Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

Summary

MicroSecure Vitrification foi desenvolvido como um sistema de dispositivo de vitrificação fechado asséptico não comercial que está em conformidade com as boas práticas de fabricação e manuseio de tecidos da FDA. Devido à retirada de canudos de embriões com tamponamento hidrofóbico da indústria, o procedimento de vitrificação foi modificado para incluir uma vedação interna antes do tampão de algodão interno padrão.

Abstract

Clínica vitrificação embrião evoluiu com o desenvolvimento de dispositivos de vitrificação únicas no século ²¹ e com o equívoco de que o resfriamento ultra-rápida em um sistema "aberto" (ou seja, direta LN ₂ contato) era uma necessidade para otimizar o sucesso vitrificação. O dogma em torno da importância de taxas de resfriamento levou a práticas inseguras sujeitas à variação técnica e à criação de dispositivos de vitrificação, que desrespeitam importantes fatores de controle de qualidade (por exemplo, facilidade de uso, repetibilidade, a fiabilidade, segurança rotulagem, segurança e armazenamento). Compreender as falhas de outros dispositivos permitidos para o desenvolvimento de um método de uS-VTF segura, segura, repetível e confiável teve como objetivo minimizar a variação intra e inter-técnico de controle de qualidade. Igualmente importante, ele combinou a disponibilidade de dois dispositivos FDA compatíveis existentes: 1) a ionom�ico palha resina embrião de 0,3 mL com internalizado, de duas cores, adulterar-protulagem telhado com potencial de solda da vedação repetível; e 2) encurtado, comumente utilizado, de 300 uM ID flexipettes estéreis para carregar directamente o embrião (s), a fim de criar um dispositivo de vitrificação global altamente eficaz. À semelhança de outros asséptica, fechou sistemas de vitrificação (por exemplo, alta Vitrificação de Segurança (HSV), Rapid-i, e VitriSafe) efetivamente usada na medicina reprodutiva, microSecure Vitrificação (uS-VTF) provou que ele pode atingir uma alta de sobrevivência pós-aquecimento e gravidez resultados com a sua atenção para a simplicidade, e reduziu a variação técnica. Embora a palha embrião 0,3 ml, contendo uma ficha interna hidrofóbica foi comercialmente substituído com uma palha sémen padrão possuindo pirrolidona algodão de polivinil (PVP) plugs, manteve a sua composição de resina ionom�ico para garantir a vedação de solda. No entanto, os tampões de algodão pode pavio o conteúdo fluido-embrião do flexipettes em cima do contato. Um método uS-VTF modificado foi adaptado para incluir uma soldadura interna adicionalselar antes de o bujão no lado do dispositivo de carregamento. A etapa técnica adicionado ao procedimento de uS-VTF não afetou sua aplicação bem-sucedida, as taxas de sobrevivência tão elevadas (> 95%) e as taxas de gravidez continuam até hoje.

Introduction

A vitrificação é a tecnologia assistida maior impacto único reprodutiva na indústria de fertilização in vitro (FIV) desde o desenvolvimento da injeção intracitoplasmática de espermatozóides. Hoje, os blastocistos são criopreservadas sem a perda na viabilidade do embrião anteriormente associado com métodos slow-congelação convencionais ^1. Com sobrevivência embrionária pós-aquecimento confiável, a indústria da infertilidade está se transformando em o uso preferencial de ciclos de transferência de embriões criopreservados, que produzem os resultados da gravidez semelhantes ou mais elevados do que a transferência de embrião tradicional fresco. Em associação com a biópsia do blastocisto e rastreio genético pré-implantação (PGS), vitrificação tornou-se uma ferramenta clínica vital para otimizar os resultados de nascidos vivos saudáveis através euploid única transferência do embrião ^{2, 3.}

Vitrificação embrião murino foi desenvolvido em meados dos anos 1980 ^{4, 5} e adaptado para agricultura animal até 1990 ^6. Com base na premissa de que as soluções de vitrificação formar um estado metaestável glasseous, livre de danificar a formação de cristais de gelo, que tem provado mais eficientemente preservar a integridade celular completa de embriões. Curiosamente, a aceitação promissora de vitrificação em embriologia humana não começou a ser realizado até o século ^21. Publicações antigas que promovem o uso de vitrificação coincidiu com o desenvolvimento de originais "abertos" os dispositivos do sistema ^{7, 8, 9.} No entanto, a adoção de vitrificação para a prática clínica foi lento, como veio num momento em que melhorias no congelamento lento blastocisto foram ocorrendo também. Bem sucedido convencional de congelamento de taxa lenta, em adição à vitrificação, foram alinhadas com melhoramentos em sistemas de cultura de embriões, assim como com a incorion de abordagens blastocele-colapso, o que aumentou tanto a sobrevida global dos trofectoderma e, posteriormente, o implante ^10.

Na última década, a tecnologia de vitrificação suplantou rapidamente práticas de congelamento convencionais. Em grande medida, isso deveu-se ao desenvolvimento de dispositivos de vitrificação especializados. Alguns destes dispositivos têm prejudicado a segurança global, eficiência e eficácia da vitrificação clínica através da introdução de falhas de projeto inerentes aos dispositivos utilizados na indústria de fertilização in vitro ^11. Na verdade, as nuances de diferentes dispositivos introduzir variação técnico significativo entre os programas, comumente referido como "assinaturas técnicas" ^12. Assim, revistas científicas, como o Journal of Experiments visualizados (JoVE), pode servir como um recurso valioso para demonstrar detalhes técnicos, o que ajudará a reduzir a variação resultado. Outro problema permanente é que éome embriologistas continuam a ser mal informado, ainda hoje, com base em alegações de que o "arrefecimento ultra-rápida de embriões ou ovócitos em um" sistema de vitrificação aberto "(ou seja, o contato embrião direto com azoto líquido (LN ₂₎₎ é um pré-requisito para otimizar taxas de sucesso. " Claramente, esta crença é impreciso, com base no sucesso comprovado de asséptica sistemas ^{13, 14, 15} fechado.

Com base nos princípios cryobiological de vitrificação, a eficácia da vitrificação é mais altamente dependente taxas de aquecimento do que sobre as taxas de ^{16, 17, 18} de arrefecimento. De um modo geral, independente do dispositivo de vitrificação utilizado, a taxa de aquecimento deve exceder a taxa de arrefecimento para assegurar altas taxas de sobrevivência. Taxas de aquecimento elevadas minimizar a oportunidade para qualquer crescimento do gelo (ou seja, o recrystallization de impurezas nucleadas em crio soluções) durante a fase de devitrification do aquecimento. Concedida, a estabilidade da solução de vitrificação (ou seja, o tipo e concentração de agentes crioprotectores utilizados) podem ter um efeito de confusão, mas esta é tratada em uma publicação separada ^11. Considerando as questões de taxa de refrigeração-aquecimento, MicroSecure de vitrificação (uS-VTF) foi desenvolvido em 2008 como um método barato, não-comercial, FDA-compliant que otimizou os aspectos da vitrificação de controle de qualidade. Era o único que ofereceu à prova de violação, internalizado, a rotulagem de duas cores. Além disso, através do carregamento e o armazenamento dos embriões directamente no flexipette estéril usada para pipetagem (isto é, sem pipetagem para uma superfície de dispositivo secundário) e usando palhetas ionomérico-resina que vedam completamente solda utilizando um aferidor automatizado, variação técnica tem sido eficazmente eliminada.

Ao avaliar a completeness de dispositivos de vitrificação para uso potencial, existem vários fatores de controle de qualidade que devem ser levadas em consideração, incluindo: 1) A rotulagem potenciais etiquetas -Pode ser firmemente aderido? elas são à prova de falsificação? Será que eles oferecem duas cores potencial de identificação? Ele exige um rótulo secundário, e pode o rótulo ser facilmente removido para fins de manutenção de registros (ou seja, o paciente verificação) pós-aquecimento? 2) facilidade técnica embriões -Pode ser facilmente carregado no / para o dispositivo de uma forma atempada e simplesmente identificadas e rastreadas pós-aquecimento? 3) Processo simplicidade / repetibilidade -Será que o método de vitrificação oferta simplicidade e confiabilidade que facilmente permite a repetibilidade, o que minimiza a variação entre técnicos (internos) e programas (externos)? 4) LN ₂ capacidade de armazenamento -Pode os dispositivos ser facilmente e com segurança tratadas e identificadas? É sua storaiva espaço potencial eficiente? Será que o dispositivo de oferta de segurança e protecção contra danos físicos ou possíveis contaminantes como um sistema fechado asséptica? 5) Potencial de Recuperação / sobrevivência -É o projeto do dispositivo propenso a potenciais problemas na recuperação garantida de embriões, e que de forma confiável vitrificar e manter completa integridade celular pós-aquecimento? A última preocupação determinada qualidade, a taxa de recuperação, foi efectivamente surpreendentemente minimizado em relatórios publicados; isso é feito geralmente escondendo o desfecho desfavorável (ou seja, embrião perdido ou ovo) em tipicamente boas taxas de sobrevivência. Qualquer dispositivo propenso a recuperação inconsistente (<99%) está seriamente errado e constitui um passivo processual.

Nossa asséptica, fechou método uS-VTF foi estrategicamente desenvolvido para explicar cada medida de controle de qualidade. No entanto, após 5 anos de sucesso clínico superior e validação ^14, o procedimento teve to ser modificado. As palhetas de embrião de 0,3 mL originais (que possuem um tampão hidrofóbico) foram removidos da indústria de FIV e substituído com um canudo de sémen 0,3 mL possuindo um tampão de algodão / PVP padrão (isto é, sémen renomeado como uma palha / embrião). Este artigo descreve as etapas processuais e estratégias específicas necessárias para implementar uS-VTF de forma segura, simples e eficaz. Além disso, destaca-se a modificação (s) necessária para dar conta de forma confiável por limitações de fornecimento, até o momento em um recipiente de palha alternativa ideal é reintroduzido de volta para o laboratório clínico.

Protocol

O desenvolvimento do processo de uS-VTF foi realizado como parte de um estudo aprovado Institutional Review Board (IRB) em 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) em oócitos humanos e criopreservação de embriões. O procedimento já foi aplicada rotineiramente para o tratamento clínico de pacientes de infertilidade que assinaram formulários de consentimento informado.

1. Considerações de controle de qualidade

1. Use cores diferentes (por exemplo, canetas, etiquetas ou de identificação (ID) varetas ou fichas) para distinguir os pacientes se criopreservação mais de um grupo de embriões em um dia.
2. Use pratos diferentes e pipetas para cada paciente. Minimizar o volume do meio de transferência quando se deslocam os blastocistos de uma solução para outro.
3. Criopreservação de um blastocisto por palha ou dispositivo. Manter a técnica asséptica / estéril e aderir a todas as precauções de segurança.
4. Confirmar Formulário de Referência do Physicians 'e assinado consentimento do paciente antes initiating os procedimentos. Verifique a disposição de embrião (s) dos pacientes no inventário.
5. Use um "lançamento de Responsabilidade e Consentimento para os Transportes" se os blastocistos devem ser transferidos para outra unidade. Certifique-se de que todas as assinaturas são testemunhou no local ou autenticada.
6. Confirmar medidas adequadas de controle de qualidade para o meio e os suplementos de proteína, conforme o caso, incluindo bioensaios, determinações de endotoxinas e de expiração / verificação do número de lote e rastreamento.
7. Estabelecer limites críticos (ou seja, baixos níveis de preocupação) para monitorização clínica resultado criopreservação e avaliação, tais como taxas de recuperação: <95%, as taxas de sobrevivência: <80%, e as taxas de gravidez clínica, utilizando blastócitos single-euploid: <50%.

2. Procedimento Criopreservação

1. Preparação
   1. Completar a documentação apropriada, incluindo dados que entram no planilhas e banco de dados criopreservação e log de inventário(S).
   2. Preparar soluções de criopreservação frescas ou usar uma fonte comercial (respeitando as condições de armazenamento e prazo de validade recomendados pelo fabricante).
   3. preparação de palha.
      1. Abra o lado da rotulagem dos pacotes estéreis individualizados. Retire o bocal de enchimento encontrado na palha tradicional embrião de 0,3 mL, segurando-o contra a embalagem e parcialmente levantando e puxando a palha para fora; isto irá expor a extremidade da etiqueta para condições ambientes, enquanto a palha repousa de forma asséptica no interior da embalagem de plástico.
         1. (Modificação) Para 0,3 ml de sêmen / palhas embrião, empurre a ficha até 0,5 cm. Aplicar uma vedação interna em frente do tampão de algodão-PVP através da utilização de um cimento base de mesa de impulso.
         2. Defina a palha sobre a superfície de teflon do eletrodo, em frente do plugue. Pressione a alça para ativar o calor. Solte a alça quando a luz vermelha aparece. Para garantir uma vedação de solda completa, aquecer a uma temperatura que suficientemente flattens as superfícies opostas, em seguida, vire-o 180 ° e selar a superfície oposta ^19, conforme necessário.
   4. Usando um cryomarker, etiquetar cada palha / dispositivo e cryogoblet com o nome do paciente, um número de identificação único (por exemplo, CPF, data de nascimento, ou o paciente número de identificação), ea data de congelamento. Também incluem um número único em cada palheta / dispositivo (por exemplo, 1, 2, 3, etc.).
      1. Fixar a etiqueta (de preferência, coloridas) para uma haste ID ponderadas em cor a ser inserido e selado em um canudo embrião de 0,3 mL. Retornar a palha à sua embalagem estéril indivíduo até o uso.
         Nota: Se apenas 30 mm ponderadas em cor ID hastes estão disponíveis, então é necessária a inserção adicional dos dois rolamentos de esferas, adjacente a cada lado da haste da ID.
   5. Identificar cada cana com um número de identificação inscrito único. Identificar um número tanque ₂ de armazenamento LN e um número canister, onde amostra (s) de cada paciente pode ser stORed longo prazo.
   6. Preparar pratos crio fresco (100 mm) por rotular a superfície de fundo com o nome do paciente, solução ID, e o embrião / segurando gota ID (Figura 1A). Especificamente, configurar 4 linhas de gotículas: meio isotônico HEPES (em cima), V1 (solução de equilíbrio (ES)), V2 (solução intermédia (IS)), V3 (solução de vitrificação (VS); inferior). Escreva o ID do embrião no lado superior direito com colunas rotuladas.
      Nota: Uma série de 25 a 50 uL lavar gotículas (n = 3) é usado para garantir que cada uma individual final de 10 a 15 uL que prende gotícula / tipo de solução (isto é, V1, V2, V3 ou) e é pura não diluído. Utilizando esta abordagem, até cinco embriões individuais podem por vitrificados usando um único prato. Mantenha cada prato coberto quando não estiver em uso para evitar qualquer temperatura ambiente evaporação / desidratação das gotículas.
   7. Prepare flexipettes estéreis ao cortar 3 cm da sua extremidade de base (referido como "dicas de VTF"). Inseri-los no indivíduopipetas (fixado em 3 mL) e definir as pontas de pipeta-VTF na posição vertical em um rack de tubo de isopor (Figura 1B).
2. A seleção do embrião
   1. Confirmar paciente / identificação da amostra.
   2. Utilizando um microscópio invertido (200 - aumento de 400X), grau e classificar os blastocistos de acordo com o sistema de classificação Gardner ^20, utilizando uma classificação numérica de 1 a 6 para blastocistos primordiais a eclodidos, respectivamente, e um A, B ou C grade atribuído à massa interna celular (ICM) e trofectoderma (TE).
      Nota: Em preparação para a biópsia do blastocisto e análise euploidy, a zona pelúcida é pré-planejado por ablação a laser no Dia 3 para promover a herniação precoce da TE e, portanto, requer uma classificação classificação modificada ^2. Em resumo, Grau 3 completa blastocistos exposição até 10% TE hérnia, Grau 4 expandiu blastocistos são 10 - 50% chocado, e Grau 5 blastocistos para incubação tem> 50% TE extrusioN (Figura 2A-C).
      Nota: Nossa preferência é criopreservação de grau 3 ou blastocistos mais elevados de qualidade ≥BB no dia 5 ou 6. No entanto, blastocistos vitrificados de qualidade inferior (C) e embriões pós-compactação em fases anteriores (incluindo tarde mórula para grau 1 ou 2 blastocistos ) pode certamente sobreviver aquecer completamente intacto e produzir embriões viáveis ​​capazes de atingir nascidos vivos.
   3. Recolher o blastocele de cada blastocisto antes do início do processo de cryodilution por micropuncturing uma junção trofectoderma ou através da realização de uma ablação por laser pulsado de uma célula trophectodermal ²¹ se utilizando soluções de vitrificação de baixo molarity (<6,5 M ou 40% v / v).
      Nota: A necessidade de recolher os blastocistos não é dependente do dispositivo. Em nosso próprio desenvolvimento precoce de uS-VTF (2008), que inicialmente utilizado etileno glicol (EG) / soluções de DMSO com sucesso com ovócitos (1 de 1 gestação a termo), mas um sub-óptima (<80%)sobrevivência / desenvolvimento de blastocistos rato ¹⁶ foi experimentado por outros ^21. Desde soluções de alta baseada em glicerol molares (superior a 7,9 M) são usados ​​em nosso sistema atual VTF (desde 2009), física colapso blastocele é desnecessário. No entanto, a eclosão seletiva de blastocistos eclodidos é aconselhável em geral.
3. Cryodilution e blastocisto Carregando
   1. Remova a placa de cultura de paciente da incubadora e confirmar a identificação do doente / amostra com outra pessoa (ou seja, testemunhado por uma fonte secundária) antes de remover o embrião (s) a ser vitrificados.
   2. Confirmar o desenvolvimento de blastocisto por passo 2.2.2, atualizar a folha de dados crio e, sob lupa estereoscópica, blastocisto (s) pipeta da placa de cultura em uma gota de exploração isotônica do prato crio.
   3. Mova cada blastocisto em gotículas de retenção individuais usando a flexipette vitrificação (ou seja, a ponta VTF).
   4. mova cadablastocisto em solução V1 (ES).
      1. Prefill o flexipette com solução V1 (3 mL) e colocar a metade do conteúdo para o embrião.
      2. Aspirar o embrião e passar para o primeiro de três V1 gotículas de lavagem (referidos no passo 2.1.6), Pipeta o embrião 2 - 3 vezes em torno do perímetro, e limpar o conteúdo da pipeta na gotícula (evitando a formação de bolhas) ou no exterior, no superfície prato.
   5. Encha a ponta VTF com a próxima gota lavagem V1 e repita a aspiração do embrião (s). Repetir uma terceira vez e mover o blastocisto (s) para uma queda de exploração V1 indivíduo. Os passos de diluição / de lavagem deve levar de 30 a 45 s. Pré-carga de cada ponta de VTF para a próxima solução (por exemplo, V2), inserir a pipeta em um rack, e usar a próxima pipeta (de acordo com a configuração no passo 2.1.7) (Figura 1B).
      Observação: Uma vez que o tempo total de exposição em sulfóxido de não-dimetilo (DMSO) contendo soluções de V1 e V2 é de 5 minutos cada, a pipetagem do indivblastocistos dupla deve ser uniformemente escalonados dentro desse intervalo, considerando-se que o passo V3 final exigirá pelo menos 1 min por blastocisto para executar. Por exemplo, se houver 4 blastocistos de um grupo de vitrificação, blastocistos pipeta # 1-2-3-4 em intervalos de 75 s.
      Nota: O protocolo de diluição Innovative Cryo Enterprises (ICE) descrito acima é distintamente diferente da maioria dos outros procedimentos de vitrificação comercial, que geralmente envolvem soluções contendo DMSO. Esses protocolos de alcançar os mesmos diluições graduais através de uma gradual, mas menos controlada, fusão de solução de lavagem (ou seja, meio isotônico), ES, e VS.
   6. Repita os passos 2.3.4 e 2.3.5 usando soluções V2 (IS).
   7. Repita os passos 2.3.4 e 2.3.5 usando V3 soluções (VS).
   8. Após a colocação de cada blastocisto na segurando V3 gota, limpar a solução residual e bolhas da ponta VTF (fora da gota) e, em seguida, preencher a ponta completamente com V3 limpo em torno do embrião. ExpEL aproximadamente um terço do volume (1 mL) e pipeta de blastocisto (s) restante e V3 completamente para dentro da ponta VTF.
   9. Remover a ponta da pipeta VTF, limpar a seco da ponta V3 residual sobre a superfície externa, utilizando uma compressa de gaze estéril, e inserir a ponta final do primeiro na extremidade aberta da palha pré-rotulados. A "ponta seca" é fundamental para prevenir uma possível adesão palha interior.
   10. Inverta a palha (etiqueta acabar para baixo), observe a ponta na ficha interior ou selo, e selar com segurança a extremidade aberta com 1 cm de espaço aéreo. De preferência, utilizar um dispositivo de fecho automático (por exemplo, Syms I) para eliminar a variação técnica.
       Nota: A vantagem de usar palhas que são compostas de uma resina plástica ionom�ico (por exemplo, HSV ou uS-VTF) é que o uso de todo o calor adequadamente operado dispositivo de vedação cria um selo de confiança "solda", conforme indicado no passo 2.1.3.1.
   11. Uma vez fechado, mergulhar a palha fechado diretamente no LN ₂ em um stainless aço Dewar frasco e colocar a palha (s) para a taça aberta ligada a cana do paciente para armazenamento.
       Nota: Como palhas uS-VTF usar 40 mm hastes ID ponderados para compensar a flutuabilidade da palha cheia de ar, o uso de taças invertidas ou cryovials vazias para cobrir a amostra (s) não é necessária a menos que o transporte está envolvido.
4. Aquecimento e Cryo-solução de eluição / Diluição
   1. Confirmar Formulário dos Médicos de Referência em relação a data de transferência de embriões vitrificados, hora marcada, e os detalhes do embrião (número de descongelar / transferência, o número de embriões específico se PGS testado, etc.).
   2. Preparar soluções frescas de aquecimento (solução de 1,0 M de sacarose) e / ou utilizar uma fonte comercial (recomendado uma semana-1 mês de vida útil uma vez que em uso, armazenamento de 4 ° C).
      1. Alíquota de 17,1 g de sacarose em 50 mL frascos estéreis após a abertura inicial (por exemplo, fonte de abastecimento semanal), devido aos riscos de acumulação de endotoxina em gra sacarosenules sobre exposição ambiente repetido.
      2. Misture sacarose granular pré-pesado em solução (1,0 M = 3,42 g / 10 mL de HEPES fluido tubária humana [H-HTF]) e aquecer a solução até 37 ° C para aumentar a solubilidade dos grânulos. Repetidamente inverter o recipiente para ajudar a acelerar e completar a mistura final.
         Nota: filtração (filtro de 0,22 mícrons) realizada utilizando unidades de filtração de pressão positiva é recomendado para soluções viscosas (> de sacarose 0,5 M) ou volumes elevados. bombas de pressão de mão são suficientes e barato, enquanto uma bomba elétrica é barulhento, provoca vibrações, e simplesmente não é necessário.
   3. Quente tubo (37 ° C), uma de 10 ml cada uma solução de sacarose 1,0 M e médio H-HTF por paciente para uS-VTF utilização banho de aquecimento.
   4. Prepare frescos descongelamento pratos (placa de 6 poços), rotulando a superfície da tampa com o nome do paciente e os IDs de solução.
      Nota: Neste caso, usamos: (1) lavagem T1 (200 μ; G sem uma camada de óleo, (2) T1 (100 mL) com 1 mL de óleo, (3) T2 (100 uL) com óleo, (4) T3 (100 uL) com óleo, (5) de T4 (100 mL) com óleo, e (6) forma T5 / 200 ul isotónicas HEPES-tamponizada com 10% de albumina de soro humano (HSA) ou 20% de substituto de soro, sem uma camada de óleo. Aplique uma sacarose universal solução passo-down protocolo de T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M, e T4 = 0,125 M-se o ICE ou de outra fonte comercial não estiver disponível, tal como proposto para os embriões slow-congelados ²² . Além disso, note que a lavagem inicial T1 e T5 os equilibrations finais pode ser realizada em 30 mm pratos Petri e o prato 4-bem utilizado para os passos 2-5 acima, envolvendo uma camada de óleo.
   5. Descongelar embrião (s) de um paciente de cada vez.
      1. Verifique Formulário de Referência do Physicians 'e confirme o ciclo antes de aquecer o número indicado (isto é, 1 ou 2 blastocistos); avaliar a sobrevida viabilidade / provável observando alterações osmóticos (ie, SHRinkage e reidratação) e membranas íntegras, e, se questionável, entre em contato com o médico e / ou paciente antes de se aquecer outra blastocisto.
   6. Confirmar a identificação do paciente / espécime com um colega de trabalho (ou seja, testemunhado por uma fonte secundária).
   7. Coloque a cana paciente em um frasco Dewar cheio com LN ₂ e isolar a identificar palha para ser aquecido.
   8. Traga o prato de diluição de 6 poços para o centro do palco estereomicroscópio. A colocação de um prato de 60 mm de Petri para um lado (isto é, dependendo da mão esquerda ou a preferência do lado direito do técnico), adicionar a sacarose aquecida (1,0 M) e soluções de H-HTF para criar um aquecimento de sacarose 0,5 M banho (descoberto).
      Nota: dicas de VTF só são aquecidos em soluções 0,5 M sacarose como uma salvaguarda QC, para garantir a retenção de viabilidade do embrião no evento raro que um embrião é expulso após rápido aquecimento ^22.
   9. Segure o selo de palha superior acima do nível do líquidopara confirmar a identidade e, em seguida, segure e fixe a palha abaixo a ficha interna usando uma tesoura Mayo (a ponta VTF ainda deve ser submerso em LN _2).
      1. Bata firmemente a tesoura sobre o frasco Dewar (algumas vezes) para remover a ponta VTF da parede lateral da palha interna como medida de precaução QC; Se a ponta VTF é aderente, a batida assegura que a base da ponta cai para a extremidade selada oposta à extremidade marcado, proporcionando assim um espaço de ar perto da extremidade do tampão.
   10. Levantar a palha com a tesoura para o ar ambiente numa posição horizontal (ao lado de ou abaixo da superfície do estereoscópio) e agarrar a extremidade não marcado (marcador para o lado direito). Cortar a palha na ficha interior ou selar e levantá-lo acima do prato de banho de aquecimento. Verter a ponta VTF para o banho de sacarose quente com um ângulo de 60 ° até que esteja completamente extrudida e foi aquecida rapidamente (> 6000 ° C / min); a base do flexipette vai descansar acima da parede lateral do prato.
       1. Permitir que a ti VTFp em queda livre para o banho. Bata suavemente a superfície de palha superior se a ponta não emerge imediatamente. Se ele só aparece de forma parte, ajudar na extrusão, segurando o eixo do flexipette com a tesoura ou uma pinça fina.
   11. Após 5 - 10 s, segure a base da pipeta e inserir em um dispositivo de pipetas descartáveis; um buraco no bulbo actua para libertar a pressão sobre a inserção. Cobrir o buraco lâmpada com um dedo indicador e aperte suavemente o bulbo para liberar o blastocisto vitrificados para a lavagem T1 (# 1) durante a visualização em lupa estereoscópica. Uma vez confirmada, desmarque a solução e bolhas residual V3 (VS) por pressão positiva, evacuando o conteúdo para o centro, descarte poço não utilizado. Comece a 5 min temporizador.
       Nota: Todos os passos de diluição de sacarose são realizados à temperatura ambiente (21 ± 2 ° C).
   12. Retire o bico VTF e colocá-lo em uma pipeta. Continuar movendo o embrião em T1 # 2 sob óleo durante o tempo restante (aproximadamente 3-4 minutos).
       1. Se um segundo blastocisto é necessário para a transferência, imediatamente aquecer uma segunda ponta de palha e VTF (repetindo os passos 2.4.9 - 2.4.11) a partir do paciente antes do início do passo 2.4.12. Mover ambos os blastocistos juntos por uma eluição mínima em T1 (1.0 M de sacarose) de pelo menos 3 min.
   13. Pré-preencher o flexipette com a solução seguinte, e, em seguida, deslocar e diluir o blastocisto (s) no T2, T3, e T4, em intervalos de 3 min. Se a zona pelúcida não tenha sido previamente laser de ablação (ou seja, chocado), fazê-lo em T4. Coloque o prato no palco de um microscópio invertido e imagem do embrião em um monitor de computador. Alinhar a zona dentro de um círculo designado vermelho e activar 2 ou 3 impulsos de um laser de diodo (começando na extremidade do espaço perivitelino e movendo-se para fora) para criar uma abertura ^{2, 19.}
   14. Equilibrar os blastocistos em T5 (isto é, meio isotónico) durante 5 min numa superfície quente (37 ° C).
   15. Avaliar a sobrevivência do embrião inicial com base na presença predominante de membranas celulares intactas com citoplasma mesmo, translúcido desprovidas de escurecimento picnótica. Coloque o embrião (s) na cultura para 2 - 6 h antes da transferência do embrião, momento em que, o desenvolvimento do embrião / sobrevivência deve ser re-avaliadas e documentadas.
       Nota: Se houver mais de um blastocisto viável existe no momento da transferência e o paciente opta por prosseguir com apenas 1 blastocisto, blastocisto suplementar pode então ser sucesso re-vitrificados (rVTF), repetindo os passos 2.3.3 - 2.3.11. Temos vários nascidos vivos confirmados seguintes eventos rVTF individuais.
       Nota: rVTF foi realizada experimentalmente até 5 vezes sem efeito significativo sobre a sobrevivência / viabilidade de blastocistos humanos aneuploidia vitrificados em uma solução à base de glicerol metaestável.

Results

1.341 blastocistos vitrificados foram aquecidos entre 2012 a junho de 2014, e 1.341 embriões recuperados (100%), enquanto 1.316 sobreviveram (98,1%). blastocistos biopsiados experimentado ao longo de sobrevivência de 99,5%. Ao transferir predominantemente única, geneticamente testados, euploid, embriões vitrificados, fomos capazes de alcançar algumas das mais altas taxas de implantação e taxas de nascidos vivos nos EUA, independentemente da idade (Figura 3) ^20, de acordo com recentes estatísticas nacionais notificados pelo Centro de Controle de Doenças e da Sociedade para Tecnologias de reprodução assistida (Tabelas 1 e 2). Avaliando um paciente população bom prognóstico (menos de 35 anos) para os ciclos criopreservados sozinho (Tabela 1), nosso laboratório superou a média nacional para ambas as taxas de implantação (ou seja, a eficiência de um embrião para estabelecer uma gravidez) e, finalmente, viver taxas de natalidade mais de 30%. Além disso, a validação / verificação inicial dos nossos palhas de armazenamento modificados em meados de 2014 usando 70, blastocistos aneuploides re-vitrificados investigação de consentida resultou na recuperação de 100% e 100% de sobrevivência.

Figura 1. Configuração MicroSecure VTF. O prato VTF (A) é montado com 3 linhas distintas de soluções de vitrificação, que utilizam 3 gotas de lavagem antes da colocação em distintas, gotículas de retenção numerados. Além disso, as pipetas com pontas individuais VTF encurtadas (isto é, flexipettes 300 mícrons ID) são protegidas e organizados num suporte de tubos de isopor (B), que pode ser rodado para a utilização adequada. Note-se que um conjunto descartável representante pipetagem micropipeta lâmpada está descansando na prateleira de isopor. arget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Modificado Blastocyst Grading System. Nosso sistema de blastocisto classificação Gardner modificado explica a hérnia induzida de células TE para facilitar a biópsia do blastocisto. A modificação considera a eclosão prematura de blastocistos completos (A: Grau 3 = menos de 10% hérnia) e blastocistos expandidos (B: Grau 4 = até 50% hérnia), enquanto um blastocisto incubação (C) tem mais de 50% hérnia ^16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. gravidez resultados comparativos. Ao longo de um intervalo cumulativa de 1,5 anos, os dados de gravidez foram comparados para avaliar os efeitos de transferência de blastocistos euplóides vitrificados-aquecido (n = 172 ciclos / 144 transferências) em comparação com os ciclos não-PGS (n = 160 ciclos / 153 transferências) que envolvem predominantemente fresco transfere ^18. Para os nossos propósitos experimentais, estes dados revelam claramente que blastocistos biopsiados vitrificados pelo procedimento uS-VTF manter a sua viabilidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fonte de dados	# Cycles	A média de # de embriões transferidos	Implantação de taxas (%)	Taxas de nascidos vivos (%)
Lab NB *	144	1.2	74.00%	74.50%
Média nacional	20423	1.7	39.60%	44.10%
* Os dados foram calculados com base no desempenho dos 2014 Orange County Fertilidade, sul da Califórnia Centro de Fertilidade e do California Centro Southern para clínicas de medicina reprodutiva usando o laboratório de fertilidade Ovation atual (NB Lab), que fundou o procedimento microSecure vitrificação em 2008.

Tabela 1. 2014 CDC Assistida Estatísticas Reprodutivos. dados gravidez transferência de embriões congelados de mulheres com menos de 35 anos de idade de três relatórios clínicas médicas usando o nosso Lab NB comparação com a média nacional dos EUA 2013, de mais de 450 clínicas de relatórios.

Médias SART Nacionais
Clinic - Estado	Mulheres	Mulheres	Mulheres	Mulheres
	<35 anos	35-37 anos	38-40 anos	41-42 anos
SCCRM-CA *	63,1%	58,3%	40,6%	32,3%
CCRM-CO *	64,7%	61,5%	40,4%	32,2%
RMA-NJ *	63,2%	59,7%	34,6%	18,7%
Média nacional	48,6%	38,3%	24,3%	12,3%
SCCRM-sul da Califórnia Centro de Medicina Reprodutiva; Centro CCRM-Colorado por de Medicina Reprodutiva; e RMA-Reproductive Medicine Associates
* Estas clínicas principais foram todos predominantemente implementado ciclos de transferência de embriões vitrificados, em associação com o teste genético pré-implantação, em sua prática padrão de atendimento para otimizar o sucesso de nascidos vivos por embrião transplantado.

Tabela 2. 2014 taxas de nascidos vivos cumulativos, como relatado pela Sociedade de Tecnologias de Reprodução Assistida (SART), para a Clínica SCCRM usando o nosso Ovation Fertilidade Lab em Newport Beach, CA, em contraste com vários outros programas respeitados, bem como com o SART médias nacionais.

Discussion

Hoje em dia, existe uma elevada expectativa de alcançar a sobrevivência blastocisto completa (> 95%) e alcançar o sucesso semelhante ao implante de embriões frescos. Alguns grupos têm sugerido que as taxas de nascidos vivos de ciclos de transferência de embriões vitrificadas são talvez ainda mais elevados do que os blastocistos fresco quando o embrião criopreservado intacta é transplantado para um útero saudável, não-estimulada hormonalmente. Os nossos dados indicam claramente que a vitrificação eficaz e fiável mantém a viabilidade do embrião fresco. Além disso, provámos que a nossa asséptica, método fechado, chamado MicroSecure de vitrificação (uS-VTF), pode conseguir uma optimização dos resultados comparáveis ou superiores aos padrões comerciais (isto é, sistemas de dispositivo abertos) utilizados na indústria de FIV.

Variação está associada com repetibilidade técnica e confiabilidade entre os indivíduos usando uma infinidade de vitrificação dispositivos / métodos. Por sua vez, isso resultou em inconsistencies entre os programas de aplicação de vitrificação. Portanto, não é surpreendente que dispositivo de familiaridade é um fator importante a respeito de proficiência laboratorial e resultados bem sucedidos. É este conceito de "assinatura técnica" ¹¹ que explica por que a repetibilidade entre programas pode ser problemático. Não só o desenvolvimento de mais do que uma dúzia de dispositivos comerciais complicado este fenómeno, que criou preocupações de controle de qualidade. Felizmente, fechou sistemas de vitrificação, como uS-VTF, Rapid-I, e VitriSafe, estão agora a revelar-se igualmente eficaz para abrir sistemas de dispositivo de ^{12, 13, 14.}

MicroSecure VTF é um romance, técnica de vitrificação asséptica desenvolvida com facilidade técnica, confiabilidade e crio-segurança em mente. Ao combinar a utilização de dois dispositivos previamente aprovados pela FDA,-compatíveis, que é um sistema de vitrificação não comercial Wom a vantagem de ter um baixo custo estabelecido, em contraste com dispositivos especializados. Além disso, sua inviolável única e sistema de rotulagem de duas cores internalizado, bem como inúmeras outras vantagens de controle de qualidade, fizeram uS-VTF uma opção global atraente ^11. Como um dispositivo de VTF não-comercial, no entanto, a sua aplicação generalizada indústria está evoluindo lentamente. Só através da publicação contínua da sua segurança, segurança e eficácia clínica vai ganhar uS-VTF utilização crescente.

Em agosto de 2014, quando confrontados com a incapacidade de adquirir o original palha embrião de 0,3 mL fabricado com um non-wicking plugue interior, hidrofóbico, fomos capazes de modificar de forma confiável o método uS-VTF. Em suma, os novos sêmen de 0,3 mL / palhas embrião com seus tampões de algodão-PVP foram efetivamente adaptada. Isto foi simplesmente alcançado através da criação de um selo interno antes do tampão de algodão, evitando assim o contacto e fluido de drenagem com oponta VTF aberto (ou seja, o flexipette contendo o embrião ou ovos). Além disso, se 40-mm hastes de identificação não são acessíveis, o problema associado com a flutuabilidade das hastes mais leves de 30 mm pode ser counterweighted usando dois rolamentos de esferas.

Estes passos adicionais fizeram a técnica um pouco menos simples, mas ainda altamente eficaz. Hoje, economia e eficácia estão se tornando cada vez mais preocupações importantes, como blastocistos biopsiados são tipicamente vitrificados individualmente até o seu estado euploidy é confirmado em um relatório genética. Blastocistos com um estatuto de aneuploidia não viáveis ​​confirmou normalmente descartadas, com o consentimento do paciente, dentro de algumas semanas. Assim, a maioria (> 50%) dos dispositivos de VTF são descartados após um armazenamento de curto termo, causando um custo anual crescente na utilização de dispositivos comerciais. No geral, uS-VTF é um procedimento altamente eficaz, confiável e repetível para a criopreservação de blastocistos humanos. O securel projeto de controle de qualidade superioretiquetas y e segura armazena embriões / ovócitos ao eliminar a falha de recuperação e otimizar a sobrevivência pós-aquecimento e viabilidade, o que justifica o uso do sistema como uma abordagem universal para a vitrificação de embriões.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cana de alumínio	IVM	XC055
Rolamentos de esferas, 3/32"	VXB.com	KIT15977	aço inoxidável
CBS sêmen/embrião palha, 0,3 mL	CryoBioSystems	25292	estéril individual
, hastes de identificação, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	tubos de cultura ponderados
, 15 mL	Falcon	352099	Cônico
Tubos de cultura, 10 mL	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter, 250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0,22 μ m
Frascos, Cultura de Tecidos 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes, 300 μ m ID	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Estéril, 20/pacote
de Pinça, Grande	Pinça Miltex	6-30TC
, Lasca - fina	Cálice Miltex	17-305
	IVM	PA003
Seladora Térmica, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V ou 220 V com adaptador
Mídia tamponada com hepes	Vida Global ou	LGGH-100; 100  mL, ou	armazenado em 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 mL	com etiquetas AA's não essenciais
, Cryo	GA International	CL-23T1	Várias cores
Tanque de Nitrogênio Líquido, 40  L	MVE ou Taylor Warton	vários	armazenamentos de líquidos
LN2; Garrafa de dewar, 0.5  L	Hampton Research	HR4-695
Pratos Custer de 6 poços	Biogenics	015/020	plasticware por estojo
Bulbo de pipeta, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Orifício no ápice do bulbo
Placas de Petri, Placas	Falcon	351006
Nunc	150288		de 58 mm
, 100 mm	Pontas	Falcon 351029
, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μ L
Pipet Aid	Drummond ou Falcon	vários	recarregáveis
, Pipetas	Cirúrgicas Stripper Cooper	MXL3-STR
, Sorológico 1  Pipetas de	357521		Falcon
, Sorológicas 2  mL	Falcon	357507
Pipetas, Sorológico 5  mL	Falcon	357543
Pipetas, