-cheia 10 centímetros de Petri. Proceda da mesma forma com o modelo restantes até que todos os cérebros são recolhidas no prato.
  5. Após a coleta dos cérebros, comece com a separação dos córtices por beliscar fora da parte posterior do cérebro usando um par de fórceps, como um par de tesouras. Executar uma incisão na linha média entre os dois hemisférios com um par de pinças. Cuidadosamente corrigir o cérebro com uma pinça e cortar o mesencéfalo e os bulbos olfatórios utilizando uma segunda pinça para acabar com as metades corticais.
  6. Fix metade cortical com um par de fórceps e descascar as meninges dos hemisférios destacando-los from a aresta lateral e, subsequentemente, puxando-os da superfície cortical utilizando uma segunda pinça.
  7. Virar o meia cortical com a sua superfície orientada para baixo para o prato; dissecar cuidadosamente e remover o hipocampo em forma de crescente, usando um par de fórceps. Transfira os córtices individuais dentro do tubo cônico de 15 mL usando uma pinça fechadas para realizar um córtex individual.
  8. Depois de recolher todos os córtices, o trânsito para a capela de fluxo laminar estéril e começar com os preparativos para a dissociação do tecido cortical.
  9. Adicionar 1 ml de DMEM a um tubo de reacção de 2 mL e adicionar 0,1% w / v de papaína (30 unidades). Incubar a suspensão num banho de água a 37 ° C até que uma solução clarificada desenvolve (cerca de 3 min). Adicionar 0,24 mg / mL L-cisteína e 20 ng / mL DNAse e agitar suavemente.
    NOTA: Para a digestão, aproximadamente, 1 mL de solução de enzima é necessária.
  10. Filtro (0,22 mM tamanho dos poros) para obter uma solução estéril mL antes de adicionar-lo para o tecido cortical. Incubar os tubos durante 30 minutos - 1 hora a 37 ° C (ou seja, em um banho de água).
    NOTA: As etapas 1,11-1,14 são críticos e devem ser concluídas dentro de 15 min.
  11. Para terminar a reacção de digestão, adicionar um meio de astrócitos mL e tritura-se cuidadosamente o tecido digerido utilizando uma pipeta de 1 mL. Para trituração, e mover-se suavemente o êmbolo da pipeta, aspirando assim, e extrusão da suspensão de tecido cortical.
  12. Uma vez que o tecido foi dissociado para uma suspensão de uma única célula, adicionam-se 5 mL de meio de astrócitos e centrifugar durante 5 minutos a 216 x g.
  13. Aspirar o sobrenadante com cuidado a partir do sedimento resultante e voltar a suspender as células em um meio de astrócitos mL.
  14. Adicione as suspensões de células para frascos T75 reabastecidos com 9 meio de astrócitos mL (ver 1.2).
  15. Incubar as células a 37 ° C na incubadora, na presença de 6% v / v de CO2. Após 4 d, realizar a primeira mudança meio completo (10 mL). Depois disso, mudar o meio de cultura a cada 2-3 d.
  16. Após 7 d, verificar se as células formaram uma monocamada confluente. Se não, esperar durante mais de 2 - 3 dias até confluência completa da cultura é atingido.
    NOTA: Os astrócitos exibir grandes corpos celulares achatados, localizar-se no fundo do frasco e não se desenvolvem os processos celulares notáveis. Eles diferem das pequenas células progenitoras brilhantes de contraste de fase e a microglia que residem no topo da monocamada de 17.
  17. A fim de se livrar das células progenitoras e obter uma cultura de astrócitos pura, coloque os frascos T75 em um agitador orbital e agitar as culturas O / N a 250 rpm. Certifique-se de que a temperatura é ajustada a 37 ° C e que o filtro do balão é selada com filme de laboratório para evitar a evaporação do CO 2.
  18. No dia seguinte, Aspirar o meio e adicionar meio de cultura de 10 mL fresco reabastecido com 20 uM citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para Eliminacélulas em divisão residuais te.
    NOTA: incubação com AraC para 2-3 d na incubadora a 37 ° C, 6% de CO 2 vai resultar em uma cultura de astrócitos puro.
  19. Monitorar a pureza das culturas de astrócitos por inspecção visual ao microscópio de luz. Se residual de contraste de fase de células progenitoras brilhante e microglia ainda residem no topo da monocamada astrocitária 17 (veja o passo 1.16), repita os passos de 1,18 e 1,19.
    NOTA: O confluente e monocamadas de astrócitos puros pode ser mantido durante até 14 d na incubadora (37 ° C, 6% v / v de CO2) antes de prosseguir para o próximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d. Não coletar, congelar e descongelar os astrócitos, uma vez que estas células irão perder as suas propriedades favoráveis ​​neuronais através do procedimento de armazenamento.

2. Os astrócitos preparando para o Coculture indireta

Nota: 48 - 72 h antes de preparar os neurônios, astrócitos transferência para o celinserções l-cultura. Geralmente, um único frasco T75 proporciona um número suficiente de células para suportar as culturas neuronais obtidos com uma preparação.

  1. Coloque como muitos inserções conforme necessário para 24 poços placas. Revestimento cada inserção com 10 ug / mL PDL (dissolvido em água de grau de cultura de células) durante cerca de 1 h a 37 ° C, 6% v / v de CO2. Após a incubação, as inserções de lavar duas vezes com PBS. Nesse meio tempo, prosseguir com a preparação de astrócitos.
    NOTA: As inserções cheias com PBS pode ser mantido até que a suspensão de células de astrócitos está pronto para uso.
  2. Aspirar o meio do astrócito (com AraC) e lava-se a cultura de uma vez com 10 mL de PBS para garantir qualquer soro residual é removido.
  3. Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) aos frascos e incubar as células durante tripsinização a 37 ° C, 6% v / v de CO2, durante cerca de 10 min.
  4. Controlar a separação celular por inspeção visual usando um microscópio e Facilitate o descolamento das células tocando no lado dos frascos contra a área de trabalho.
    NOTA: As etapas 2,5-2,8 são críticos e deve ser concluído dentro de 15 - 20 min.
  5. Após o tratamento com tripsina, gentilmente re-suspender as células em meio de astrócitos 7 mL e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL. Centrifugar durante 5 minutos a 216 x g.
  6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 mL de meio de astrócitos.
  7. Contar as células utilizando uma câmara de contagem.
  8. Encha o fundo das cavidades da 24 poços da placa com meio de astrócitos 500 uL e transferir 25.000 células em meio de astrócitos 500 ul em cada inserção individual. Incubar a cultura a 37 ° C, 6% v / v de CO2.
    NOTA: Depois de 42-72 h as culturas irá atingir cerca de 100% de confluência. Nesta fase, a pureza da cultura pode ser verificada por meio de imunocitoquímica 11. As culturas confluentes podem ser mantidos durante até 7 d até se proceder àpróximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d.

3. Preparação de primário neurônios do hipocampo

Nota: os neurônios do hipocampo de rato primária deve ser derivado de E15.5 - embriões E16 de ratos grávidas cronometrados.

