Method Article

Um protocolo otimizado para a radiomarcação eficiente de nanopartículas de ouro usando um 125 Marcado com Eu Azida grupo prostético

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um procedimento pormenorizado para a síntese de uma azida marcado com 125I e a radiomarcação de dibenzocyclooctyne (DBCO) -Grupo-conjugados, nanopartículas de ouro de 13 nm de tamanho, utilizando uma reacção de clique sem cobre é descrito.

Abstract

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Aqui, demonstramos um protocolo detalhado para a radiossíntese de um grupo protético de azida marcado com 125I e sua aplicação à radiomarcação eficiente de nanopartículas de ouro funcionalizadas pelo grupo DBCO usando uma reação de clique sem cobre. A radioiodação do precursor estanilado (2) foi realizada usando [125I]NaI e cloramina T como oxidante à temperatura ambiente por 15 min. Após a purificação por HPLC do produto bruto, a azida purificada marcada com 125I (1) foi obtida com alto rendimento radioquímico (75 ± 10%, n = 8) e excelente pureza radioquímica (>99%). Para a síntese de nanopartículas de ouro de 13 nm radiomarcadas, as nanopartículas de ouro funcionalizadas com DBCO (3) foram preparadas usando um polímero de polietilenoglicol tiolado. Uma reação de clique sem cobre entre 1 e 3 deu as 125nanopartículas de ouro marcadas com I (4) com mais de 95% de rendimento radioquímico, conforme determinado por cromatografia em camada radiofina (radio-TLC). Esses resultados indicam claramente que o presente método de radiomarcação usando uma reação de clique sem cobre promovida por cepa será útil para a radiomarcação eficiente e conveniente de nanomateriais contendo o grupo DBCO.

Introduction

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A reação de clique sem cobre promovida por cepa entre azidas e ciclooctinas tem sido amplamente aplicada à marcação bio-ortogonal eficiente de uma ampla gama de biomoléculas, nanomateriais e sujeitos vivos1-7. Devido à excelente especificidade do local e à rápida taxa de reação dessa reação de conjugação, ela também tem sido usada para sintetizar traçadores radiomarcados. Alguns 18grupos protéticos de azida ou DBCO marcados com F foram preparados para marcação in vitro de vários tipos de câncer direcionados a peptídeos e anticorpos, bem como para imagens pré-direcionadas in vivo de tumores8-13. Além desses exemplos, a mesma reação de conjugação foi aplicada à marcação metal-radioisótopo de nanomateriais para estudos de imagem de tomografia por emissão de pósitrons (PET)14-16.

Por várias décadas, os iodos radioativos têm sido usados para pesquisas biomédicas e ensaios clínicos por meio de imagens PET (124I), imagens de tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) (123I, 125I) e tratamento do câncer de tireoide (131I)17-21. Portanto, um método eficiente para marcação de iodo radioativo é fundamentalmente importante para várias investigações, incluindo estudos de imagem molecular, análise da distribuição de órgãos de biomoléculas, identificação de biomarcadores e desenvolvimento de medicamentos. Uma estratégia de reação de clique sem cobre pode ser usada na marcação de iodo radioativo. No entanto, esta aplicação não foi investigada tão extensivamente quanto 18biomoléculas marcadas com F22-23. Aqui, forneceremos um protocolo passo a passo para a síntese de uma azida marcada com 125I para radiomarcação de moléculas derivadas do grupo DBCO. Os procedimentos no presente relatório incluirão radioiodação do precursor estanilado, etapas de purificação com HPLC e extração em fase sólida. Também demonstramos a radiomarcação eficiente de nanopartículas de ouro de 13 nm modificadas pelo grupo DBCO usando a azida marcada com 125I. O protocolo detalhado neste relatório ajudará os químicos sintéticos a entender uma nova metodologia de radiomarcação para a síntese de produtos radiomarcados.

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Protocol

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Cuidado: A forma oxidada de iodo radioativo é bastante volátil e devem ser manuseados com escudos de chumbo adequados e frascos de chumbo. Todos os passos radioquímica deve ser levada a cabo em uma capa filtrou-carvão bem ventilado, e os procedimentos experimentais devem ser monitorizadas por meio de dispositivos de detecção de radioactividade.

1. Preparação dos produtos químicos e o cartucho de fase reversa para a síntese da azida 125 I-rotulados

  1. Preparação de reagentes em solução
    1. Dissolve-se 1 mg de azida do precursor (2) em 150 ul de etanol absoluto (Figura 1).
      NOTA: Um procedimento sintético detalhado para o precursor azida (2) foi relatada em estudo anterior 22.
    2. Dissolve-se 1 mg de cloramina T em 20 ul de 1x tampão salino de fosfato (pH = 7,4).
    3. Dissolve-se 2 mg de metabissulfito de sódio em 20 mL de H 2 O.
  2. Preparação do cartucho
    1. Lavar o cartucho de TC18 com 10 ml de etanol absoluto seguida por 10 ml de H 2 O. Não se secar a matriz de o cartucho com ar.

