Artigo de método

3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

DOI:

10.3791/54868

⸱

26 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroinflamação é agora reconhecido como um importante fator etiológico em doenças neurodegenerativas. fagócitos mononucleares são células imunitárias inatas responsáveis ​​pela fagocitose e remoção de escombros e detritos. Estas células incluem macrófagos residentes do SNC conhecidos como microglia e fagócitos mononucleares infiltrantes a partir da periferia. A microscopia de luz tem sido geralmente usado para visualizar a fagocitose em roedores ou espécimes do cérebro humano. No entanto, os métodos qualitativos não forneceram provas definitivas da fagocitose in vivo. Aqui, nós descrevemos 3D quantitativa na modelagem de silício (q3DISM), um método robusto para a verdadeira permitindo a quantificação de 3D-amilóide β (Ap) a fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD). O método envolve a fluorescência visualizando Ap encapsulado dentro phagolysosomes em seções roedor cerebrais. Grandes conjuntos de dados confocal z-dimensional são então reconstrução 3D para quantificação de A &# 946; colocalized espacialmente no interior do fagolisossoma. Nós de demonstrar a aplicação bem sucedida de q3DISM de ratinho e de rato cérebros, mas esta metodologia pode ser estendida para virtualmente qualquer modo fagocitária em qualquer tecido.

Introdução

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Doença de Alzheimer (AD), a demência relacionada com a idade mais comum 1, caracteriza-se pela acumulação de amilóide cerebral-β (Ap) como placas "senis" beta-amilóide, neuroinflama�o baixo nível crónica, taupatia, perda neuronal, e perturbação cognitiva dois . No AD cérebros de pacientes, neuroinflamação é destinada pelos astrócitos e fagócitos mononucleares reativa (referido como microglia, embora as suas centrais vs. origem periférica permanece obscuro) em torno depósitos Ap 3. Como as sentinelas imunes inatas do SNC, microglia são posicionados centralmente para limpar Ap cérebro. No entanto, o recrutamento da microglia para placas de Ap é acompanhada por muito pouco, se algum, fagocitose Ap 4,5. Uma hipótese é que microglia são inicialmente neuroprotetor por phagocytozing pequenas montagens de Ap. No entanto, eventualmente estas células se tornam neurotóxico como carga Ap esmagadora e / ou d funcional relacionada com a idadeecline, provoca microglia em um fenótipo pró-inflamatório disfuncional, contribuindo para a neurotoxicidade e declínio cognitivo 6.

Estudo de associação genômica ampla Recentes (GWAS) identificaram um conjunto de alelos de risco AD pertencentes ao núcleo vias imunitárias inatas 7 que modulam a fagocitose 8-11. Consequentemente, a resposta imune a deposição de amilóide cerebral tornou-se uma grande área de interesse, tanto em termos de compreender a etiologia AD e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas 12-14. No entanto, existe uma necessidade vital para a metodologia para avaliar a fagocitose Ap in vivo. Para atender a essa necessidade não satisfeita, temos desenvolvido 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) para permitir uma verdadeira quantificação 3D da cerebral fagocitose Ap por fagócitos mononucleares em modelos de roedores de doença de Alzheimer-like.

Limitado apenas pelo grau em que a doença recapitular, os modelos animais têmcomprovada de valor inestimável para a compreensão AD pathoetiology e para avaliar terapêutica experimental. Devido ao facto de que as mutações nos genes presenilina (PS) e da Proteína Precursora Amilóide (APP) independentemente causar AD autossómica dominante, estes transgenes mutantes têm sido extensivamente usados ​​para gerar modelos de roedores transgénicos. Camundongos transgênicos APP / PS1 coexpress� simultaneamente "sueco" mutante APP humana (swe APP) e Δ exon 9 mutante presenilina 1 humano (PS1ΔE9) presente com amiloidose cerebral acelerada e neuroinflamação 15,16. Além disso, geramos ratos bi-transgénicos co-injectado com APP swe e construções PS1ΔE9 (linha TgF344-AD, em um fundo Fischer 344). Ao contrário de modelos de ratos transgênicos de amiloidose cerebral, ratos TgF344-AD desenvolver amilóide cerebral que antecede tauopathy, perda apoptótica de neurônios, e comprometimento comportamental 17.

