Abstract
En metod för att observera och kvantifiera parningsbeteende tallvedsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, bildades under ett stereomikroskop. För att förbättra den passande effektivitet B. Xylophilus och öka chanserna för parning observation, jungfru vuxna odlades och användes för undersökningen. Ägg erhölls genom att hålla nematoderna i vatten och gör det möjligt för kvinnor att lägga ägg under 10 min. De andra Stadium (J2) synkroniserades genom inkubation av ägg för 24 timmar vid 25 ° C i mörker, och den tidiga J4 erhölls genom odling av J2 med gråmögel, Botrytis cinerea, för ytterligare 52 timmar. Vid denna tidpunkt, kan de flesta J4 nematoder vara klart åtskilda som manliga eller kvinnliga använda sina könsorgan morfologi. Den manliga och kvinnliga J4 samlades och odlades separat i två olika petriskålar under 24 timmar för att få jungfru vuxna nematoder. En jungfru hane och en jungfru kvinnliga parades i en droppe water i brunnen av en konkav slid. Parningsbeteende filmades med en videokamera under ett stereomikroskop. Hela perioden av parningsprocessen var 82,8 ± 3,91 min (medelvärde ± SE) och kan delas in i 4 olika faser: sökning, kontakt, kopulerande och kvardröjande. De genomsnittliga minuters varaktighet var 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 och 7,2 ± 0,5, respektive. Elva under beteenden beskrevs: cruising, närmar sig, möter, röra, förena, lokalisera, fästa, utlösning, separering, passivitet, och roaming. Intressant nog var uppenbart inom sexuell konkurrens observerades när en hona grupperades med 3 hanar eller en hane med 3 tikar. Detta protokoll är användbar och värdefull, inte bara för att utreda parningsbeteende B. xylophilus, men även att agera som en referens för etologiska studier av andra nematoder.
Protocol
1. Förvärv av Virgin Adult Nematoder
- Tallvedsnematoden isolat och odlingsbetingelser
OBS! B. xylophilus isolera Nxy61 ursprungligen extraherat från en sjuk Pinus massoniana i Ningbo området i provinsen Zhejiang i Kina.- Förbered potatisdextrosagar (PDA, se tabell för material) plattor för odling Botrytis cinerea.
- För ympning, slå en bit av svampmatta med en diameter på 10 mm från en B. cinerea matta och placera den i mitten av en ny PDA-platta. Kultur B. cinerea för 5 d vid 25 ° C i mörker.
- Odla furu nematoder i förberedda petriskål innehållande B. cinerea vid 25 ° C i mörker.
- Förvärv av B. xylophilus ägg
- Placera en fastklämd gummirör under en tratt och hålla den förberedda kanalen i ett rack för att monteraBaermann tratt apparat. Placera två skikt av filterpapper i stället för gasväv i munnen av tratten.
- Överför svamp kulturer tratten setup och tillsätt vatten tills svampmattan är nedsänkt. Vänta 2 h, och nematoder kommer att komma ut från svampkultur, korsa filterpapper och slå sig ned i den lägsta delen av Baermann tratt.
- Samla första par droppar vatten från botten av röret i en 15 ml rör och samla nematoder genom att långsamt släppa klämman på röret.
- Centrifugera ovanstående samlingar på 3000 xg under 2 minuter vid RT.
- Ta bort det övre skiktet av vatten med en pipett och återsuspendera den med 1 ml sterilt dubbeldestillerat (dd) H 2 O.
- Med en pipett ovan resuspension till ett nytt glas petriskål (6 cm diameter). Tillsätt 3 ml sterilt dd H2O till petriskålen för att säkerställa att nematoderna kan simma fritt.
- Håll nematoder i glass petriskål under 10 min vid 25 ° C i mörker. Ägg kommer att läggas av gravida kvinnor. På grund av deras glykoprotein yta, kommer äggen fastnar på botten av glaset petriskål.
- Avlägsna vattnet och maskar noggrant, utan att störa äggen. Tillsätt 3 ml sterilt dd H2O till glaset petriskål omedelbart för att förhindra att äggen från att torka ut.
- Upprepa steg 1.2.8 3x för att avlägsna alla larver och vuxna, och erhålla de rena ägg. Lägg en extra 2 ml (5 ml totalt) sterilt dd H2O till petriskål.
- Förvärv av fjärde Stadium (J4 larver)
- Hatch de insamlade äggen under 24 timmar i mörker vid 25 ° C för att erhålla J2 larver.
- Överför J2 larverna med en pipett till ett 15 ml rör, centrifugera vid 3000 xg under 2 minuter, och ta bort det övre skiktet av vatten.
