Summary
Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.
Abstract
Elektroforetik hareket kayma deneyleri (EMSA) proteinler ve hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimi karakterize eden bir aracı bir araçtır. Radyoaktivite EMSA DNA etiketleme baskın yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar ve tarama yöntemleri son gelişmeler, zaman tasarrufu maliyetini azaltarak ve güvenliğini geliştirmek, kolay kullanım avantajları için radyoaktivite alternatif olarak DNA floresan etiketleme kullanımı teşvik etmiştir. Biz son zamanlarda başarıyla önemli bir biyolojik soruyu ele almak için floresan EMSA (FEMSA) kullandık. Bizim FEMSA analizi yüksek derecede korunmuş HMG transkripsiyon faktörü SOX-2 koku nöron tipi çeşitlendirilmesi üzerinde, bir missense mutasyon, G73E yürürlüğe mekanik görmemizi sağlar. Mutantını SOX-2 G73E proteini ve böylece koku nöron kimlik dönüşümü neden spesifik DNA bağlanma aktivitesi değiştirir bulundu. Burada, mevcut olan bir iyileştirilmiş ve adım adım protokolü maliyetliFEMSA biyolojik örnek olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ve saflaştırılmış SOX-2 proteinleri (WT ve mutant SOX-2 G73E proteinler) içeren kızıl ötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak.
Introduction
EMSA ilgi konusu bir protein ve protein 1 potansiyel hedef sitesi ihtiva eden bir işaretli DNA sondası bir karışımını çözmek için yerel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak DNA ve protein arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılır. protein ile bağlı bir DNA probu yavaş serbest DNA probu ile karşılaştırılır ve bir poliakrilamit matris boyunca, geçiş nedenle geciktirilir değiştirecektir. 32 P DNA Radyo-etiketlenmesi EMSA tespiti için baskın bir yöntem olmuştur. biyokimyasal araştırmalarda radyo sınıflandırılmasıyla uygulama yararlı olmasına rağmen, benzer hassasiyetle alternatif DNA etiketleme yöntemleri nedeniyle radyoaktivite taşıma ile ilgili sağlık ve güvenlik risklerine istihdam edilmektedir. Bu alternatif yöntemler, biyotin 2 veya digoksijenin (DIG) 3 (her ikisi de daha sonra kimyasal olarak ışık veren sistemler tarafından tespit edilir) olan DNA konjügasyon PAGE jelleri 4 SYBR yeşil boyama dahilya da jel 5,6 tarayarak DNA floresan boya konjügatlarının doğrudan tespiti.
Radyoaktif olarak etiketlenmiş DNA sondaları kullanılarak EMSA çözülmesi jeller postrun otoradyografi filmler içinden işleme veya radyoaktif sinyaller 1,7 tespit etmek için, bir Phosphorimager sistemi gerektirmektedir. Biotin-2 veya DIG-konjuge 3 DNA sondaları kullanılarak EMSA ve jeller de işlenebilir ve uygun bir membran üzerine aktarıldı ve kemiluminesans 6 tarafından tespit edilmelidir. Jelin SYBR yeşil boyama postrun jel boyama ve floresan tarayıcı 4 gerektirir. postrun jel işlem adımları, bu DNA etiketleme teknikleri kullanılarak EMSA için gerekli olması nedeniyle, giderilmiş jel bir kez analiz edilebilir. Bunun aksine, floroforlar ile etiketlenmiş DNA probları Bir tarayıcıdan cam plakalar içindeki jelde tespit edilebilir. Böylece, DNA-protein etkileşimleri izlenebilir ve çalışma sırasında farklı zaman noktalarında birkaç kez deneye tabi olanönemli ölçüde zaman ve maliyeti azaltır. EMSA kullanılmaktadır DNA fluoresan boya konjügatları Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluoresein 9 ve kızıl ötesi floresan boyalar 4-6 içerir.