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para immunostaining microglia, phagolysosomes e depósitos de Ap em seções do cérebro de ratinhos APP / PS1 e ratos TgF344-AD, e aquisição de imagens confocal grandes z-dimensional. Nós detalhe na geração e análise dos verdadeiros reconstruções 3D a partir de conjuntos de dados confocal permitindo a quantificação da captação de Ap em phagolysosomes microgliais silico. Mais amplamente, a metodologia que nós detalhes aqui pode ser usado para quantificar virtualmente qualquer forma de fagocitose in vivo.

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Protocolo

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Declaração de ética em pesquisa: Todos os experimentos envolvendo animais detalhados aqui foram aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e realizado em estrita conformidade com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e recomendações da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório animal Care International.

1. Rodent isolamento Cérebro e Preparação para imunocoloração

DIA 1:

  1. Coloque ratos TgF344-AD com idade (14 meses de idade) ou APP ratos / PS1 (12 meses de idade), sob anestesia isoflurano profunda contínua (4%). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e ausência de reflexo de retirada.
  2. Cortar ambos os lados da caixa torácica e levante para expor o coração. Inserir uma agulha G 23 para o ventrículo esquerdo do coração e fazer uma pequena incisão no átrio direito. Continuar a exsanguinação por perfusão transcardial com soro fisiológico tamponado com fosfato arrefecido com gelo(PBS) utilizando uma bomba peristáltica (30 mL para ratos; 150-200 mL para ratos).
  3. Fazer uma incisão na linha média na pele caudal e mover a pele e músculo de lado. Cortar através da parte superior do crânio, ao longo da linha média e entre os olhos. Retirar as placas ósseas e isolar todo o cérebro do crânio.
  4. Coloque o cérebro em uma matriz de roedores cérebro coronal e cortá-lo em quartos. Incubar quartos posteriores S / N (16 h) no fixador de paraformaldeído (PFA a 4% em PBS) a 4 ° C. Lavar 3x em PBS, e depois transferir para 70% de etanol. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser tratado sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado.

DIA 2:

  1. Coloque trimestres cerebrais em cassetes de embebimento e progressivamente desidratar o tecido em banhos de etanol 1 h sucessivamente mais concentrada (70%, 80%, 95%, e 100% x3).
  2. Limpar o etanol a partir do tecido com três banhos sucessivos de xileno a 100% (1 h cada). Atenção: O xileno é tóxico e should ser tratadas sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado.
  3. Incorporar tecidos em blocos de parafina depois de dois banhos de fundição de cera de parafina (56-58 ° C, 90 min cada).

DIA 3:

  1. Cortar 10 seções mm de espessura de cérebros embebidos em parafina usando um micrótomo. secções mergulhar em um banho de água (50 ° C durante 1 min) e aplicam-se a lâminas de microscópio. Deixar as lâminas secar S / N, garantindo adesão do tecido à lâmina.

2. A imunocoloração

Nota: Diferentes combinações de anticorpos pode ser utilizada para o procedimento de coloração descrito a seguir. Misturas de anticorpos compatíveis com tecido cerebral de ratos e murganhos são listados na Tabela 1.

DIA 4:

  1. Desparafinar secções cerebrais usando 2x 100% banhos de xileno (12 min cada).
  2. Rehidratar secções do cérebro em banhos sucessivos de etanol - 100% durante 10 min, 95% durante 5 min, 80% durante 10 min, e, finalmente, 70% durante 15 min - followed por lavagens PBS 3x [5 min à temperatura ambiente, com agitação luz]. Enquanto isso, o calor solução de recuperação de antígenos a 95-97 ° C em uma placa quente com agitação barra magnética.
  3. Incubar secções do cérebro em solução de recuperação de antigénio a 95-97 ° C durante 30 min. Em seguida, lavar 3x em PBS (5 min à temperatura ambiente, com agitação leve).
  4. Rapidamente lâminas secas usando limpadores tarefa delicada para evitar a secagem do tecido, e desenhar uma barreira hidrofóbica ao redor da área do tecido com uma caneta barreira hidrofóbica. Encher o tecido região cercada com tampão de bloqueio [PBS contendo 0,3% de Triton X-100 e 10% de soro normal burro (NDS)], e incubar à temperatura ambiente durante 1 h numa câmara humidificada.
  5. Substituir tampão com anticorpo primário Iba1 (diluído em tampão de bloqueio) a rotular fagócitos mononucleares, e incubar O / N a 4 ° C numa câmara humidif içada de bloqueio. Para hosts de anticorpos e diluições de trabalho, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais.

