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Artigo de método

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

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DOI:

10.3791/54849

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1 de fevereiro de 2017

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1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui um vírus da hepatite B recentemente desenvolvido sistema de repórter (HBV) para monitorar as fases iniciais do ciclo de vida do HBV. Este simplificado sistema in vitro irá ajudar no rastreio de agentes anti-HBV, utilizando uma estratégia de alto rendimento.

Resumo

Atualmente, é possível construir formas recombinantes de vários vírus, como o vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) e o vírus da hepatite C (HCV), que carregam genes estranhos, como um repórter ou proteína marcadora em seus genomas. Esses vírus recombinantes geralmente imitam fielmente o ciclo de vida do vírus original em células infectadas e exibem a mesma dependência do intervalo de hospedeiros. O desenvolvimento de um vírus recombinante permite a triagem eficiente de inibidores e a identificação de fatores específicos do hospedeiro. No entanto, até o momento, a construção do vírus da hepatite B recombinante (HBV) tem sido difícil devido a várias limitações experimentais. A principal limitação é o tamanho compacto do genoma do HBV e um tamanho de genoma bastante rigoroso que não exceda 1,3 tamanhos de genoma, que devem ser empacotados em vírions. Assim, o tamanho de um gene estranho a ser inserido deve ser menor que 0,4 kb se nenhuma deleção do DNA do genoma for realizada. Portanto, para superar essa limitação de tamanho, é necessária a deleção de algum DNA do HBV. Aqui, relatamos a construção do HBV recombinante que codifica um gene repórter para monitorar o estágio inicial do ciclo de replicação do HBV, substituindo parte da região codificadora do núcleo do HBV pelo gene repórter, excluindo parte da região codificadora do HBV pol. A detecção da infecção recombinante pelo HBV, monitorada pela atividade do relator, foi altamente sensível e menos dispendiosa do que a detecção usando os métodos convencionais atualmente disponíveis para avaliar a infecção pelo HBV. Este sistema será útil para uma série de aplicações, incluindo triagem de alto rendimento para a identificação de inibidores anti-HBV, fatores do hospedeiro e células suscetíveis a vírus.

Introdução

A infecção crónica pelo vírus da hepatite B (HBV) é um fator de risco para doenças hepáticas crônicas 1. Embora as estratégias terapêuticas correntes baseiam-se em análogos de nucleótidos que inibem a função de HBV pol e / ou a administração de interferão do tipo I que activa as respostas imunitárias em indivíduos infectados, bem como a proliferação de HBV indirectamente supressão através de funções de genes estimulados com interferão 2, estes tratamentos não pode eliminar o HBV DNA completamente 3. Além disso, o aparecimento de HBVs que são resistentes aos agentes anti-Pol é de preocupação 4. A administração de agentes anti-virais que visam directamente combinadas as diferentes etapas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou ciclo de vida do virus da hepatite C (HCV), foi mostrado para suprimir ou erradicar o vírus (es) com êxito. Semelhante a esta ideia, o desenvolvimento de um agente anti-HBV (s) que actuam directamente sobre as diferentes fases do Hciclo de vida BV é importante para o estabelecimento de futuras terapias HBV.

