Artigo de método

SILAC Based proteômica Caracterização de exossomas de HIV-1 células infectadas

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DOI:

10.3791/54799

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3 de março de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

Neste artigo

Resumo

Aqui, nós descrevemos um método proteómica quantitativa utilizando a técnica de marcação por isótopos estáveis ​​aminoácidos em cultura de células (SILAC) para analisar os efeitos da infecção por HIV-1 em proteomas exosomal hospedeiro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes células sob condições de stress ou infecções.

Resumo

Proteômica é a análise em larga escala de proteínas. Técnicas proteômicas, como espectroscopia de massa em tandem de cromatografia líquida (LC-MS/MS), podem caracterizar milhares de proteínas por vez. Essas técnicas poderosas nos permitem ter uma compreensão sistêmica das alterações celulares, especialmente quando as células são submetidas a vários estímulos, como infecções, estresses e condições de teste específicas. Mesmo com desenvolvimentos recentes, a análise do proteoma exossômico é demorada e muitas vezes envolve metodologias complexas. Além disso, o grande conjunto de dados resultante geralmente precisa de uma análise robusta e simplificada para que os pesquisadores realizem mais estudos a jusante. Aqui, descrevemos um protocolo baseado em SILAC para caracterizar o proteoma exossômico quando as células são infectadas com HIV-1. O método é baseado em marcação simples de isótopos, isolamento de exossomos de células marcadas diferencialmente e análise de espectrometria de massa. Isso é seguido por mineração de dados detalhada e análise de bioinformática dos acertos proteômicos. Os conjuntos de dados e candidatos resultantes são fáceis de entender e geralmente oferecem uma riqueza de informações úteis para análise downstream. Este protocolo é aplicável a outros compartimentos subcelulares e a uma ampla gama de condições de teste.

Introdução

Muitas doenças humanas, incluindo infecções virais, estão muitas vezes associados com os processos celulares distintos que ocorrem e em torno das células afectadas. Proteínas, muitas vezes agindo como os efetores celulares finais, mediar estes processos. Análise das proteínas muitas vezes pode fornecer informações valiosas quanto ao ambiente local das células afetadas e ajudar-nos a compreender o mecanismo subjacente da patogênese da doença. Entre as várias técnicas de análise de proteínas, proteômica detém particularmente grande promessa. Como uma ferramenta poderosa, em larga escala, proteómica pode fornecer uma compreensão sistémica de processos celulares, particularmente na área da função e da interacção de proteínas. A análise de proteínas específicas é simplificada através do desenvolvimento de técnicas de marcação, que permitem que os investigadores para monitorar a expressão de componentes celulares, particularmente proteínas, no local da investigação. Embora muitas análises proteomic foram realizados em celularescala proteoma, caracterizações proteômicas em compartimentos subcelulares provaram ser particularmente informativa 1. Isto é exemplificado bem nos estudos de infecção por HIV-1.

Exossomos, 30-100 vesículas de membrana nm secretadas por uma ampla gama de tipos de células 2, 3, são componentes essenciais da comunicação intercelular e de transporte molecular. Eles foram previamente descoberto para desempenhar papéis importantes no processo de VIH-1 de brotamento 4, 5. Ao combinar a análise proteômica com dissecção funcional, descobrimos que exossomos libertados de HIV-1 células infectadas são compostos de uma única e quantitativamente diferentes assinatura proteína e porto moléculas regulatórias que afetam propriedades celulares em células receptoras, incluindo apoptose e proliferação celular 6 vizinho. Os métodos são descritos neste protocolo,nomeadamente SILAC (rotulagem isótopo estável por aminoácidos de cultura de células) 7 com base caracterização proteomic de exossomas a partir do HIV-1 de células infectadas. Abordagens semelhantes podem ser aplicados para entender melhor outros compartimentos subcelulares durante patogênese ajustando o esforço experimental para o compartimento ou fracção de interesse específico e fazer as mudanças necessárias para os procedimentos descritos.