DIA 5:

  1. Rinseanticorpo primário com banhos 3x PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação leve). Incubar com anticorpo fluorescente secundário (conjugado com um fluoróforo de emissão 594 nm) durante 1 h (em tampão à TA no escuro bloqueio) seguido de banhos 3x com PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação luz). Neste momento, manter secções no escuro para evitar branqueamento sinal fluorescente.

Dia 6 - 7:

  1. Repita os passos 2.5 e 2.6 com CD68 (cérebros de ratos) ou anticorpos LAMP1 (tecido mouse) e anticorpos secundários apropriados (juntamente com um fluoróforo emissão de 488 nm) para rotular phagolysosomes.

DIA 7-8:

  1. Repita os passos 2.5 e 2.6 com OC (tecido de rato) ou anticorpos 4G8 (cérebro do rato) e anticorpos secundários apropriados (acoplado a um fluoróforo 647 nm) para rotular depósitos de Ap.
    NOTA: Como alternativa, o anticorpo 6E10 pode ser utilizado com sucesso tanto em tecidos do rato e rato. Para combinações de anticorpos adequado, consulte a Tabela de Materiais .
  2. Permitir seções completamente O seco / N à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, cobrir amostras com uma lamela selada por meios de montagem de fluorescência contendo DAPI.

3. Aquisição de grande Z-stack confocal conjuntos de dados

Nota: Este protocolo requer um rastreio por laser microscópio confocal totalmente automatizado equipado com uma objectiva 60X e 405 nm, 488 nm, 594 nm e 647 nm lasers. Todo o equipamento é controlado por computador pelo software de imagem e controle laser. Antes de iniciar o protocolo de imagem, ligue o computador, lâmpada de epifluorescência, microscópio, lasers e câmera.

DIA 9:

  1. Escolha a objetiva do microscópio 60X. Adicione o óleo de imersão para a lente, e colocar a amostra no suporte de microscópio estágio slide. Elevar o objetivo até que o óleo faz contato com o slide. Ajuste o plano focal para localizar placas amilóides no hipocampo ou córtex cerebral usando iluminação de epifluorescência através das oculares.
  2. Adquirir im confocalidades de fagócitos mononucleares ativadas circundantes depósitos de amilóide no hipocampo ou córtex de roedores por microscopia confocal (60X ampliação, passos z-stack: 0,25 mm

4. q3DISM

Nota: A fim de produzir resultados significativos, sugerimos analisar um mínimo de 3 imagens por animal / região de interesse. Para cada imagem, a abundância de células a analisar pode variar dependendo de paradigmas experimentais. Nos resultados representativos apresentados neste relatório, foram analisadas 3 células / condição (por exemplo, fagócitos mononucleares distantes ou associados com placas; ver Figuras 1C - D e 2C - D).

DIA 10:

  1. Analisar conjuntos de dados confocal com co-localização de processamento de imagem 3D científico e análise de software (Coloc) módulo de proximidade espacial de Iba1 / CD68 (tecido de rato) ou Iba1 / LAMP1 (tecido mouse) coloração em todos os z-aviões simultaneamente.Criar Iba + / CD68 + ou canais Iba + / LAMP1 + co-localização que correspondem a phagolysosomes dentro de fagócitos mononucleares ativadas.
    1. Escolha TRITC para o canal A (correspondente a coloração Iba1 acoplada com 594 nm fluoróforo) e FITC para o canal B (que corresponde a CD68 ou coloração LAMP1 acoplada com 488 nm fluoróforo). No lado direito da janela do software para 'verificação modo,' selecionar 'limite' e por 'intensidades COLOC,' selecionar 'canais de origem'.
    2. Clique em "Editar" para selecionar "cor Coloc 'no lado direito da janela do software.
    3. Para cada canal de forma independente, ajustar os limites para incluir coloração específica e não incluem sinais de fundo / não-específicos. Uma vez ajustado, não altere os limites entre as imagens para garantir uma análise imparcial. Os voxels colocalized (pixels de todos os z-stacks) será exibido na cor selecionada na etapa 4.1.2 em todas as z-stacks SIMultaneously.
    4. Clique em 'construir canal Coloc'. O canal de co-localização criado aparecerá na janela de ajuste de display.
    5. Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A "% de volume de material / A acima limiar colocalized '% representa o sinal de Iba1 (voxels correspondentes ao fluoróforo 594 nm) co-localizada com LAMP1 ou sinal de CD68 (voxels correspondentes ao fluoróforo 488 nm). Mais simplesmente, este é o volume ocupado pelos monócitos fagolisossomas (ver Figuras 1C e 2C).
      NOTA: '% do volume de material / B acima do limiar colocalized' corresponde a% de sinal LAMP1 ou CD68 colocalized com Iba1. Isto deve ser próximo de 100%, como fagolisossomas são estruturas intracelulares. Os valores são baseados na proporção de sinal de todos os z-stacks acima do limiar colocalized.
  2. Usando o módulo Coloc, analisar o canal Coloc criado na etapa 4.1 para proximidade espacial com OC (ti ratossue) ou 4G8 (tecido mouse) sinais de Ap. Isto permite a quantificação de Ap encapsulado dentro de fagolisossomas.
    1. Seleccionar o canal Um conjunto de dados Coloc (correspondente ao Iba1 / CD68 ou Iba1 / LAMP1 Coloc canal criado no passo 4.1) e Cy5 para o canal B (que corresponde a coloração ou OC 4G8 acoplada com 647 nm fluoróforo).
    2. Construir um canal Coloc como descrito nos passos 4.1.2 a 4.1.5.
    3. Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A "% de volume de material / A acima limiar colocalized 'representa a% de Iba1 / ou LAMP1 Iba1 / CD68 (voxels correspondente ao canal Coloc construído no passo 4.1.5.) Co-localizada com CO ou sinal 4G8 (voxels correspondente ao 647 fluoróforo nm). Este é o volume ocupado por fagolisoss�ico Ap (ver Figuras 1D e 2D).
      NOTA: '% do volume de material / B acima do limiar colocalized' corresponde a% de sinal de Ap total de colocalized com phagolysosomes.Isto pode ser usado para avaliar a fracção do total dos depósitos de Ap encapsulados dentro de fagolisossomas (não mostrado nos presentes resultados representativos).
  3. Use o módulo superar para reconstruir as pilhas de imagens confocal e gerar modelos 3D de Ap encapsulados dentro phagolysosomes monócitos.
    1. Na janela "ajuste display ', selecione TRITC (para mostrar coloração única Iba1). Na janela "Propriedades de volume", clique em "adicionar nova superfície".
    2. No passo '1/5 algoritmo', em 'Configurações', selecione 'superfície'. Além disso, em 'cor', selecione o tipo de cor na paleta ou RGB e ajustar a transparência (vermelho é de transparência de 60% nas Figuras 1B e 2B). a caixa de seleção "selecionar a região de interesse". Clique ao lado.
    3. No Passo '2/5 região de interesse, "desenhar uma janela em torno da célula de interesse, ajustando X, Y e Z coordenadas (ver caixas brancas nas Figuras 1A e 2A). Clique ao lado.
    4. No Passo '3/5 canal de origem ", selecione o canal de origem TRITC. Marque a caixa "suave", e definir o nível de detalhe área de superfície a 0,4 mm. Para "limiar", selecione intensidade absoluta. Clique ao lado.
    5. Na Etapa '4/5 limiar,' ajustar o limiar de forma que o volume criado sobrepõe-se perfeitamente com o sinal de canal TRITC. Clique ao lado.
    6. No Passo '5/5 classificar superfícies ", na seção" tipo de filtro ", selecionar objetos dependendo do seu tamanho para ser incluído ou excluído dos volumes a serem criados. Clique em Concluir, executar todas as etapas de criação, e sair do assistente.
    7. Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal FITC (LAMP1 + ou CD68 + fagolisossomas).
    8. Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal Cy5 (depósitos 4G8 + Ap OC + ou).

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Resultados

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Utilizando a metodologia multi-fase para q3DISM detalhado acima, que são capazes de quantificar a absorção de Ap em fagolisossomas monócitos nos cérebros de murganhos APP / PS1 (Figura 1) e ratos TgF344-AD (Figura 2). Portanto, a metodologia q3DISM permitiu a análise de fagócitos mononucleares em ratinhos e ratos modelos da doença de Alzheimer. Curiosamente, o volume ocupado pelo CD68 + fagolisossomas é aumentado significativamente em fagócito...