Em geral, o estabelecimento de uma simples no sistema de cultura in vitro do vírus alvo facilita o desenvolvimento de agentes anti-vírus. No entanto, existem pelo menos duas barreiras ao desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro para rastrear agentes anti-HBV. O primeiro é a falta de um sistema in vitro de cultura de células conveniente para HBV infecção / proliferação. Ao contrário de outros vírus, tais como HIV e HCV, que são propagadas em linhas celulares estabelecidas, é difícil de cultivar in vitro de HBV devido a limitações experimentais, incluindo uma gama de hospedeiros estreita. A utilização de sistemas de cultura de células específicas, tais como a linha celular de hepatoma humano HepaRG, que é susceptível a infecção por HBV, 5, 6, 7 ter sido desenvolvido para superar estes problemas. Além disso, as células PXB, isoladas de uroquinase-type do ativador do plasminogênio transgênico / SCID inoculados com hepatócitos humanos primários (PHH), mostraram-se suscetíveis à infecção por HBV e replicação 8. No entanto, os níveis de replicação de HBV em HepaRG são dependentes do estado de diferenciação celular após a cultura, o que pode causar resultados inconsistentes e reprodutíveis de níveis de infecção / replicação de HBV. PXB é comumente utilizado nas experiências de infecção por HBV, mas é limitado pela sua disponibilidade. A linha de células de expressão HBV inducible tetraciclina, HepAD38, também tem sido amplamente utilizado para estudar a replicação do VHB, mas este sistema só permite uma avaliação após a transcrição e não na etapa de entrada da infecção por HBV 9. Recentemente, a identificação do polipéptido cotransporting taurocolato de sódio (NTCP) como um receptor funcional para VHB tem permitido o desenvolvimento de um sistema de cultura de HBV variável 10. Na verdade, a expressão PNCT em células de hepatocarcinoma não sensíveis, tais como Huh7 eHepG2 permite a infecção por HBV 10 e assim, a escolha de linhas de células susceptíveis de HBV foi expandido, resolver muitas das limitações experimentais. O segundo problema é a falta de um sistema de ensaio simples para avaliar a infecção por HBV e replicação. A avaliação da infecção por HBV é geralmente realizada por meio da análise HBV DNA, RNA e proteínas. No entanto, a quantificação destes marcadores vírus é demorado, dispendioso e muitas vezes nem sempre simples. Por conseguinte, o desenvolvimento de um sistema de ensaio simples, tais como a utilização de um gene repórter, pode superar os problemas associados com sistemas de ensaio de HBV.

No entanto, porque o tamanho do genoma que pode ser empacotado numa cápside de HBV é limitado - menos de 3,7 kb 11 - o tamanho de um gene repórter deverá ser tão curto quanto possível. Além disso, a presença de vários elementos cis espalhados ao longo do genoma, que são essenciais para a replicação virai, limita as posições disponíveis em serção do gene repórter no genoma. Vários relatórios têm tentado inserir genes estranhos, incluindo o HIV-1 Tat, proteína fluorescente verde, e DsRed, no genoma de HBV 11, 12, 13. No entanto, estes HBVs recombinantes não são úteis para o rastreio da infecção por HBV / replicação, ou para o rastreio de alto rendimento de factores que afectam a infecção por HBV / replicação. Isto é principalmente devido à baixa produtividade de vírus recombinantes e a intensidade reduzida da expressão do gene repórter causada pela produção de vírus ineficiente.

Para superar estes problemas, foi construída uma VHB repórter com um elevado rendimento de produção de vírus. Este vírus é altamente sensível para monitorizar as fases iniciais do ciclo de replicação de HBV, a partir da entrada para a transcrição. Para alcançar este objectivo, NanoLuc (NL) foi escolhida como um gene marcador, porque ele é um pequeno (171 ácidos aminados) por engenharia repórter luminescenteclass = "xref"> 14. Além disso, a NL é aproximadamente 150 vezes mais brilhante do que de pirilampo ou de Renilla luciferase, e a reacção luminescente é independente de ATP, o que sugere que a taxa de acerto falsa será baixo para rastreio de alto rendimento. A eficiência de produção do HBV recombinante é de aproximadamente 1/5 do progenitor de HBV, e semelhante para os níveis relatados por vírus recombinantes de HBV anteriores; No entanto, o brilho da NL supera os problemas de produtividade de vírus para que ele possa ser utilizado para o rastreio em massa de agentes anti-HBV.

Rastreio de agentes anti-HBV, utilizando hepatócitos primários, HepaRG, HepAD38 e hepatócitos NTCP-transduzidas pode ser útil para o rastreio de agentes anti-HBV pelo método convencional (s). No entanto, o sistema descrito aqui tem várias vantagens, tais como manuseio simples, de alta sensibilidade e baixo custo para triagem. Estas vantagens são adequadas para ensaios de alto rendimento para identificar e desenvolver novos agentes de HBV para fins terapêuticos.