- Suspendera J2 larver med 200 mikroliter sterilt dd H2O, och sedan överföra dem tillPDA platta innehållande B. cinerea.
- Kultur J2 larver under 52 timmar vid 25 ° C i mörker. Vid denna tidpunkt, kommer de flesta J2 larver har utvecklats till ett tidigt skede av J4 larver.
- Förvärv av jungfru vuxna nematoder
- Förbered en nål för att plocka upp nematoder genom att rita en glaskapillär efter uppvärmning den över en alkohol-brännare.
OBS: Spetsen på denna kapillär nål behöver oftast vara 50 pm i diameter, ungefär kroppen bredden av en vuxen nematod, så att den kan användas som ett verktyg för att plocka upp en enda nematod. - Montera en Baermann tratt och extrahera nematoder från svampkulturer för 2 timmar, såsom beskrivs i steg 1.2.1 - 1.2.3.
- Överföra J4 med vatten i en ren petriskål.
- Observera nematoderna under ett stereomikroskop och skilja mellan män och kvinnor med genital morfologi, som beskrivs av Mamiya och Kiyoharas 8 (figur 1 OBS: Det finns fler kvinnor än män, med andelen kvinnor vid 60 - 70%. Den kvinnliga vulva är naturligtvis skiljer sig från den manliga spikler. Jämfört med vuxna, är spikler eller vulva i tidig J4 mindre, men de kan fortfarande vara lätta att se och framstående. Nematoden alltid är i rörelse i vattnet, vilket ibland ökar svårigheten att skilja hanar och honor.
- Kultur J4 larver i ytterligare 24 timmar vid 25 ° C i mörker.
OBS: Alla nematoderna bör utvecklas till vuxna, men eftersom de är oparade, de betraktas som jungfru vuxna. - Montera två Baermann trattar och extrahera jungfru vuxna från svampkulturer för 2 timmar, såsom beskrivs i steg 1.2.1 - 1.2.3, och överföra jungfru vuxna män och kvinnor i två separata, rena petriskålar.
2. Observation och videoinspelning av parningsbeteende
- Förbereda flera konkava objektglas och tillsätt 200 | il av steril dd H2O till var och en av sina brunnar.
- Plocka upp den förberedda jungfru vuxna manliga eller och hona med en kapillär nål och sätta bara en nematod i vattnet i varje konkav bild.
- Håll jungfru vuxna inuti brunnen under 1 timme för att låta dem att anpassa sig till den nya vattenmiljö.
- Para ihop en jungfru manligt och kvinnligt genom att överföra en av dem från en brunn till en annan med hjälp av en pipett.
- Observera parningsbeteende 1♀ + 1♂ spel i konkava glider under ett stereomikroskop.
- För att analysera parning effektivitet jungfru vuxna, beräkna deras parning framgång (R) och jämföra det med att slumpmässigt utvalda vuxna par. Beräkna R såsom den procentuella andelen av replikat där parning observerades jämfört med det totala antalet replikat studerat.
- För att samla in data för kvalitativ och kvantitativ analys, filma parningsbeteende med hjälp av video mikroskopi. Normalt är hela parningsprocessen, från den tidpunkt då de nematoder placeras i brunnen av den konkava glid till det ögonblick när de flyttar bort efter parning, avslutas inom två timmar. Därför registrera parning processen kontinuerligt under åtminstone 2 h som en kopia. Komplett minst 30 replikerar i totalt för varje kombination.
OBS: Lägg mer sterilt dd H2O (vanligtvis 50 mikroliter) var 0,5 h till brunnen för att kompensera för avdunstning under inspelningsprocessen.
3. Datainsamling
- Visa alla videoklipp försiktigt på en datorskärm och karakterisera under beteenden kvalitativt.
- Mät längden på parning med hjälp av the frame-by-frame funktionen av videobandspelaren. Manuellt subtrahera starttiden från slutpunkten.
- För 1♀ + 1♂ kombination, analysera varje videoinspelning och mäta varaktigheten av följande händelser:
- Mät längden på sökning (dvs tiden från det att kvinnliga och manliga införs i brunnen av den konkava glid till dess att de möter och i kontakt med varandra).
- Mäta varaktigheten av kontakt (dvs, tiden från den första kontakten till det ögonblick när hanen är exakt positionerad vid honans vulva för första parning).
- Mät längden på kopulera (dvs tiden från det att man är exakt positionerat på honans vulva tills han glider ner från honans kropp efter utlösning). Obs! Vissa nematoder kan para sig flera gånger under två timmar. I sådana fall mäta varaktigheten av parning från den första parning till slutet av den last en, inklusive tiden däremellan.