Transkripsiyonal düzenleme transkripsiyon faktörleri ve hedef genlerin protein-DNA etkileşim gerektirir. Bu etkileşimlerin Koordinasyon hayvan gelişimi sırasında ortak bir progenitör gelen farklı hücre tipleri oluşturur. Tarafsız bir ileri genetik ekranı Caenorhabditis elegans transkripsiyon faktörü SOX-2 yüksek derecede korunmuş HMG DNA-bağlama etki, yanlış anlamlı bir mutasyon, G73E tespit edilmiştir. , Moleküler morfolojik ve fonksiyonel düzeyde 5,10 at AWC koku nöronlar içine AWB koku nöronların hücre kimliği dönüşümünde mutasyon sonuçları. SOX-2 farklı şekilde bağlam-bağımlı ortak transkripsiyon faktörlerinin ve ilgili etkileşerek AWB ve AWC nöronların terminal farklılaşmasını düzenleyenDNA hedef site 5,10. SOX-2 terminali AWB nöronal farklılaşma LIM-4 (LHX) işbirliği, SOX-2 terminali AWC nöron farklılaşma CEH-36 (OTX / OTD) ile işbirliği yapmaktadır. Lusiferaz raportör testleri gösterirken bu SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E proteinleri AWB ve AWC nöronlarda ifade edilen bir promotör etkinleştirmek için transkripsiyonel kofaktörler LIM-4 ve CEH-36 ile işbirliği etkileşimleri vardır. Bununla birlikte, SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E promoteri ayırıcı etkinleştirme özelliklerine gösterilir. SOX-2 ve SOX-2 G73E ayırıcı bir DNA bağlama aktivitesi moleküler temelini araştırmak için, fEMSAs bu proteinlerin ve olası hedef alanlan ile yapıldı.
İlk olarak, biyoenformatik yaklaşımı lusiferaz tahlilde kullanılan 1 kb promoter bölgesi içinde bağlama dizileri biyolojik ilgili DNA tespit alındı. Birden fazla potansiyel SOX-2 bağlayıcı siteler promotör boyunca mevcut olduğundan, biz odaklıfarazi CEH-36 ya da LIM-4 bağlanma yerleri bitişik ve evrimsel çeşitli nematod türlerinin arasında korunan tahmin SOX-2 bağlayıcı sitelerde. Bu diziler, silinmiş ya da mutasyona uğramış, ve daha sonra AWB veya AWC nöronlarda GFP raportör transgenleri ifade etme aktivitesi için in vivo olarak test edilmiştir. Bu yaklaşım sayesinde, özellikle AWB ve AWC nöronlar, sırasıyla, 5 GFP ekspresyonu için gerekli olan LIM-4 / SOX-2 potansiyeli ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef sitesi belirlenmiştir. Biz SOX-2 ve SOX-2 LIM-4 / SOX-2 tespit ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef siteleri ile FEMSA kullanarak G73E bağlayıcı DNA potansiyel farklılıkları araştırıldı. Bizim EMSA analizi SOX-2 G73E kadar etkin WT SOX-2 gibi (AWB gen ifadesi için gerekli olan) LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ihtiva eden DNA probu bağlamak olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, SOX-2 ve SOX-2 G73E içeren DNA probu bağlama fark vardı CEH-36 / SOX-25,10 (AWC gen ifadesi için gerekli olan) djacent hedef bölge. Bizim FEMSA AWB-to-AWC hücre kimlik dönüşümü fenotip için spesifik DNA bağlama aktivitesini etkileyen SOX-2 G73E mutasyonunun doğaya mekanik bilgiler sağlayabilir analiz eder. Burada, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2 veya 6xHis-SOX-2 çözmek için bir vaka çalışması olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef siteleri içeren kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte G73E kullanarak FEMSA optimize edilmiş bir protokol tarif önemli bir biyolojik bir soru.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: fosforla etiketlenmiş DNA sondaları veya işaretlenmiş DNA diğer formları kullanarak EMSA protein ya da hücre özü hazırlanması, protein-DNA bağlanma reaksiyonu ve PAGE jel hazırlanmasında ve yürütülmesinde (Şekil 1A) için aynı protokol paylaşır. önemli farklılıklar DNA etiketleme prosedürleri, post-run jel işleme aşamaları ve algılama yöntemleridir.
1. Jel Hazırlanması
- mini protein jel sistemi (8.3 cm genişlik x 7.3 cm uzunluk x 0.75 mm kalınlık) kullanılarak, 0.5x TBE (45 mM Tris-Borate, 1mM EDTA) ve% 2.5 gliserol içeren% 5 yerli poliakrilamid jel hazırlayın.