2. radioss�tese do protético grupo azida marcada com 125I

  1. Radioiodação reacção do precursor
    1. Adicionar a solução precursora de azida (1 mg em 150 ul de etanol absoluto) e ácido acético (10 ul) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Adicionar 150 MBq de [125I] NaI em NaOH 0,1 M (50 mL) à mistura de reacção.
    3. Adicionar uma solução de cloramina T (1 mg em 20 ul de 1x tampão de fosfato salino) e fechar-se a mistura de reacção tubo de microcentrífuga contendo.
    4. Incubar a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min, até que a reacção é completada a radioiodinação.
    5. Adicionar uma solução de metabissulfito de sódio (2 mg em 20 ul de H2O) à mistura reaccionalpara extinguir a reação radioiodação.
    6. Retirar 0,2 mL do produto em bruto e depois dilui-se com 100 ul de solução (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) para análise por HPLC.
      NOTA: Para todas as experiências de HPLC, utilizar 0,1% de ácido fórmico contendo H2O (solvente A) e 0,1% de ácido fórmico contendo acetonitrilo (solvente B) como eluentes.
    7. Analisar o produto em bruto diluído usando um de fase inversa analítica rádio-HPLC (C18 de fase reversa; taxa de fluxo: 1 ml / min; gradiente de eluente: 20% de solvente B durante 0-2 min, 20-80% de solvente B durante 2-22 minutos, 80-100% de solvente B durante 22-23 min, e 100% de solvente B durante 23-28 min; tempo de retenção: 16,4 min) (Figura 2).
  2. A purificação do produto em bruto com uma HPLC preparativa
    NOTA: Fornecer suficiente blindagem de chumbo em torno de partes de HPLC tal como o injector, coluna, detector, frasquinhos de colheita, e o recipiente no qual o efluente é recolhido.
    1. retirar thum e todo mistura reaccional para dentro de um frasco de HPLC. Lavar o tubo de reacção com acetonitrilo (0,5 mL) e adicionar a água de lavagem para o mesmo frasco de injecção. Dilui-se a solução recolhida com H 2 O (1 mL).
    2. Injectar o produto em bruto para um rádio-preparativa de HPLC (coluna C18 de fase inversa; caudal: 10 ml / min; gradiente de eluente: 20% de solvente B durante 0-2 min, 20-80% de solvente B durante 2-22 min, 80-100% de solvente B durante 22-23 min, e 100% de solvente B durante 23-28 min).
    3. Recolhe-se o pico que representa a azida radioactivos 125I-marcado (1) (tR sob estas condições de HPLC é 17,8-18,8 min) num tubo de ensaio de vidro (Figura 2).
    4. Medir o rendimento radioquímico da fracção utilizando um calibrador de doses de radioactividade de acordo com o protocolo do fabricante.
    5. Injectar o produto purificado sobre um rádio-HPLC analítica usando as mesmas condições de HPLC para determinar a pureza radioquímica do produto.
  3. Extracção em fase sólida do produto
    1. Dilui-se a fracção que contém o produto desejado (1) com 40 ml de H2O puro
    2. Adicionar a solução diluída em um cartucho de TC18 pré-condicionados.
    3. Lavar o cartucho com um adicional de 15 ml de H 2 O.
    4. Elui-se o produto (1) preso no cartucho com 2 ml de acetona para um frasco de vidro de 10 ml, que é protegido por um escudo de chumbo. Medir a radioactividade do produto eluído utilizando um calibrador de doses de radioactividade de acordo com o protocolo do fabricante.
      NOTA: Dimetil sulfóxido (DMSO) ou etanol absoluto, também pode ser usado para eluição do produto a partir do cartucho. Cerca de 5-10% da radioactividade normalmente adere ao cartucho, e o produto marcado radioactivamente restante não pode ser totalmente fluido utilizando quantidades em excesso de solvente orgânico.
    5. Evapora-se a acetona, com uma corrente de azoto ou árgon gasoso.
    6. Dissolve-se o residue com DMSO (100-200 uL) para o próximo passo de radiomarcação.