- Mät längden på kvardröjande (dvs perioden efter parning till manliga och kvinnliga simma bort från varandra och är separerade med ett avstånd på mer än nematoderna "kroppslängd (vanligtvis 1 mm)).
- Räkna parning frekvens och varaktighet varje parning och den genomsnittliga löptiden för alla kopulationer i 2 timmar för var och en av de olika kombinationerna (dvs 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ och 1♀ + 3♂).
- Beräkna parning framgång för den första kontakten (P) för de olika kombinationerna som andelen framgångsrika parning efter den första kontakten, som genomförs omedelbart och utan avbrott. I kontaktfasen kan flera kontakter observeras innan själva parning.
- När avståndet mellan två individer är mer än kroppen längd, överväga en kontakt för att vara över. För en kopia, spela P som 100% när parning is observerade omedelbart efter den första kontakten, utan avbrott, eller 0,00%, om ingen parning observerades eller om det fanns parning men efter två eller fler kontakter.
OBS: Det fanns 30 replikat för varje kombination som beskrivs här.
- När avståndet mellan två individer är mer än kroppen längd, överväga en kontakt för att vara över. För en kopia, spela P som 100% när parning is observerade omedelbart efter den första kontakten, utan avbrott, eller 0,00%, om ingen parning observerades eller om det fanns parning men efter två eller fler kontakter.
- Förbered en nål för att plocka upp nematoder genom att rita en glaskapillär efter uppvärmning den över en alkohol-brännare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parnings framgång (R) av jungfru vuxna var 86,67% i genomsnitt, vilket var betydligt högre än för de slumpmässigt utvalda vuxna: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figur 2). Detta fynd tyder på att det är lättare att observera parningsbeteende B. xylophilus med jungfru vuxna än med slumpmässigt utvalda vuxna.
När en hane parades med en hona, hela parningsprocessen varade 82,8 minuter i genomsnitt. Hela processen kan beskrivas med fyra olika faser: att söka, kontakt, kopulera, och kvardröjande. Varaktigheten för dessa fyra faser var 21,8 ± 2,0 minuter, 28,0 ± 1,9 minuter, 25,8 ± 0,7 min och 7,2 ± 0,5 min, respektive (Figur 3). I en nyligen publicerad, beskrev vi de 11 under beteenden som cruising, närmar sig, encountering, rörande, förena, lokalisera, fästa, utlösning, separering, passivitet, och roaming 9.
När en man träffade två eller fler honor samtidigt verkade den manliga att para sig slumpmässigt med en av dem, utan val. Emellertid var uppenbart parning val observerats för kvinnliga B. xylophilus. När en kvinna kontaktade en manlig, kvinnligt tenderade att röra mannens huvud, kropp, svans och genitala regionen försiktigt med huvudet och verkade att utvärdera sin potentiella partner. Om honan inte acceptera hanen, honan lämnade honom snabbt och simmade till en annan hane för nästa utvärdering. En av hanarna valdes sedan av honan för parning. Parning framgångsrika efter den första kontakten (P) i 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ och 1♀ + 3♂ kombinationer var 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4%, och 23,4 ± 7,4%, respektive, och skillnaderna mellan dem Were signifikant (F = 8,21, df = 2, P = 0,0124) (Figur 4).
Intrasexual konkurrens observerades hos både män och kvinnor. När en jungfru hona blandades med 3 jungfru hanar, hanarna försökte närma sig och kontakta kvinnliga så mycket som möjligt för att få chansen att parning med henne. När vulva ockuperades av en hane, de andra hanarna försökte störa parnings manliga med våldsamma kroppssvängningar eller dra att skilja dem åt. Kvinna intrasexual konkurrens ansågs vara mer eller mindre liknar manliga intrasexual konkurrens.
Parning framgång främst berodde på den kvinnliga. När en kvinnlig accepterat en manlig, flyttade man långsammare och böjt eller bildade en ring, och honan gått framåt aktivt för att göra det lättare för den manliga att hitta henne vulva och för att undvika störningar från andra hanar. Om en kvinna inte acceptera en manlig,honan försökte skaka honom, även om man hade monterat och ställde sig genom sin vulva. På grund av den intrasexual konkurrens, copulation frekvenserna hos 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ och 1♀ + 3♂ kombinationer var 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 och 1,83 ± 0,074, respektive, och skillnaderna mellan dem var signifikant (F = 14,50, df = 2, P = 0,0001) (Figur 5).
I vår undersökning varierade parning varaktighet kraftigt, med ett minimum av 20 sekunder och högst 42 minuter. Enligt våra data, kan varaktigheten för parning kan naturligtvis differentieras in i två grupper: kortsiktiga kopulationer, som varade mindre än 5 minuter, och långsiktiga kopulationer, som varade längre än 10 minuter. Uppenbara skillnader observerades mellan de olika grupperna för den genomsnittliga durationen för korttids parning (F = 3,81, df = 2, P (F = 179,52, df = 2, P = 0,0001), och alla kopulationer (F = 2,93, df = 2, P = 0,0367) (Figur 6).