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Protocolo

1. Produção de recombinante de HBV codifica a proteína repórter

  1. Preparação de células HepG2
    1. Prepare meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 100 U / ml de aminoácidos não essenciais).
    2. A placa 4 x 10 6 células HepG2 em um prato revestido com colagénio de 10 cm em 10 ml de meio de cultura no dia antes da transfecção. Incubar as células HepG2, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 incubadora.
      NOTA: Quando cerca de 4 x 10 6 células HepG2 foram semeadas numa placa revestida de colagénio de 10 cm de 10 ml de meio de cultura, eles vão ser de 70-90% confluentes no dia seguinte.
  2. transfecção
    1. Transfectar células HepG2 com 5 ug de pUC1.2HBV epsilon delta 15 e 5 ug de pUC1.2HBV / NL 15 utilizando uma transfecçãoreagente de acordo com as instruções do fabricante.
    2. No dia seguinte, remover o meio de cultura e adicionar 10 ml de meio de cultura fresco.
    3. Uma semana após transfecção, a transferência do meio de cultura contendo o VHB recombinante para um tubo de 50 ml, e prosseguir para o passo 1.3.1. Adicionam-se 10 ml de meio de cultura fresco para a placa contendo as células transfectadas.
      Nota: A produção do HBV recombinante é mantida durante 4 semanas. O meio de cultura contendo VHB recombinante pode ser armazenado a 4 ° C durante 1 mês.
  3. A purificação do HBV recombinante
    1. Remover os detritos celulares a partir do meio de cultura contendo VHB recombinante por centrifugação (2300 xg durante 5 min).
    2. Passar o sobrenadante através de um filtro de membrana de 0,45 um.
    3. Adicionar um volume igual de 26% de PEG / NaCl 1,5 M (polietileno glicol 6000: 130 g, de NaCl, 49 g, 1 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 e 5 ml de HEPES 1 M pH 7,6 em 500 ml) ao meio de cultura contendo recombinanteHBV e misture delicadamente. Incubar durante a noite a 4 ° C.
    4. Centrifugar a 2.300 xg durante 20 min a 4 ° C.
    5. Descartar o sobrenadante e dissolve-se o sedimento em 0,5 ml de TNE (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM).
    6. Remover os detritos por centrifugação a 2300 xg durante 5 min.
    7. Carregar 0,5 ml de TNE contendo VHB recombinante em 0,8 ml de sacarose a 20% em TNE.
    8. Centrifugar a 100000 × g durante 3 horas a 15 ° C.
    9. Descarte tanto do sobrenadante quanto possível, e guardar o sedimento. Ressuspender-lo em 1 ml de DMEM isento de soro por 40 ml de meio de cultura de partida.
    10. Incubar durante a noite a 4 ° C.
    11. Filtrar através de um filtro de 0,45 um. Preparar alíquotas de 0,5 ml e armazenar a -80 ° C.
      NOTA: Se se observa a contaminação de proteínas repórter da amostra de vírus original, purificar o vírus por gradiente de densidade ultra-centrifugação de 5-30% de sacarose em TNE a 100.000 xg durante 2 h, ou centrifugação de densidade de CsCl equilibrada from 1,1-1,6 g / ml a 150.000 xg durante 50 horas.