3. Síntese de DBCO-grupo conjugado Nanopartículas de Ouro

  1. Modificação da superfície de ouro de 13 nm de tamanho nanopartículas com DBCO contendo grupo polietilenoglicol
    1. Prepare-de sódio estabilizado citrato de nanopartículas de ouro (3) (média size = 13 nm) de acordo com um relatório anterior 24.
    2. Adicionar uma solução aquosa de Tween 20 (1 mM, 1,5 mL) às nanoparticulas de ouro estabilizadas-citrato (10 nM, 15 ml). Agitar a solução durante 20 min num agitador orbital.
    3. Adicionar uma solução aquosa de DBCO contendo-grupo tiol polietileno glicol (peso molecular médio = 5000, 100 ^ M, 1,5 ml). Agitar a solução durante 2 h num agitador orbital.
  2. A purificação das nanopartículas de ouro DBCO-modificado com grupo
    1. Purificar o nanopartículas de ouro DBCO-modified-grupo (4) </ Strong> por centrifugação sucessiva (11.400 xg, 15 min x 3).
    2. Decantar o sobrenadante e adicionar água pura para a ressuspensão das peletes de nanopartulas de ouro.

4. A marcação radioactiva de DBCO-modified-grupo do ouro nanopartículas através do livre-Cobre Clique Reaction

  1. Síntese de nanopartículas de ouro 125 marcado com I utilizando a azida de 125I-marcado (1)
    1. Prepara-se uma solução concentrada de nanopartículas de ouro DBCO-modificado com grupo usando centrifugação (11400 xg, 15 min), e ajustar a concentração das nanopartículas de ouro de 2 uM.
    2. Adicionar 4,1 MBq de azida marcada com 125 I (1) em DMSO (5 ul) a uma suspensão de nanopartículas de ouro (4) (2 ^ M, 50 ul).
    3. Incubar a mistura de reacção resultante a 40 ° C durante 60 min.
    4. Retirar uma aliquota (0,2 pi) do produto em bruto e aplicá-lo sobre um gel co-cromatografia em camada fina ated (TLC) placa.
    5. Desenvolver a placa de TLC, utilizando acetato de etilo como a fase móvel.
    6. Colocar a placa de TLC em um scanner de rádio-TLC e executar o scanner para monitorizar a reacção de marcação radioactiva (Figura 3) de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. A purificação do produto em bruto
    1. Purifica-se a mistura de reacção contendo os 125 marcado com I nanopartículas de ouro (4) por centrifugação (11400 xg, 15 min).
    2. Decantar o sobrenadante e adicionar água pura para a ressuspensão das peletes de nanopartulas de ouro.
    3. Retirar uma aliquota (0,2 pi) do produto purificado e aplicá-lo sobre uma placa de CCF de sílica-revestido.
    4. Desenvolver a placa de TLC, utilizando acetato de etilo como a fase móvel.
    5. Colocar a placa de TLC em um scanner de rádio-TLC e executar a análise para determinar o rendimento radioquímico e pureza radioquímica do gol 125 marcado com ID (4) nanopartículas (Figura 3) de acordo com o protocolo do fabricante.

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Results

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A reacção de radioiodação do precursor estanilado (2) foi realizado utilizando 150 MBq de [125I] NaI, ácido acético, e cloramina T à temperatura ambiente durante 15 min para proporcionar o produto marcado radioactivamente (1). Depois de purificação por HPLC preparativa da mistura em bruto, o produto desejado foi obtido com 75 ± 10% (n = 8) de rendimento radioquímico. HPLC analica revelou que a pureza radioquímica do produto marcado com 12...

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Discussion

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Em geral, o rendimento radioquímico observada da azida 125 purificada marcada com I (1) foi de 75 ± 10% (n = 8). A marcação radioactiva foi feita com 50-150 MBq de radioactividade, e os resultados são bastante consistente radioquímica. Se [125I] NaI (T 1/2 = 59,4 d) que foram submetidos a decaimento radioactivo durante mais de um mês foi utilizado na reacção de radioiodação, observou-se o rendimento radioquímico de 1 a ser ligeiramente reduzida ...

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, financiada pelo governo da República da Coreia, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 e 2012M2A2A6011335) e pelo RI-Biomics Center do Instituto de Pesquisa de Energia Atômica da Coreia.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cloramina T trihidratadaSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Metabissulfito de sódio SigmaS9000
Ácido fórmicoSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartuchoWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetonaSigma650501
EtanolSigma459844
Gold(III) cloreto trihidratadoSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5.000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC gel de sílica 60 F254Merck
HPLC analíticaAgilent1290 InfinityNúmero do modelo
HPLC preparativaAgilent1260 InfinityNúmero
do modelo Coluna analítica de fase reversa C18AgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Coluna preparativa de fase reversa C18AgilentPrepHT XDB-C18
Scanner TLC de rádioBioscanAR-2000Número do modelo
Calibrador de dose de radioisótopoCapintec, IncCalibrador de dose CRC -25RNúmero do modelo

References

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