  1. Preparar o meio neuronal (MEM com piruvato de sódio 10 mM, 0,1% w / v de ovalbumina, 2% v / v de suplemento de meio B27, e 0,1% v / v de gentamicina (filtrado estéril)), e meio de preparação (HBSS com 0,6% w / v de glucose e 10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-etanossulf único piperazina)). Pré-aquecido e pré-equilibrar a forma neurónio em frascos de filtro a 37 ° C, 6% v / v de CO2.
  2. Coloque as lamelas de vidro-(12 mm de diâmetro) para os poços de 24 poços-placas (use as lamelas especiais, que são entalhadas para o uso com inserções de cultura de células).
    1. Revestimento durante pelo menos 1 h com 15 ug / ml de poli-DL-ornitina em água (cultura celular de grau) a 37 ° C. Use pelo menos, 500 uL por poço para assegurar queas lamelas estão completamente cobertos. Lavar as cavidades duas vezes com PBS. Deixar o PBS nos poços até plaqueamento das células. Certifique-se de que os poços não sequem.
  3. Para dissecar os hipocampos, prepare 3x 10 cm pratos cheios com meio de preparação e 1x tubo de 2 mL com um meio de preparação mL. Prepare uma tesoura e 2 pinça fina.
  4. Sacrificar o mouse grávida por deslocamento cervical, esterilizar o abdómen por lavagem com 70% v / v de etanol, e abrir o abdômen usando uma tesoura afiada. Excisão do útero frisado cuidadosamente com uma tesoura e transferir o órgão em 1x placa de 10 cm cheios com meio preparação.
  5. Em seguida, retire os embriões do útero. Cuidadosamente inciso do útero e remover a membrana amniótica sem prejudicar os embriões usando 2 fórceps. Em seguida, decapitar cada embrião com um par de tesouras e transferir as cabeças para uma segunda placa de 10 cm com meio de preparação fornecido.
  6. Prosseguir com a preparação das cabeças (semelhante ao preparção descrita em 1,4-1,7).
    1. Imobilizar a cabeça com um par de pinças e incisão no crânio e a pele na região do pescoço próximo da parte posterior do cérebro, perpendicular ao neuroeixo. Usar um segundo par de fórceps para levantar tanto crânio e cobrindo a pele, e dobrar o gorro macio para a extremidade rostral da cabeça, expondo assim o cérebro.
    2. Com a ajuda de uma pinça 2, retire o cérebro da cavidade craniana. Para fazer isso, par próximo 1 de fórceps e separar o cérebro do crânio começando pelos bulbos olfatórios e se movendo em direção à parte posterior do cérebro. Recolher os cérebros em outra placa de 10 cm cheios com meio preparação.
  7. Dissecar a hipocampos a partir das porções do córtex, tal como descrito acima para a preparação de astrócitos (passo 1.6). Remova o hipocampo de cada hemisfério e recolhê-las no tubo de 2 mL cheio com meio de preparação.
  8. Depois de completar a dissecção, transferir o tubo para o banco de fluxo laminar estéril e Digest o tecido do hipocampo com uma solução de digestão mL contendo papaína. Preparar a solução de digestão tal como descrito no passo 1,9-1,10, mas em vez disso utilizar MEM DMEM.
    NOTA: os passos 3,9-3,12 são críticos e devem ser concluídas dentro de 10 - 15 min.
  9. Após a conclusão da digestão, retirar-se cuidadosamente a solução de digestão por sucção suave com uma pipeta.
  10. Lave o hipocampo 3 vezes com meio neurônio adicionando sequencialmente e, posteriormente, aspirando cuidadosamente 1 mL meio de cultura fresco por ciclo de lavagem. Não centrifugar a suspensão de células.
  11. Após o passo de lavagem final, tritura-se cuidadosamente o tecido em 1 ml de meio neuronal.
  12. Contar as células utilizando uma câmara de contagem e a placa 35.000 células em 500 uL de meio por neurónio um único poço de uma de 24 cavidades de placa (a placa mencionado em 3.2).
    NOTA: Opcionalmente, uma alíquota de células podem ser contrastadas com azul de tripano para avaliar a vitalidade da preparação celular. Controlar a densidade de revestimento por inspecionar visuaisiões utilizando o microscópio (tipicamente 90 - 110 células por campo visual de um objectivo padrão 10X).
  13. Neurónios colocar no incubador a 37 ° C, 6% v / v de CO2, durante 1 h.
  14. Publique incubação, tomar as inserções preparados (semeada com monocamadas confluentes de astrócitos) para fora da incubadora (veja o passo 2.8). Trocar o meio por aspiração do meio astrócitos e substituí-lo com 500 ul fresco neurônio médio.
    NOTA: As inserções devem abrigar monocamadas de astrócitos confluentes após 2-3 DIV (dias in vitro).
  15. Coloque as inserções com astrócitos com cuidado para os poços que contêm as culturas de neurônios (passo 3.13) usando uma pinça estéril.
  16. Coloque a co-cultura de neurónios-astrócitos indirecta resultante de volta na incubadora a 37 ° C, 6% v / v de CO2.
    Nota: Sob estas condições, os neurónios podem ser cultivada por até quatro semanas em meio completamente definido. Nenhuma mudança médio é necessário. Para as culturas de longa data, recomenda-se a encher eMtpa poços com água estéril, a fim de reduzir a evaporação a partir da placa bem-24.
  17. Execute in vitro de células análises após períodos de cultura desejada (por exemplo, por imunocitoquímica, PCR, Western Blot, registros eletrofisiológicos (patch clamp ou matriz multieletrodo)) 7,15,18.
    NOTA: O sistema de cultura também é adequado para o tratamento farmacológico aguda e crónica das culturas 11.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A análise das culturas neuronais através do sistema de co-cultura indirecta é heterogénea e pode ser realizada em diferentes estágios de maturação da cultura. Devido ao facto de que as células podem ser mantidas durante até 4 semanas, as investigações a longo prazo das culturas são possíveis.