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Discussão

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O protocolo que descrevemos neste relatório para a verdadeira quantificação 3D de Ap fagocitose in vivo pelos fagócitos mononucleares depende de rotulagem específica dos compartimentos celulares e subcelulares, bem como depósitos de Ap. Especificamente, usamos Iba1 (ionizada-se ligar à molécula de cálcio Adaptador 1), uma proteína que está envolvida em membrana ruffling e fagocitose por activação de célula 18, 19, para corar os fagócitos mononucleares cerebrais. Enquanto as célu...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-V. G-S. é apoiado por um Prêmio de Bolsa de Pesquisa da Doença de Alzheimer da Fundação BrightFocus (A2015309F) e um Prêmio Jovem Investigador da Associação de Alzheimer, Capítulo Southland da Califórnia. T.M.W. é apoiado por uma Fundação ARCS e John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (1R01NS076794-01, para T.T.), um Prêmio Zenith Fellows da Associação de Alzheimer (ZEN-10-174633, para T.T.) e um Prêmio Julie Martin Mid-Career da Federação Americana de Pesquisa do Envelhecimento / Fundação Médica Ellison (M11472, para T.T.). Somos gratos pelos fundos iniciais do Zilkha Neurogenetic Institute, que ajudaram a tornar este trabalho possível.  

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IsofluranoAbbottNDC 0044-5260-05
Tesoura de dissecaçãoVWR82027-582
Tesoura de dissecação Ponta rombaVWR82027-588
PinçaVWR94024-408
Agulha 23 GVWRBD305145
bomba peristáltica FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02Solução salina tamponada com fosfato; Concentração de trabalho 1x
Matriz de Cérebro de Rato Adulto, Fatias Coronais, Aço Inoxidável 1 mm Kent ScientificRBMS-200C
Matriz de Cérebro de Rato Adulto, Fatias Coronais, Aço Inoxidável 1 mm Kent ScientificRBMS-305C 
Solução aquosa de paraformaldeído a 32% (PFA)EMS15714-SCuidado: Tóxico. Concentração de trabalho: 4% em PBS
EtanolVWR89125-188Várias concentrações, veja o protocolo
Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
Embedding and Infiltration ParaffinVWR15147-839
Micrótomo Leica RM2125Leica Biosystems
Lâminas de Micrótomo Descartáveis VWR25608-964
Banho-maria Leica HI 1210Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plusVWR48311-703
XilenoSigma-Aldrich534056-4X4LCuidado: Tóxico 
Solução de Recuperação de Alvo 10xDAKOS1699Concentração de trabalho 1x
KimWipesVWR21905-026
Caneta PAP hidrofóbicaVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
Soro de burro normal (NDS)Jackson Immuno017-000-121
LamínulasVWR48393081
Prolongue o reagente antidesvanecimento Gold com DAPILife TechnologiesP36935
Rack de Vidro DeslizanteVWR100492-942
Anticorpo Iba1 (policlonal, coelho)Wako019-19741 Concentração de trabalho 1:200
Anticorpo Iba1 (policlonal, caprino)LifeSpan BioscienceLS-B2645Concentração de trabalho 1:200
anticorpo CD68 [KP1] de rato (monoclonal, camundongo)Abcamab955Concentração de trabalho 1:200
anticorpo CD68 [FA-11] de camundongo (monoclonal, rato)Abcamab53444Concentração de trabalho 1:200
camundongo CD107a (LAMP1) anticorpo (monoclonal, rato)Affymetrix14-1071Concentração de trabalho 1:100
Beta-Amilóide, 17 - 24 (4G8) anticorpo (monoclonal, camundongo)CovanceSIG-39220Concentração de trabalho 1:200
Beta-Amilóide, 1 - 16 (6E10) anticorpo (monoclonal, camundongo)CovanceSIG-39320Concentração de trabalho 1:200
OC anticorpo (policlonal, coelho)Dotado por D. H. Cribbs e C. G. Glabe (UC Irvine)Concentração de trabalho 1:200
Anticorpo secundário de camundongo Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Concentração de trabalho 1:1.000
Anticorpo secundário de rato Alexa Fluor 488InvitrogenA-11006Concentração de trabalho 1:1.000
Alexa Fluor 594 anticorpo secundário de coelhoInvitrogenA-11037Concentração de trabalho 1:1.000
Alexa Fluor 594 anticorpo secundário de cabraInvitrogenA-11080Concentração de trabalho 1:1,000
Alexa Fluor 647 anticorpo secundário de camundongoInvitrogenA-21235Concentração de trabalho 1:1,000
Alexa Fluor 647 anticorpo secundário de coelhoInvitrogenA-21443Concentração de trabalho 1:1,000
Óleo de imersãoNikon 
Microscópio Confocal A1Nikon 
Software de pesquisa avançada NIS ElementsNikon 
Imaris:Software Bitplane versão 7.6Bitplane"coloc" e "supass". Como alternativa, o freeware de código aberto  O ImageJ pode ser usado para colocalização  Análise de conjuntos de dados confocais Z-stacks.
São utilizados os módulos

Referências

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