Aqui, nós descrevemos um método proteómica quantitativa utilizando a técnica de marcação por isótopos estáveis aminoácidos em cultura de células (SILAC) para analisar os efeitos da infecção por HIV-1 em proteomas exosomal hospedeiro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes células sob condições de stress ou infecções.
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Artigo de método
SILAC Based proteômica Caracterização de exossomas de HIV-1 células infectadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Proteômica é a análise em larga escala de proteínas. Técnicas proteômicas, como espectroscopia de massa em tandem de cromatografia líquida (LC-MS/MS), podem caracterizar milhares de proteínas por vez. Essas técnicas poderosas nos permitem ter uma compreensão sistêmica das alterações celulares, especialmente quando as células são submetidas a vários estímulos, como infecções, estresses e condições de teste específicas. Mesmo com desenvolvimentos recentes, a análise do proteoma exossômico é demorada e muitas vezes envolve metodologias complexas. Além disso, o grande conjunto de dados resultante geralmente precisa de uma análise robusta e simplificada para que os pesquisadores realizem mais estudos a jusante. Aqui, descrevemos um protocolo baseado em SILAC para caracterizar o proteoma exossômico quando as células são infectadas com HIV-1. O método é baseado em marcação simples de isótopos, isolamento de exossomos de células marcadas diferencialmente e análise de espectrometria de massa. Isso é seguido por mineração de dados detalhada e análise de bioinformática dos acertos proteômicos. Os conjuntos de dados e candidatos resultantes são fáceis de entender e geralmente oferecem uma riqueza de informações úteis para análise downstream. Este protocolo é aplicável a outros compartimentos subcelulares e a uma ampla gama de condições de teste.
Introdução
Muitas doenças humanas, incluindo infecções virais, estão muitas vezes associados com os processos celulares distintos que ocorrem e em torno das células afectadas. Proteínas, muitas vezes agindo como os efetores celulares finais, mediar estes processos. Análise das proteínas muitas vezes pode fornecer informações valiosas quanto ao ambiente local das células afetadas e ajudar-nos a compreender o mecanismo subjacente da patogênese da doença. Entre as várias técnicas de análise de proteínas, proteômica detém particularmente grande promessa. Como uma ferramenta poderosa, em larga escala, proteómica pode fornecer uma compreensão sistémica de processos celulares, particu....
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Protocolo
1. Cultura celular e infecção HIV-1
NOTA: Antes de iniciar experimentos, recomenda-se verificar a viabilidade das células através de coloração com Trypan Blue 11 e sua proliferação através de um ensaio de MTT 12. Também é fundamental para usar o meio SILAC recém-preparado. Várias linhas de células podem ser utilizados, desde que eles se encontram numa fase activamente prolif erativa, e são susceptíveis a infecção por HIV-1, ou a condição de teste de escolha. Neste protocolo, utilize linha de células H9 como o exemplo.
- Semente de 2 x 10 células H9 6 em cada balão de cult....
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Resultados
Figura 1A é um fluxograma descrevendo o procedimento de marcação SILAC 21. A fim de purificar os exossomos, as amostras devem ser girado para baixo através de centrifugação. A Figura 1B mostra os passos de purificação exossomo por ultracentrifugação de série 21. Uma vez purificado, os exossomas estão sujeitas a análise proteomic experimental tal como descrito no procedimento.
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Discussão
Nos procedimentos descritos no presente documento, demonstramos a aplicação da técnica SILAC para investigar o efeito de infecção por HIV-1 no proteoma exosomal hospedeiro. Inicialmente, as células infectadas e não infectadas com HIV-1 são diferencialmente marcado com isótopo. Os exossomas marcados diferencialmente são então purificados antes de realizar a extracção de proteínas. Em seguida, a espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida é utilizada para analisar o proteoma exosomal. Finalmente, os dados.......
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Divulgações
Os autores declararam não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por um suplemento de ARRA ao tempo de vida / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 e K24HD080539 a BR. Este trabalho também foi apoiado por expectativa de vida Fundo Pilot Research (# 701- 5857), Rhode Island Medical Foundation Grant Research (# 20.133.969) e NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) para ML. Agradecemos James Myall e Vy Dang para obter ajuda com a preparação do manuscrito e figura.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Linha celular H9 | ATCC | HTB-176 | |
| Azul de tripano | Thermo Fisher | 15250061 | |
| kit de ensaio MTT | Thermo Fisher | V13154 | |
| Soro bovino fetal dialisado (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| Kit de quantificação de proteína SILAC • RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | Versão DMEM (89983) |
| L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 para SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lisina-2HCl, 13C6 para SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH Programa de Reagentes para AIDS | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Kit ELISA de antígeno | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Centrífuga refrigerada de super-velocidade | Eppendorf | 22628045 | |
| Ultracentrífuga refrigerada | Beckman Coulter | 363118 | Deve ser capaz de atingir 100.000 x g |
| 50 mL Tubos de centrífuga cônicos | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Tubos de Ultracentrífuga | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| tampão RIPA | Thermo Fisher | 89900 | |
| Inibidores de Protease | Coquetéis Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | 5384000020 | Eppendorf | |
| Thermo Fisher | 23250 | ||
| Espectrofotômetro | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Aparelho de gel | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Reagente de coloração em gel | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Grau de Sequenciamento Tripsina Modificada | Promega | V5111 | |
| Concentrador SpeedVac | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Anticorpo para anexina humana A5 | Abcam | ab14196 | |
| Anticorpo para lactato humano desidrogenase B cadeia | Abcam | ab53292 | |
| Software Gráfico e Estatístico | Systat; | SigmaPlot | Ou GraphPad Prism |
| Pacote de software de proteômica quantitativa | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software e bancos de | Vários fornecedores | Consulte o texto principal para obter detalhes |
Referências
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exo....
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Reimpressões e permissões
