A remoção do biofilme uso de aerossóis de dióxido de carbono sem a purga de azoto

Resumo

Os biofilmes em superfícies podem ser removidos de forma eficaz e rápida usando um jato periódico de aerossóis de dióxido de carbono sem purga de nitrogênio.

Resumo

Os biofilmes podem causar sérias preocupações em muitas aplicações. Eles não apenas podem causar perdas econômicas, mas também podem representar um risco à saúde pública. Portanto, é altamente desejável remover biofilmes das superfícies. Muitos estudos sobre a limpeza de aerossóis de CO₂ empregaram purgas de nitrogênio para aumentar a eficiência da remoção de biofilme, reduzindo a condensação de umidade gerada durante a limpeza. No entanto, neste estudo, jatos periódicos de aerossóis de CO₂ sem purgas de nitrogênio foram usados para remover biofilmes de Pseudomonas putida de superfícies de aço inoxidável polido. Os aerossóis de CO₂ são misturas de CO₂ sólido e gasoso e são gerados quando o gás CO₂ de alta pressão é expandido adiabaticamente através de um bico. Esses aerossóis de alta velocidade foram aplicados a um biofilme que havia sido cultivado por 24 horas. A eficiência de remoção variou de 90,36% a 98,29% e foi avaliada medindo-se a intensidade de fluorescência do biofilme, pois o tempo de tratamento variou de 16 segundos a 88 segundos. Também realizamos experimentos para comparar as eficiências de remoção com e sem purgas de nitrogênio; As eficiências de remoção de biofilme medidas não foram significativamente diferentes entre si (teste T, p > 0,55). Portanto, esta técnica pode ser usada para limpar várias superfícies biocontaminadas em um minuto.

Introdução

Os biofilmes são estruturas complexas da comunidade bacteriana nas quais as células bacterianas são incorporadas em matrizes autoproduzidas de substâncias poliméricas extracelulares, mantidas juntas e protegidas do ambiente externo. Os biofilmes podem representar um risco à saúde pública e causar perdas econômicas porque podem se formar em várias superfícies, incluindo materiais e dispositivos de implantes médicos, equipamentos de processamento de alimentos e trocadores de calor. De fato, descobriu-se que os biofilmes estão associados a 65% de todas as doenças infecciosas bacterianas em humanos, de acordo com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Autoclaves e desinfetantes como o cloro têm sido geralmente usados para a inativação de biofilmes. No entanto, o uso de uma autoclave é limitado para superfícies que não suportam vapor de alta temperatura nem podem ser colocadas na autoclave. Os desinfetantes não são adequados para superfícies sensíveis ao tratamento químico ou propensas a coletar produtos tóxicos de oxidação². Além disso, o biofilme não deve apenas ser inativado, mas também removido para evitar a fixação de novas células na superfície, formando assim um novo biofilme³. No entanto, é difícil remover biofilmes usando métodos baseados em cisalhamento de fluido viscoso porque a velocidade do fluxo perto da superfície é quase zero e a força de cisalhamento geralmente não pode superar as forças adesivas de substâncias de tamanho mícron e submícron. Além disso, a matriz do biofilme é conhecida por atuar como uma barreira física e química¹.

Muitas técnicas físicas e mecânicas foram desenvolvidas para remover biofilmes de superfícies, incluindo vibração ultrassônica¹, correntes elétricas⁴, irradiação a laser⁵ e sprays de água de alta pressão⁶. Cada técnica tem seus próprios prós e contras. A vibração ultrassônica e a corrente elétrica podem ser usadas para controlar a formação de biofilme; no entanto, eles requerem uma configuração particular e superfícies condutoras, respectivamente, exigindo tensão de cisalhamento adicional^{1, 4}. A irradiação a laser pode ser aplicada a uma área limitada e a superfícies duras; no entanto, algumas células vivas e mortas permanecem na superfície⁵. Sprays de água de alta pressão removem efetivamente os biofilmes; no entanto, seu alto impulso pode causar danos aos substratos moles⁶.

A remoção de biofilme usando aerossóis de CO₂ foi proposta anteriormente. Tem mostrado resultados promissores, com altas eficiências de remoção em um curto espaço^{de tempo 7-11}. Os aerossóis de CO₂ são gerados pela expansão adiabática de um gás CO₂ de alta pressão através de um bico e são aplicados nas superfícies contaminadas com um biofilme. Esta técnica de limpeza utiliza a transferência de momento de partículas sólidas de CO₂ e a ação solvente dos líquidos de CO₂ derretidos, seguida pela força de cisalhamento aerodinâmica do gás CO₂ ¹². Em comparação com jatos de gás N₂ de alta pressão, os jatos de aerossol de CO₂ na mesma pressão de estagnação são muito mais eficazes na remoção de biofilmes de E. coli ⁷. Além disso, embora o momento do CO₂ sólido que é entregue às bactérias seja consideravelmente alto, o momento do jato de aerossol total aplicado à superfície sólida é substancialmente menor do que o dos jatos de água. Portanto, a limpeza sem danos é possível usando esta técnica de aerossol de CO₂.

Neste protocolo, jatos periódicos de aerossóis de CO₂ sem purgas de nitrogênio foram usados para remover biofilmes de Pseudomonas putida de uma superfície de aço inoxidável polido. De fato, as purgas de nitrogênio têm sido usadas em muitos estudos de aerossóis de CO₂ para aumentar a eficiência de remoção, reduzindo a condensação de umidade gerada durante a limpeza, embora o aquecimento com placa quente ou lâmpadas infravermelhas e o emprego de caixas secas também tenham sido adotados¹². A formação do biofilme superficial e os procedimentos de limpeza otimizados são descritos abaixo. A eficiência de remoção foi avaliada medindo-se a intensidade de fluorescência do biofilme na superfície.

Protocolo

1. Preparação de Superfície para formação de biofilme

1. Corte 1 mm de espessura 304 chapas de aço inoxidável em chips (10 × 10 mm ²⁾ com um cortador mecânico.
2. Executar a limpeza ultra-sónica das fichas em acetona, metanol, e água desionizada (DI) sequencialmente água durante 10 min cada. Usar um recipiente resistente a solventes, feita de substâncias tais como vidro, para remover a contaminação orgânica.
3. Lave as batatas fritas com água de fluxo DI para 3-5 seg.
4. Secam-se as batatas fritas usando o fluxo de gás _N2 durante 3-5 seg.

2. Preparação de uma cultura bacteriana

1. Tome um P. putida KT2440 (gentilmente cedido pelo Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Coreia do Sul) Stock armazenado em um -80 ° C congelador.
2. Descongelar à temperatura ambiente após 1 min, e a camada de topo da solução estoque congelada transforma a lama. Imergir uma malha na camada derretida da solução estoque.
3. Utilize este loop para raia as bactérias em um Luriaplaca -Bertani (LB) contendo 1,5% de agar.
4. Incubar a placa durante a noite a 30 ° C para crescer as colónias bacterianas.
5. Escolher uma única colónia da placa utilizando um loop fresco.
6. Inocular 10 ml de caldo de LB num tubo cónico de 50 ml, com o loop contendo a colónia bacteriana único.
7. Incubar o caldo num incubador com agitação durante 16 horas a 30 ° C e 160 rpm.

3. formação de biofilme na superfície

1. Pegue cada uma das fichas preparadas com uma pinça e mergulhá-los em 70% de etanol 5 vezes por 1-2 segundos cada, para esterilizar a superfície de cada chip. Certifique-se de que os chips são realizadas com uma pinça durante o mergulho.
2. Mergulhe cada chip em água DI autoclavado e em caldo LB sequencialmente, 5 vezes para 1-2 segundos cada, para remover o etanol remanescente.
3. Coloque esses chips em placas de cultura de 6 poços com 2 chips e 5 ml de caldo LB por poço.
4. Dilui-se a cultura bacteriana até que a concentração no caldo LB atinge8 x 10 ⁸ culas / mL (densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda: ~ 0,8).
5. Inocular cada poço com 50 uL da cultura bacteriana diluída.
6. Incubar as placas a 30 ° C sem agitação durante 24 horas, para a formação de biofilmes.