- Akrilamid / Bis 4 jeller için jel çözeltisi, 30 mL hazırlanması% 30 5 mL karıştırın (37.5: 1), 3 5x TBE (0.45 M Tris-borat, 10 mM EDTA),% 50, 1.5 mL gliserol mL, % 10 amonyum persülfat 300 uL, TEMED 15 uL ve iyice GKD 2 O 20.2 mi.
NOT: Akrilamid zararlı ve toksik uygun kişisel koruyucu ekipman ile anlaştım. - hemen jel çözümü Cast. Polimerizasyon sonra, şeffaf plastik wrap 0.5x TBE önceden ıslatılmış jeller sarın ve 4 ° C'de saklayın.
Kızılötesi floresan boya işaretli problar 2. hazırlanması
Not: hazırlama, depolama, ve deneyler sırasında uzak mümkün olduğu kadar hafif kızılötesi fluoresan boya etiketli oligonükleotidler tutun.
- Tasarım ve sipariş oligonükleotidler.
- ~ 51-mers uzun oligonükleotidi tasarlayın.
Not: LIM-4 / SOX-2 sonda uzun oligonükleotid dizisi TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC olup. Uzun oligonükleotidler SAYFA veya HPLC saflaştırma gerekmez. - 5 'ucunda (5'Dye) ve 37 ° C'nin üzerinde bir erime sıcaklığı, kızılötesi floresan boya modifikasyonuna ~ 14-mer tamamlayıcı kısa oligonükleotidlerin tasarımlanması.
NOT: Kısa oligonükleotid dizisi LIM-4 / SOX-2 prob 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG olduğunu. 5'Dye etiketli Kısa oligonükleotitlerin asgari sentezi ölçeği 100 nM'dir. Bu nedenle, oligonükleotidler, HPLC saflaştırma gerektirir.
- ~ 51-mers uzun oligonükleotidi tasarlayın.
- 100 uM nihai konsantrasyona kadar; (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 TE) 1x Tris-EDTA tampon maddesi içinde yeniden süspanse oligonükleotitler.
- Tavlama Kısa (5'Dye) ve Uzun oligonükleotidler.
- 0.6 5'Dye-Kısa bir oligo (100 uM) uL, uzun oligo (100 uM), 1.2 ul, sodyum 28.2 uL klorür-tris-EDTA tampon maddesi (karıştırın STE: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 1 mM EDTA), bir 1.5 ml bir tüp içinde.
- 5 dakika boyunca kaynayan suda tüp yerleştirin. ısı kaynağı kapatın ve tavlı oligos karanlıkta O / N serin suyu sağlar.
- iki şeritli DNA probları yapmak için Klenow DNA polimeraz ile tavlanmış 5'Dye-kısa / uzun oligo 5 'çıkıntısını doldurmak.
- karıştırılarak reaksiyon hazırlanması5'Dye etiketiyle tavlanmış uzun / kısa oligo 30 uL, 8.5 uL 10x Klenow tamponu, 10 mM dNTP 1.7 ul, 1.7 Klenow uL (3 '-> 5' ekso-) (5 u / uL) ve 0.2 ml PCR tüpünde GKD 2 O 43.1 ul.
- PCR makinesi içerisinde 37 ° C'de 60 dakika kuluçkalayın.
- PCR makinesi içinde 20 dakika süreyle 75 ° C'de reaksiyona ısı devre dışı bırak durdurmak için 3.4 mcL 0.5 M EDTA ekleyin.
- 0.1 uM nihai konsantrasyon için STE doldurulmuş sondalar (0.7 uM) ile seyreltilir.
- hazır olana kadar karanlıkta -20 ° C'de saklayın oligos kullanmak için. Oligo Bu durumda, bir yıla kadar depolanabilir.
NOT: Mutant bağlayıcı siteleri ile DNA probları oluşturmak için, uzun oligonükleotitlerin mutant sürümleri Klenow ile 5 'çıkıntılar dolgu-in ardından 5'Dye etiketli kısa oligonükleotid ile tavlanır. Bir iplikçik prob kızılötesi floresan ile etiketlenmiş olduğu gösterilmiştirboya boya ile işaretlenmiş, her iki şerit prob sadece% 30 yoğunluğa sahiptir. Sinyal yoğunluğu güçlendirilmelidir, her iki şerit uzun oligo 5 'termini, kızılötesi floresan boyalar ile etiketlenmiş ve kızıl ötesi floresan boya etiketli problar yapmak için tavlanır.