Dado o recente desenvolvimento de métodos de proteômica quantitativos, há muitos a escolher de ao selecionar o método mais eficiente para uma experiência particular. Entre eles estão os iTRAQ com base química (marcas isobáricos para a quantificação relativa e absoluta) 8 eo MRM livre-label (monitoramento de reações múltiplas) 9 técnicas. Ambos os métodos são ferramentas poderosas e são boas opções para configurações específicas. Para um laboratório típico trabalhando principalmente com linhas celulares, no entanto, estes dois métodos têm relativelY custos mais elevados e são mais demorado quando comparado com o método baseado SILAC. SILAC é uma técnica de marcação metabólica com base que incorpora formas isotópicas de aminoácidos não radioactivos de meios de cultura para as proteínas celulares. Tipicamente, as experiências SILAC começar com duas populações de células, por exemplo, infectados e não infectados. Cada um está marcado diferencialmente em seu ambiente isotópica específica até rotulagem completa seja alcançada. Os exossomas marcados destas células são então submetidas a extracção de proteínas. Uma vez extraído, as proteínas marcadas são exosomal analisadas utilizando espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida 10. Finalmente, os resultados de espectrometria de massa e as proteínas marcadas são significativamente submetido a análise estatística e bioinformática, bem como para a verificação bioquímica rigorosa. Nossos relatórios de investigação anteriores sugerem que os procedimentos SILAC / exossomo são mais apropriadas para linhas de células do que as células primárias, como linhas celulares são geralmente em umestado de proliferação ativa de marcação isotópica eficiente,

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Protocolo

1. Cultura celular e infecção HIV-1

NOTA: Antes de iniciar experimentos, recomenda-se verificar a viabilidade das células através de coloração com Trypan Blue 11 e sua proliferação através de um ensaio de MTT 12. Também é fundamental para usar o meio SILAC recém-preparado. Várias linhas de células podem ser utilizados, desde que eles se encontram numa fase activamente prolif erativa, e são susceptíveis a infecção por HIV-1, ou a condição de teste de escolha. Neste protocolo, utilize linha de células H9 como o exemplo.

  1. Semente de 2 x 10 células H9 6 em cada balão de cultura de células. Cresça um grupo em 10 ml rotulados meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal dialisado (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lisina e 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginina. Cresça o outro grupo não marcado em 10 ml de meio RPMI 1640, com 10% de FBS dialisado, 100 mg / l de L-lisina e 100 mg / l de L-arginina.
  2. Crescer as células por seis duplicações da altura em que as proteínas das células no meio marcado são praticamente completamente marcadas (> 99%) com aminoácidos pesados. Adicionar meio fresco ou alterar meios regularmente (a cada 1-3 dias, dependendo do tipo de célula. Para células H9, mudança de meio cada 3 dias). No final de rotulagem, aumentar o volume de cultura (por exemplo, ~ 30 mL) para acomodar o crescimento de mais células.
    NOTA: Determinar célula exacto tempo de duplicação no início da experiência por meio da coloração com azul de tripano e contagem das células.
  3. Infectar as células marcadas com o HIV-1 NL4-3 utilizando padrão de HIV-1 do protocolo de infecção de 13 durante 48 horas. Incubar as células com quantidades apropriadas de vírus com uma multiplicidade de infecção (MOI) em torno de 0,3. Verifique a infecção por HIV-1 por quantificação de p24 dos sobrenadantes de cultura utilizando um kit de antigénio p24 do VIH-1 ELISA. Executar um teste de imunofluorescência 14 para confirmar a infecção bem sucedida de células. Keep crescendo as células não marcadas não marcado em meio sem infecção VIH-1.
  4. Colheita dos sobrenadantes de ambos os grupos no final da infecção (passo 2.1).

2. exossomo Isolamento

NOTA: Através de uma série de passos de ultracentrifugação, exosomal fracções de sobrenadantes de cultura são enriquecidas 15. Executar todos os passos que se seguem a 4 ° C, com um rotor de ultracentrífuga que pode atingir uma velocidade de, pelo menos, 100.000 x g.

  1. Recolhe-se os sobrenadantes das culturas em tubos cónicos de 50 ml, evitando células. Centrifugar as durante 10 minutos a 300 xg para remover as células restantes.
  2. Recolhe-se os sobrenadantes em novos tubos de 50 ml e centrifugar cónicas-los durante 10 min a 2000 xg para remover as células mortas. Transferência resultante sobrenadantes para tubos comerciais de rotor-compatíveis que são capazes de resistir a ultracentrifugação.
  3. Certifique-se de equilibrar os tubos de ultracentrífuga. Centrifugar os tubos durante 30 min a 10000 xg para removerDetritos celulares.
  4. Recolher os sobrenadantes em tubos de ultracentrífuga e centrifugar por 70 minutos a 100.000 x g. Descartar o sobrenadante.
  5. Ressuspender as ração rica em exossoma em 5 ml de PBS fresco. Transferir as soluções para tubos de ultracentrífuga frescos e centrifugar de novo durante 70 minutos a 100000 x g.
  6. sobrenadantes de descarte. Para armazenar os exossomas a longo prazo, voltar a suspender as pelotas em 50 ul de PBS e armazenar a -80 ° C. Alternativamente, vá diretamente para a extração de proteínas, como mostrado abaixo.

3. Extração de Proteínas e Preparação

  1. Dissolver pelotas exosomal isoladas em 100-200 ul RIPA lise e extração tampão com coquetéis inibidores da protease adicionados. O tampão é composto de Tris-cloridrato 25, cloreto de sódio 150 mM, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, e 0,1% de SDS (dodecilsulfato de sódio), a pH 7,6. Os cocktails de inibidores da protease deverá conter uma variedade de inibidores de protease, tais como aprotinina, bestatina, leupeptin, pepstatina A e EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético), que pode inibir uma ampla gama de proteases.
  2. Centrifugar as soluções dissolvidos durante 10 minutos a 13000 xg (4 ° C), e transferir os sobrenadantes para novos tubos compensados ​​microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. Quantificar a concentração de proteína de cada amostra de exossomos usando ácido bicincon�ico (BCA) ou um ensaio Bradford 16.
  4. Misturar uma quantidade igual de proteínas (2 ug) a partir de amostras marcadas e não marcadas e executar a mistura em partes iguais num gel de SDS-PAGE a 4-20%, a 120 mA / 200 V durante 30 min.
  5. Gel mancha com Coomassie Blue seguido de descoloração 17.
  6. Usando uma lâmina de barbear, cortar a faixa amostra a partir do gel. Em seguida, corte a pista gel em 10-15 partes iguais. Colocar cada peça em um tubo de microcentrífuga de 1.5 ml fresco para um total de 10-15 tubos.
  7. Imergir cubos em mM NH 4 HCO 3 25 em 50% de acetonitrilo, vórtice, e descartar os sobrenadantes. Repita duas vezes. Secocubos em um concentrador de vácuo 18, 19.
  8. Reidratar cubos com ditiotreitol 10 mM (DTT), vortex e centrifugar brevemente. Incubar a 56 ° C durante 1 h. sobrenadante de descarte.
  9. Mergulhe os cubos de gel em 55 mM de iodoacetamida, vortex e centrifugação. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 45 min. sobrenadante de descarte.
  10. Mergulhe os cubos em 25 mM NH 4 HCO 3, vortex, rotação, e descartar o sobrenadante.
  11. Mergulhe os cubos em mM NH 25 4 HCO 3 em 50% de acetonitrilo, vortex e centrifugação. Repetir 3,9 e 3,10.
  12. Secam-se os cubos de um concentrador de vácuo. Adicionar tripsina modificada de grau de sequenciação de 25 uL em 25 mM NH 4 HCO 3, incubar a 4 ° C durante 30 min, e descartar o excesso de solução. Imergir cubos em mM NH 4 HCO 3 25 sem tripsina, e incubar durante a noite a 37 ° C.
  13. Resumidamente girar cubos para baixo e transferir o péptido resultante adicionalCT para um novo tubo. Adicionar 30 ul de ácido fórmico a 5% em acetonitrilo a 50% para os cubos, vortex durante 30 min, e centrifugação. Combinar o sobrenadante com o extracto. Secam-se os extractos de péptido com um concentrador de vácuo a menos de 5 ul.
  14. Enviar amostras para instalação de núcleo de espectrometria de massa para análise LC-MS / MS. A análise de dados MS, que pode ser gerada a partir de software de código aberto, geralmente inclui um número de registo para cada proteína identificada, rotulados rácios / não marcados eo número de péptidos únicos identificados.

4. Verificação Western Blotting

NOTA: Western blotting é recomendado para verificar os resultados de espectrometria de massa.

  1. Siga os protocolos de mancha ocidental padrão e garantir que as quantidades iguais de proteína de cada grupo são carregados. Use anticorpos contra as proteínas de interesse (por exemplo, anexina A5, cadeia B da lactato desidrogenase) identificados por MS. detecção de transferência de Western, juntamente com Analysi densitometrias, pode reafirmar que a identificação de proteínas MS e quantificação estão corretas.

5. Análise de Dados proteômica

NOTA: A avaliação de qualidade de dados, pré-tratamento de dados, cálculo e determinação de candidatos significativas de proteínas são feitas separadamente para cada MS replicar. Uma vez que análises anteriores são concluídas, os dados analisados de repetições são comparados e combinados 6, 20, 21.

  1. Avaliar a qualidade dos dados de MS.
    1. Em primeiro lugar, LOG2 transformar o SILAC-MS rotulados / rácios não marcados de proteínas quantificados em um programa de planilha.
    2. Na elaboração de gráficos científicos e software estatístico, o grupo dos rácios em 40-100 lixeiras razão e traçar o número de rácios por bin para gerar um histograma. A distribuição normal dos histograma indica boa qualidade de dados MS 6. Faça este passo para todos os MS replica.
  2. Para aumentar a confiança e precisão dos rácios de peptídeos MS, considere remover proteínas que têm menos de dois peptídeos quantificados.
  3. Para determinar os candidatos de proteína significativamente cima e para baixo-regulado, utilize os seguintes passos para calcular limiares de importância 22.
    1. Na elaboração de gráficos científica e de software estatístico, gerar uma regressão não-linear ou de ajuste de curva para os dados da distribuição de frequência. Esta etapa produz valores que podem ser usados ​​para calcular os valores de corte. Calcular os valores de corte em mediana ± 1,96 σ para os limites de confiança de 95% ou 2,56 σ para os limites de confiança de 99%.
      NOTA: Os detalhes específicos do cálculo dos cortes pode ser encontrada em Emmott et al. 22.
    2. Selecionar os candidatos de proteínas cujas proporções são ou maior que 1,96 (ou 2,56) desvios padrão acima da mediana (sobre-expressos de forma significativa) ou menor que 1,96 (ou 2,56) desvios padrão abaixo da mediana (significativamente sub-expresso).
  4. Compare as repetições dos candidatos significativas acima identificado para atingir a consistência. Garantir que cumpram os seguintes critérios para passar esta etapa de seleção final: os candidatos devem ser consistentemente identificados em todas as repetições; e repetições de um candidato deve ser coerente com a sua direcção de regulação (de preferência, pelo menos, 2 de 3 repetições de um candidato deve ser ou regulado para cima ou para baixo-regulado).
  5. Finalize dados para os candidatos que preencham os critérios acima mencionados pela fusão dos dados dos seus repetições.

6. Bioinformatics Verificação e Caracterização

NOTA: As informações existentes genômica e bioinformática oferece uma riqueza de informações para quase todas as proteínas. A mineração de dados e análise bioinformática em que a informação pode ajudar na obtenção de uma grande quantidade de insights sobre a propriedade e as funções dos candidatos significativos. este process é normalmente necessário para projetar adequados a jusante experimentos wet-lab.

  1. Usando seus números de acesso do GenBank ou IDs UniProt, pesquisa nos candidatos em bancos de dados exossomo correntes (Exocarta 23, Evpedia 24) para verificar se as proteínas candidatas tenham sido previamente encontrado em exosome. Esta etapa adiciona uma camada de confiança de que os candidatos são, de facto, em exossomos.
    1. http://www.exocarta.org/ Access, clique em "Consulta" e de entrada ou o nome / número de adesão gene ou proteína. A página de resumo aparecerá e as provas em exosome será mostrado, desde se houver qualquer.
  2. Pesquisa os candidatos contra o HIV-1 e a proteína humana interação com o banco 25. Em alternativa, procure os bancos de dados específicos que podem fornecer informações sobre a interação das proteínas candidatos e a condição de teste.
    1. Acessar o banco de dados no www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInterações. Na data de entrada 'nome de domínio de proteína ", digite os nomes dos candidatos ou números de acesso e clique em pesquisar. Os resultados da pesquisa podem fornecer informações sobre as interações entre o HIV-1 e os candidatos de proteína, e sugerir qual dos candidatos pode ser verdadeiramente HIV-1 associado.
  3. Import GenBank números de adesão, ou UniProt IDs dos candidatos em software de análise de GO (como FunRich, enriquecimento funcional ferramenta de análise 26) e execute o software.
    1. Faça o download do software no http://www.funrich.org/. Após a instalação, abra o software, em análise enriquecimento, clique em "Adicionar conjunto de dados", e fazer o upload da lista de proteína / genes. Em seguida, selecione o tipo de gráfico para visualizar a análise GO.
      Observação: Vá resultados da análise serão visualizados na forma de gráficos de pizza. Este passo nos ajuda a ter uma visão global de associados com os candidatos nas áreas de Processo Biológico (BP), Cellular Componente (CC), e função molecular (MF).
  4. Acesso DAVID em http://david.ncifcrf.gov/ 27, clique no botão "ferramenta de anotação funcional" em seu site. Digite a lista de candidatos, selecionar o "Identificador" do gene, tais como o "UniProt ID", selecione "Lista de Gene" e pesquisa. Os termos enriquecidos GO, p-valores e outros parâmetros podem ser encontrados clicando na página "Resumo de anotação Resultados" na categoria "Gene_Ontology".
  5. Para investigar possíveis interações dos candidatos com outras proteínas, usar banco de dados STRING abertamente acessíveis 28 para elucidar interações proteína-proteína potenciais e possíveis vias bioquímicas.
    NOTA: GO Análise e anotação funcional (Seção 6,3-6,4) também pode ser realizada utilizando o software mais recente STRING.
    1. Acessar o banco de dados no http://string-db.org/. Introduza o ID proteína ou sequência para as s designadoscaixa de earch e selecionar as espécies corretas para análise. Clique em "Procurar". Os resultados lhe dará informações sobre ambas as associações diretas (físicas) e indiretos (funcionais). Os dez melhores jogos conhecidos para o candidato exosomal será exibido e deve ser considerado para seleção de candidatos significativo.
      NOTA: uma grande quantidade de informação associada com os candidatos podem ser analisados ​​usando as etapas acima. Os candidatos mais significativos podem ser escolhidos para posterior análise molecular e bioquímica a jusante.

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Resultados

Figura 1A é um fluxograma descrevendo o procedimento de marcação SILAC 21. A fim de purificar os exossomos, as amostras devem ser girado para baixo através de centrifugação. A Figura 1B mostra os passos de purificação exossomo por ultracentrifugação de série 21. Uma vez purificado, os exossomas estão sujeitas a análise proteomic experimental tal como descrito no procedimento.

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Discussão

Nos procedimentos descritos no presente documento, demonstramos a aplicação da técnica SILAC para investigar o efeito de infecção por HIV-1 no proteoma exosomal hospedeiro. Inicialmente, as células infectadas e não infectadas com HIV-1 são diferencialmente marcado com isótopo. Os exossomas marcados diferencialmente são então purificados antes de realizar a extracção de proteínas. Em seguida, a espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida é utilizada para analisar o proteoma exosomal. Finalmente, os dados...

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Divulgações

Os autores declararam não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um suplemento de ARRA ao tempo de vida / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 e K24HD080539 a BR. Este trabalho também foi apoiado por expectativa de vida Fundo Pilot Research (# 701- 5857), Rhode Island Medical Foundation Grant Research (# 20.133.969) e NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) para ML. Agradecemos James Myall e Vy Dang para obter ajuda com a preparação do manuscrito e figura.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Linha celular H9ATCCHTB-176
Azul de tripanoThermo Fisher15250061
kit de ensaio MTTThermo FisherV13154
Soro bovino fetal dialisado (FBS)Thermo Fisher26400044
Kit de quantificação de proteína SILAC • RPMI 1640Thermo Fisher89982Versão DMEM (89983)
L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 para SILACThermo Fisher88434
L-Lisina-2HCl, 13C6 para SILACThermo Fisher88431
HIV-1 NL4-3NIH Programa de Reagentes para AIDS2480
Alliance HIV-1 p24 Kit ELISA de antígenoPerkinElmerNEK050001KT
Centrífuga refrigerada de super-velocidadeEppendorf22628045
Ultracentrífuga refrigeradaBeckman Coulter363118Deve ser capaz de atingir 100.000 x g
50 mL Tubos de centrífuga cônicosThermo Fisher14-432-22
Tubos de UltracentrífugaBeckman Coulter326823
SW 32 Ti RotorBeckman Coulter369694
tampão RIPAThermo Fisher89900
Inibidores de ProteaseCoquetéis Thermo Fisher  78430
ThermoMixer 5384000020Eppendorf
 Thermo Fisher23250
EspectrofotômetroBiorad1702525
SDS PAGE Aparelho de gelThermo FisherEI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini GelsNovexXV04200PK20
Reagente de coloração em gelSigma AldrichG1041
Grau de Sequenciamento Tripsina ModificadaPromegaV5111
Concentrador SpeedVacThermo FisherSPD131DDA
Anticorpo para anexina humana A5Abcamab14196
Anticorpo para lactato humano desidrogenase B cadeiaAbcamab53292
Software Gráfico e EstatísticoSystat;SigmaPlot Ou GraphPad Prism
Pacote de software de proteômica quantitativaMax Planck Institue of BiochemistryMaxquant 
Software e bancos deVários fornecedoresConsulte o texto principal para obter detalhes
Kit de Ensaio de Proteína BCA dados

Referências

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