Lavagem 4. CO ₂ Aerosol

1. Mergulhe as batatas fritas em forma de biofilme em tampão de acetato de amónio 10 mM (voláteis) 5 vezes para remover frouxamente ligado e bactérias planctônicas.
2. Secar esses chips em uma cabine de segurança biológica, onde o ar flui suavemente.
3. Imediatamente após secagem, colocar um chip no local de carregamento, que é de 20 mm a partir do bico de CO ₂ ao longo do eixo do jacto. Inclinação do eixo do jacto para um ângulo de 40 °.
4. Defina as pressões de estagnação de CO ₂ e N ₂ de gás para 5,3 MPa e 0,7 MPa, respectivamente, utilizando os reguladores de pressão de gás.
5. Aplicar o jacto de aerossol sobre a parte central do chip. Aerossóis brancas, incluindo o _CO2 sólido deveser visível. "Ligar" a válvula solenóide de CO ₂ durante 5 segundos e, em seguida, transformá-lo "off" por 3 segundos (ciclo: 8 seg) periodicamente, utilizando um interruptor controlado manualmente. Se uma purga de azoto necessita de ser usado, ligar a válvula de solenóide para um fornecimento contínuo de N _2.
6. Trate os chips com CO ₂ aerossóis para 16, 40 e 88 segundos, com e sem purgas de azoto. Reter fichas sem tratamento como controlos negativos.

5. Análise para Eficiência de Remoção

1. Prepare 1 mM ácido mancha de fluorescência nucleico verde (comprimento de onda de excitação / emissão: 480/500 nm) em água DI para corar células bacterianas no controle e batatas fritas tratados com aerossol.
2. Coloque as fichas na solução de coloração.
3. Incubar as batatas fritas em uma incubadora, sem luz, a 37 ° C durante 30 min.
4. Após a incubação, lave as batatas fritas com água de fluxo DI para remover corante fluorescente excessiva.
5. Seque o wi fichasth fluxo de gás _{de N2.}
6. Tome fluorescência imagens microscópicas de 5 campos aleatórios de vista (321 × 240 mm ²⁾ para cada chip usando um microscópio de epifluorescência, uma lente objetiva de 40X, e uma câmera CCD.
7. Obter a intensidade de fluorescência para cada imagem usando um software de processamento de imagem, tais como ImageJ. No ImageJ, use a função "Background Subtrair" no menu "Processos", e selecione "densidade integrada" na janela "Definir Medidas" no menu "Analisar". Faça o "Medição" no menu "Analisar" para obter a intensidade de fluorescência.
8. Calcula-se a eficiência de remoção de biofilme de acordo com a seguinte fórmula:% 100 x (I de chips de controle - I de chips tratados) / (I de chips de controle), onde I é a intensidade de fluorescência calculado.
9. Obter a média de eficiência na remoção e desvios-padrão. use pelopelo menos 4 chips para cada caso.

Resultados

CO ₂ aerossóis foram usadas para remover o P. putida biofilmes de superfícies SUS304 (Figura 1). A maior parte das superfícies foram cobertas com o biofilme, após 24 h de crescimento. A maior parte do biofilme foi removido utilizando o CO ₂ aerossóis (Figura 2). Como esperado, a Figura 3 mostra um aumento na eficiência de remoção do biofilme como o CO ₂ tempo de tratamento de aerossol aumentou. Para o tempo de tratamento de 88 s...

Discussão

Anteriormente, realizamos estudos de otimização na pressão do gás CO₂ , ângulo do jato e distância da superfície sólida na limpeza com aerossol de CO₂ ⁷. Diferentemente de nossos estudos anteriores, no presente estudo, uma purga de nitrogênio não foi incluída no aerossol (Figura 1). Além disso, o aço inoxidável 304 foi utilizado neste protocolo, por ser um dos aços inoxidáveis mais comuns e amplamente utilizado na indústria alimentícia. A superfície polida é benéfica para...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aço inoxidável 304	Steelni (Coreia do Sul)		Polidos e cortados em cubos
Limpador ultrassônico	Branson (EUA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (EUA)	244620	500 g
	Agar Becton, Dickinson and Company (EUA)	214010	500 g
6 poços placa de cultura	SPL Life Sciences (Coreia do Sul)	32006
Tampão de acetato de amônio	Sigma-Aldrich (EUA)	667404	10 mM
Unidade de gás dupla	Applied Surface Technologies (EUA)	K6-10DG	Um bico para CO2 gás e 8 bicos para gás N2
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (EUA)	Excitação Invitrogen	: 480 nm Emissão: 500 nm
Microscópio de epifluorescência	Nikon (Japão)	Lente objetiva Eclipse 80i
40X	Nikon (Japão)	Plan Fluor	NA: 0.75
	Fotometria (EUA)	Cool SNAP HQ2	Monocromático

Câmera CCD