O esquema no painel central esquerdo da Figura 1 demonstra a configuração de co-cultura. Com a utilização deste sistema...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O principal objetivo do protocolo atual é a de culturas neuronais e astrócitos completamente separadas, mantendo-os em meio compartilhado. Por esta razão, a pureza das culturas obtidas deverá ser verificada no início do procedimento. Recomendamos o uso de neurônio-específica tubulina, neurofilaments ou proteína NeuN como marcadores neuronais, GFAP como marcador de astrócitos, o antígeno O4 como marcador precursor oligodendrócitos e proteína Iba1 para identificar microglia.

Preste atenção esp...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O presente trabalho foi apoiado pela fundação de pesquisa alemã (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; a escola de pesquisa da Ruhr University Bochum (GSC98/1) e o programa prioritário SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
B27Gibco (Life Technologies)17504-044
Água de grau de cultura celularMilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)Sigma-AldrichC1768CUIDADO: H317, H361
DMEMGibco (Life Technologies) 41966-029
DNAseWorthingtonLS002007
GentamycinSigma-AldrichG1397CUIDADO: H317-334
GlucoseServa22700
HBSSGibco (Life Technologies)14170-088
HEPESGibco (Life Technologies)15630-056
Soro de cavaloBiochrom AGS9135
L-CisteínaSigma-AldrichC-2529
MEMGibco (Life Technologies)31095-029
OvalbuminaSigma-AldrichA7641CUIDADO: H334
PapainWorthington3126
PBSauto-fabricado
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP0899
Poli-L-ornitinaSigma-AldrichP3655
Piruvato de sódioSigma-AldrichS8636
Tripsina-EDTAGibco (Life Technologies) 25300054
< forte > Equipamento< / forte >
24 poçosTermocientífico / Nunc142475
Placa de 24 poços (para a co-cultura indireta)BD Falcon353504
BinocularLeicaMZ6
Inserções de cultura de célulasBD Falcon353095
HeraeusMultifuge 3S-R
Marienfeld650010
FórcepsFST Dumont711254-20
lamínulas de vidro (12  mm)Carl Roth (Menzel- Glä ser)P231.1
IncubadoraThermo ScientificHeracell 240i
Microtubo (2 mL)Sarstedt72,691
MicroscópioLeicaDMIL
Millex Unidade de filtro acionada por seringaMilliporeSLGV013SL
Agitador orbitalNew Brunswick ScientificInnova 4000
ParafilmBemisPM-996
Placas de Petri (10 cm)Sarstedt833.902
pipeta (1 mL)GilsonPipetman 1000
Bancada de trabalho estérilThe Baker CompanyLaminar Flow SterilGARD III
Tesoura cirúrgicaFST Dumont14094-11
SeringaHenry Schein9003016
Balão T75Sarstedt833.911.002
tubo (15 mL)Sarstedt64.554.502
Banho-mariaGFLBanho-maria tipo 1004
placas de Câmara de Contagem

Referências

  1. Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
  2. Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
  3. Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
  4. Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
  5. Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1(2011).
  6. Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
  7. Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
  8. Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
  9. Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
  10. Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
  11. Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
  12. Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
  13. Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  15. Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
  16. Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961(2016).
  17. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  18. Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
  19. Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
  20. Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
  21. Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
  22. Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
  23. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Ensaio de Cocultura IndiretaNeurônios PrimáriosAstrócitos PrimáriosFormação de SinapsesAnálise do SecretomaDissecação de TecidoIsolamento CelularWestern Blot
A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.