Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Resumo

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

Resumo

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor incomum composto por proliferação de células fusiformes que é iniciado pela infecção das células endoteliais (CE) com KSHV e desenvolve-se mais frequentemente no cenário de imunossupressão. Apesar de décadas de pesquisa, tratamento ideal de KS permanece mal definido e os resultados clínicos são especialmente desfavoráveis em recursos limitados. Lesões do KS são conduzidas pela angiogênese patológica, inflamação crônica e mixomas, e vários em vitro celular cultura modelos foram desenvolvidos para estudar estes processos. KS surge a partir de células infectadas KSHV de origem endotelial, então CE-linhagem células fornecem os mais apropriado em vitro substitutos do precursor do fuso celular. No entanto, porque CE têm uma duração limitada em vitro , e que os mecanismos oncogênicos empregados pelo KSHV são menos eficientes do que aqueles de outros vírus oncogenicidade, tem sido difícil de avaliar os processos de transformação primária ou telomerase-imortalizada EC. Portanto, foi desenvolvido um modelo de romance cultura baseada em CE que suporta prontamente transformação após infecção com KSHV. Gravidez ectópica expressão dos genes E6 e E7 do vírus do papiloma humano tipo 16 permite a cultura prolongada de idade - e passagem-combinada mock e KSHV-infectados CE e apoia o desenvolvimento de um verdadeiramente transformado (i.e., oncogenicidade) fenótipo em culturas de células infectadas . Este modelo tractable e altamente reprodutível de KS tem facilitado a descoberta de várias vias de sinalização essenciais com elevado potencial para a tradução em ambientes clínicos.

Introdução

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor de angioproliferativas multi focal afetando sites dérmicas, da mucosa e viscerais que se desenvolve mais comumente na configuração de imunossupressão avançada¹. Quatro formas epidemiológicas têm sido descritas: clássico, uma forma indolente que normalmente afeta idosos do património do Mediterrâneo e do Médio Oriente; iatrogênica, resultantes de tratamento com imunossupressores após um transplante de órgão; epidemia, um câncer AIDS-definindo; e endêmicas, uma forma de HIV independente comum em crianças em regiões endêmicas na África. Com o advento dos regimes de drogas anti-retrovirais combinação eficaz para o ....

Protocolo

Nota: todos os procedimentos descritos no presente protocolo devem ser realizados sob condições de BSL-2.

1. preparação de estoque KSHV

1. buffer de TNE preparar: dissolver 292,24 mg EDTA em ddH ₂ O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Dissolver 605,7 mg Tris em ddH ₂ O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Combine as soluções de EDTA e Tris, adicionar 4,38 g NaCl, ajustar volume final de 500 mL, filtrar esterilizar e armazenar a 4 ° C ^.
2. Cultura o KSHV-positivo, EBV-negativo efusão primária linfoma célula linha BCBL-1 numa incubadora umidificado em 37 ° C, mais 5% de CO ₂ em RPMI sup....

Resultados

A morfologia da CE primário é classicamente descrita como "pedra do godo", e esta morfologia não é alterada pela expressão do papilomavírus E6 e E7 genes (figura 1A). Expressão dos genes E6 e E7 sozinhos não induz um fenótipo transformado; assim, as células são suscetíveis a entrar em contato com a inibição e cessarão dividindo ao atingir a confluência na cultura. As células serão no entanto proliferam e regenerar a confluência tripsinização e replating em uma densidade m.......

Discussão

Mixomas é um processo de várias etapas que contorna precauções importantes dentro de um organismo de³⁶. Como lesões do KS existem ao longo de um espectro de inflamação crônica a verdadeiras sarcomas, elucidação de determinados processos fisiopatológicos mediada por KSHV requer que ser realizados alguns estudos em modelos de cultura de células que suportam transformação⁹. Note-se que a perda da inibição de contato e crescimento dependente de ancoragem, fenótipos indicativos .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células BCBL-1	Programa de reagentes NIH AIDS	3233
Células PA317	ATCC	CRL-2203
Células endoteliais microvasculares dérmicas neonatais	Lonza	CC-2505
EBM-2 Basal Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
anti-KSHV LANA / ORF 73	Avançado Biotechnologies	13-210-100
TrypLETMExpress, sem vermelho de fenol	ThermoFisher	12604013
RPMI
DMEM
PBS com cálcio e magnésio