Figur 1: genitalier manliga och kvinnliga B. Xylophilus. (A) spikler av manliga (blå pil). (B) vulva kvinnliga (röd pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mating framgång på Virgin vuxna par och slumpvis utvalda vuxna par av B. xylophilus. De beräknade medelvärdena är från 30 replikat. Den vertikala krogshowär standardfelet. De olika små bokstäver indikerar signifikanta skillnader vid p <0,05 vid jämförelse med Tukeys test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: varaktighet 4 faser i Parningsprocessen B. xylophilus. De beräknade medelvärdena är från 30 replikat. Den vertikala stapeln visar standardfelet. De olika små bokstäver indikerar signifikanta skillnader vid p <0,05 vid jämförelse med Tukeys test. Den genomsnittliga löptiden för kopulerande fasen är 25,80 ± 0,71 min, vilket är 31,17% av hela parningsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna figurure.
Figur 4: Mating Framgång för den första kontakten av B. xylophilus. De beräknade medelvärdena är från 30 replikat ± SE. Organ med samma liten bokstav inom varje kolumn är inte signifikant olika vid P <0,05 vid jämförelse av Tukeys ärliga Signifikant skillnad test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Copulation Frekvens av B. xylophilus i olika grupper. De beräknade medelvärdena är från 30 replikat ± SE. Organ med samma liten bokstav är inte signifikant olika vid P <0,05 när kompared genom Tukeys ärliga Signifikant skillnad test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Copulation varaktighet B. xylophilus. Organ med samma liten bokstav inom varje uppsättning kolumner är inte signifikant olika vid P <0,05 vid jämförelse av Tukeys ärliga Signifikant skillnad test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beteendetester är en grundläggande aspekt av kemisk ekologi, neurobiologi, molekylärbiologi och genetik. Nematoder, och särskilt C. elegans, används i stor utsträckning för studier i dessa områden. Den parningsbeteende av C. elegans har undersökts tidigare 10-11. Emellertid är B. xylophilus gonochoristic och skiljer sig från de hermafroditiska C. elegans, och dess parning process har olika beteendefunktioner 9. Nyligen var parningsbeteende Bursaphelenchus okinawaensis, en hermafroditiska syster arter av B. xylophilus, rapporterade 12. Även olika experimentella metoder användes, visade denna hermafroditiska arter liknande kön attraktion till B. xylophilus, och mellan djurarter attraktion mellan dem observerades. Denna hermafroditiska systerarter kan användas som en modell för att genomföra ytterligare undersökningar på biologi Bursaphelenchus.
Detta protokoll ger en riktlinje om hur man observera och undersöka beteende egenskaperna hos B. xylophilus under parning. Våra resultat visar att användning av jungfru vuxna nematoder är avgörande för att öka chansen att lyckas observera parningsprocessen (Figur 1). Erhålla J4 larver och exakt skilja deras könen är två viktiga grundläggande steg för förvärv av jungfru vuxna. Under våra experimentella betingelser (dvs vid 25 ° C i mörker), är den period av 52 timmar rätt tid att få J4 från J2 larver. Men skilja kön i ett tidigt J4 skede beror främst på personliga erfarenheter. För att garantera noggrannhet, är det nödvändigt för olika människor att dubbelkolla fördelningen kön.
Beteende egenskaperna hos B. xylophilus under parningsprocessen kan beskrivas kvalitativt och analyseras kvantitativt genom registrering av varaktigheten för de fyra skiljer sigent faser, andelen parning framgång efter första kontakten, den parning frekvensen och parning varaktighet olika kombinationer. Intressant, för första gången, observerade vi parning val av kvinnor och stark inom sexuell konkurrens i både män och kvinnor. Ingen promiskuitet observerades; emellertid kan detta bero på det begränsade antalet nematoder som används i vår undersökning. Detta protokoll kan inte bara användas för att undersöka parningsbeteendet hos B. xylophilus, men det kan också vara användbar och värdefull som referens för andra nematoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Najie Zhu och Liqun Bai bidragit lika för detta arbete. Detta arbete stöds ekonomiskt av den särskilda fonden för skogs vetenskaplig forskning i den offentliga välfärden (201204501) och National Natural Science Foundation i Kina (31170604, 31270688 och 31.570.638). Vi tackar Dr Holighaus Gerrit och Dr. Danielle Hickford för deras användbara förslag på engelska skrift.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R.
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