2. A infecção de VHB recombinante

  1. As células HepG2 cultura que expressam estavelmente NTCP (HepG2 / NTCP) 15 que são susceptíveis a infecção por HBV em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 250 ug / mL de G-418 e 100 U / ml aminoácidos não essenciais a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 incubadora.
  2. Um dia antes da infecção, placas de aproximadamente 5 x 10 4 HepG2 / células NTCP 14 para uma placa de 96 poços revestidos de colagénio em 0,1 ml de meio de cultura.
  3. HBV recombinante Thaw em um banho de água C 37 ° até que haja um pequeno pedaço de gelo restante no frasco.
  4. Prepara-se o meio de infecção por combinação dos seguintes: 10 ul de 40% PEG8000 em 1x tampão fosfato salino (PBS), 2 uL de sulfóxido de dimetilo (DMSO), 10 uL de HBV recombinante e 78 ul de meio de cultura frescopor poço de uma placa de 96 poços.
  5. Adicionar 100 ul de solução de HBV recombinante a um poço da placa de 96 poços.
  6. Um dia após a infecção, as células infectadas lavar 3 vezes com 300 ul de PBS por cavidade para remover a proteína repórter contaminante a partir da fracção de vírus.
  7. Incubar as células infectadas em 200 ul de meio de cultura contendo 2% de DMSO, durante uma semana ou menos.

3. Análise

  1. Uma semana após a infecção, as células infectadas lavar 3 vezes com PBS.
  2. Adicionar 50 ul de tampão de lise de células infectadas.
  3. Rocha da placa de cultura durante 5 minutos, e depois centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
  4. Adicionar 50 ul de substrato repórter na placa de luminómetro.
  5. Adicionar 20 ul de lisado de células para uma placa de luminómetro contendo o substrato de repórter. Misture em vortex brevemente.
  6. Coloque a placa no luminómetro e iniciar a leitura 15.

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Resultados

A Figura 1 mostra uma representação esquemática do genoma de HBV, ARN transcritos, proteínas do vírus e a sua região de codificação no genoma. O gene repórter e sua localização no genoma são também indicados. A Figura 2 mostra o plasmídeo repórter e auxiliar plasmídeo VHB que contém o gene repórter. O repórter pUC1.2HBV / NL, foi construído por exclusão posições de nucleótidos 223-811 do local de iniciação da transcrição do ARNm de preCore de pUC1.2HBV <...

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Discussão

O genoma do VHB tem quatro primários grelhas de leitura abertas (ORFs), incluindo o núcleo, polimerase, de superfície e X ORFs (Figura 1). A transcrição destes quatro HBV ORF é estreitamente regulada por quatro promotores: o promotor pré-core / core contendo potenciador II, promotor S1, S2 promotor e X promotor contendo potenciador I 18. Os mRNAs 3,5 kb e 3,4 kb são traduzidos em proteínas Precore e Core, respectivamente. O grande proteína envelope (L) é produzido a partir da mai...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa de Pesquisa em Hepatite da Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED) e pelo Grants-in-Aids for Scientific Research do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT) do Japão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nano-Glo Luciferase Assay RegentPromegaN1110
Penicilina-Estreptomicina Solução MistaNacalai tesque09367-34 
MEM Solução de Aminoácidos Não EssenciaisThermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I Meio Sérico ReduzidoThermo Fisher Scientific31985070
100 mm/prato revestido de colágenoIwaki4020-010
Lipofectamine 3000 Reagente de TransfecçãoThermo Fisher ScientificL3000001 
Polietilenoglicol (PEG) 6000 Sigma-Aldrich81255
Polietilenoglicol (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0.5 mol/L Solução EDTANacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0.45 μ m, polietersulfona, filtroMerck MilliporeSLHP033RS
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Placa de 96 poços revestida com colágenoCorningNO3585
Lise passiva 5x BufferPromegaE1941
GloMax 96 Microplaca LuminômetroPromegaE6501
SacaroseNacalai tesque30403-55
Placa de luminômetroGreiner bio-one655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--Referência 15
pUC1.2HBV delta épsilon--Referência 15
pUC1.2HBV/NL--Referência 15
tubo de 50 mlViolamo1-3500-02
Anti-Myc anticorpoSigma-AldrichC3956
HBIGJapan Blood ProductsOrganization-IFN
-βMochida Farmacêutica14987224005413
HeparinaSigma-AldrichH3393

Referências

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