Etiketsiz / Soğuk Sondalar 3. Hazırlama (Yarışmacı)
Not: tamamlayıcı diziler (Uzun ve Longr) Uzun oligonükleotidler kızılötesi floresan boya etiketli problar ile rekabet analizi için etiketsiz probları yapmak tavlanmıştır.
- 1.5 ml bir tüp içinde, 100 mikron uzunluğunda 20 uL, 100 uM Longr oligonükleotid 20 uL ve STE 60 uL karıştırın.
- 5 dakika kaynar suda tüp yerleştirin ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligos gece boyunca soğumaya suyu sağlar.
4. Bağlanma reaksiyonu ve elektroforez
- 50 uL karıştırılarak 5x bağlama tamponu, 1 mL hazırlanması60 ° C; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 5 M NaCI, 10 uL; 1 M KCl, MgCl2 1 M 5 uL 200 uL, 0.5 M EDTA, 10 uL, pH 8.0; 1 M DTT 5 uL; GKD 2 O 25, 10 mg / ml BSA uL ve 695 uL
Not: 5x bağlama tamponu bölünüp -20 ° C'de saklanabilir. Dikkate alınması gereken diğer bir nokta, farklı transkripsiyon faktörleri bağlama tamponu farklı modifikasyonlara sahip olmasıdır. - Sağ bağlama reaksiyonları kurmadan önce, 30 80 V amonyum persülfat tüm izlerini silmek için +% 2.5 gliserol 0.5x TBE% 5 yerli poliakrilamid jel önceden işletilen - 60 dk veya geçerli artık zamanla değişir kadar.
- 20 uL nihai hacimde bağlanma reaksiyonuna ayarlayın.
- 4 5x bağlama tamponu uL, 80 karıştırın - saflaştırılmış protein A 200 ng (örneğin,% 50 gliserol, SOX-2), 0.1 uM Boya ile konjüge edilmiş prob 1 pL (son konsentration: 5 nM) ve GKD 2 O
- İsteğe bağlı: Soğuk sonda rakipler gerektiğinde, çeşitli konsantrasyonlarda soğuk prob (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, vs.) ekleyin.
- İsteğe bağlı: proteinler, A ve B arasındaki etkileşimi (örneğin, SOX-2 ve LIM-4) test edildiğinde, 80 ekleyin - saflaştırılmış protein B 200 ng (yani,% 50 gliserol içinde, LIM-4).
- İsteğe bağlı: nükleer ekstre hazırlanması kullanılan doğrulanması için protein A spesifik bağlanma ise, protein A (örneğin, bir anti-6xHis, anti-FLAG, vs.) özel antikor ekleyin.
- 15 dakika süreyle karanlıkta R / T'de bir gece inkübe edin.
- jel üzerine bağlanma reaksiyonunun tüm yük ve istenen mesafeye 10 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı.
5. Görüntüleme
NOT: Jel gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi ile cam plakalar doğrudan tarandı. Bu nedenle, jel daha çözülebilir ve tekrar tekrar taranan (Şekil 1C ve
- GKD 2 O ile tarayıcı yatağı temizleyin ve taramadan önce iyice kurutun. jel cam plakalar silerek kurutun ve tarayıcı yatağı üzerinde jel içeren plakalar yerleştirin.
- kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve 'Edinme' sekmesine gidin. ince plaka (1 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 169 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 1.5 mm. kalın levha (3 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 84 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 3,5 mm. ofset odak bağlıdırcam levha kalınlığı.
- Jel tarayıcıya kapladığı alanı seçin. Taramayı başlatmak için 'Başlat' düğmesine tıklayın.
- elektroforez tekrarlayın ve ayrıca gerektiğinde tarayın.
- Akrilamid / Bis 4 jeller için jel çözeltisi, 30 mL hazırlanması% 30 5 mL karıştırın (37.5: 1), 3 5x TBE (0.45 M Tris-borat, 10 mM EDTA),% 50, 1.5 mL gliserol mL, % 10 amonyum persülfat 300 uL, TEMED 15 uL ve iyice GKD 2 O 20.2 mi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Portakal Rengi G yükleme boyası (6x 100 mL% 30 gliserol içinde 0.12 g turuncu G) Electrophoresis ilerlemesini görselleştirmek için yükleme öncesi bağlanma reaksiyona ilave edilebilir. Bromofenol mavisi gibi diğer yükleme boyalar tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizi (Şekil 1B) müdahale edilir.
EMSA Bazı durumlarda, nükleer ekstre hazırlanması kullanılan, özellikle, poli deoxyinosinic-deoxycytidylic (dl-dC) DNA 11 proteinlerin spesifik olmayan bağlanma azaltmak için bağlanma reaksiyonunda dahildir. Bununla birlikte, dl-dC 50 ug / ml saflaştırılmış 6xHis-SOX-2 5'Dye DNA probları (Şekil 1B) ile bağlanmasını ortadan kaldırmıştır.
kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları bağlama özgünlüğüne göstermek için, biz WT veya rakip olarak mutant soğuk sondaları (kullanılan
Proteinlerinin bağlama özgünlüğü nükleer ekstre hazırlanması tahlilinde 1 kullanıldığı zaman, proteinler veya etiketleri için spesifik antikorlar kullanılarak protein-DNA etkileşim süperkayma tahlilleri gerçekleştirilerek belirlenebilir. SOX-2 6xHis ve FLAG epitopları ile etiketlenmiş. 1 ug anti-6xHis veya 2.5 ug anti-FLAG M2 Antibo ilavesi Bir ile süper SOX-2-DNA bandının (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır kalıplar.
Şekil 1. FEMSA ve FEMSA Kızılötesi Floresan Boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak. (A) akış şeması. (B) bromofenol mavisi etkisi, portakal G ve FEMSA DI-dC (1 ug). 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 prob 5 nM kullanılmıştır. (C) FEMSA LIM-4 / SOX-2 elemanın SOX-2 hedef siteye 6xHis-SOX-2 G73E bağlayıcı özgüllüğü gösteren. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 prob 5 nM kullanılmıştır. LIM-4 / SOX-2 (M), mutant hedef siteleri. jeller elektroforez sonra 20 ve 40 dakikada tarandı. Elektroforez herhangi bir soğuk prob olmadan sokağın yoğunluğu normalize edildi floresan bant yoğunluğu, ölçmek için kullanıldıktan sonra taranan görüntü 40 dakikada elde edilmiştir. AU, keyfi ünite.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FEMSA ve Antikorlar kullanarak SOX-2-DNA Complex Şekil 2. Süperkayma Analizleri. SOX-2 6xHis ve FLAG epitopları hem etiketlendi. Anti-6xHis ya da anti-Flag antikorları ile eklenmesi SOX-2-DNA kompleksinin ve bir süper neden oldu. 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 sonda kullanıldı. Jel görüntüleri ilgisiz şerit hariç şeride 2 ve 3 arasında spliced bulundu. Jel 40, 60 taranmış ve 90 dakika elektroforez sonra. Edildi , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fEMSAs protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır ve DNA radyoaktif etiketleme bir alternatiftir. kızıl ötesi boyalar gibi floresan boyalar ticari olarak temin edilebilir, ve radyoaktif bir DNA etiketleme kıyasla çevre dostu daha güvenli ve daha yöntem sağlar. Kızılötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak EMSA postrun jel işleme adımlar gerektirir ve bu nedenle diğer DNA etiketleme teknikleri ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet tasarrufu yoktur. Zaman radyoaktif EMSA ile bantlar 1 test edilen DNA probları radyoaktivitesi ve konsantrasyona bağlı olarak, 30 dakika ile birkaç gün arasında olabilir tespit etmek. Buna karşılık, FEMSA jeller tarama böylece önemli ölçüde protokol süresini azaltarak, ortalama 25 dk sürer. jel analizi için cam levhaları kaldırılacak yok gibi fEMSAs da radyoaktif etiketleme üzerinde önemli bir avantaj sağlar. İlk çalışma süresi yeterli değilse Bu jel yeniden taranır sağlarprotein-DNA kompleksleri gidermek için. elektroforez uzatmak için bir seçenek radyoaktif izotopları veya biyotin / streptavidin kullanılarak mevcut değildir. En önemlisi, radyoaktif malzeme taşıma, DNA prob floresan etiketleme tehlikeli değildir ve kolayca atılabilir ise, laboratuar personeline güvenlik riski oluşturur. Streptavidin kullanımı da tespit kadar uzun bir süre (yaklaşık 3 saat) 12 gerektirir. protokol ve burada sunulan sonuçlar FEMSA biyomedikal araştırmalar için etkili ve kullanışlı bir araç olduğunu göstermektedir. Biz başarıyla koku nöron kimlik dönüşümü 5,10 yol açan spesifik DNA bağlanma aktivitesi üzerine SOX-2 G73E mutasyonunun yürürlüğe mekanistik anlayış sağlamak için FEMSA kullandık.
jel analiz ederken veya hiç zayıf sinyal tespit edilmesi durumunda, DNA prob konsantrasyonu artabilir. Bizim çalışmalarda kullanılan DNA problarının bir kızılötesi floresan boya ile etiketlenmiştirtek iplikli. Bu yöntem, test ettik problar için başarılı bir şekilde çalıştığı olsa da, tek bir telin floresan etiketleme her iki şerit üzerinde etiketlenmiş probların% 30 yoğunluğu olduğu bildirilmiştir. yoğunluğu çok düşük olduğu ortaya çıkarsa, kızılötesi floresan boya ile DNA prob her iki şeridinin etiket önerilir. kaymıştır bantlar uyulmaması durumunda, protein-DNA kompleksi kararsız olabilir. Gliserol protein-DNA etkileşimlerini stabilize etmek için bu protokol çok önemlidir. Gliserol döküm jeller, bağlanma reaksiyonu, ve çalışma tamponu dahildir. çalışması sırasında jelden örneklerin ilerlemesini izlerken dikkate başka nokta boya seçimdir. Turuncu G gibi jel tarama ile müdahale bromofenol mavi olarak yükleme boyaların diğer türleri gibi bu amaç için idealdir. jel Prerunning amonyum persülfat yükleme örnekleri önce jelden çıkarılır sağlanması da önemlidir. Buna ek olarak, poli dI-dC kullanımı bağlanma özelliğinin engelleyebilirfEMSAs DNA probu ile ilgili proteinin örn. İlgi ve hedef DNA bütünlüğü proteinin saflığı etkileşimi için önemlidir. Görüntüleme yazılımı kullanırken doğru tarama ayarlarını sağlamak da önemlidir. Uygun odak uzaklığı ve yoğunluk parametreleri jel plakaları ve DNA probları yoğunluğunun kalınlığına göre seçilir.
Önceki protokoller flüoresan EMSA 13,14 gerçekleştirmek için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu protokoller dl-dC kullanımını gerektirmiştir ve / veya pompa, belirli bir sıcaklığı korumak için su sirkülasyonu için kullanılan. Burada açıklanan protokol çok daha detaylı bir yöntem sağlar ve herhangi bir pompa kullanımı gerektirmez.
Bu protokol için gelecek uygulamalar gerçek zamanlı izleme rekabet deneyleri içerir. jeller farklı elektroforez zaman poin birden çok kez taranabilir olarak floresan etiketli sondalar, bu ek anlayış bizets. Buna ek olarak, ilgi alanı ve rakip probları DNA probları iki renkli görüntüleme sağlayan, farklı kızıl ötesi floresan boyalar ile etiketlenebilir. tüm teknikleri olduğu gibi, floresan EMSA kullanarak sınırlamalar vardır. nispeten daha düşük duyarlılığı nedeniyle, geleneksel EMSA ile karşılaştırıldığında daha yüksek protein konsantrasyonları gereklidir. Başka bir sınırlama kızılötesi floresan boya tespit etmek için yüksek çözünürlüklü özel bir görüntüleme sisteminin gereğidir. ilk maliyet tarayıcı satın almak için yüksek olmasına rağmen, kızılötesi floresan boya etiketleme uzun süreli kullanımı maliyet etkilidir. Bu kısıtlamalara rağmen, floresan EMSA önemli biyolojik soruları yanıtlamak için önemli bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
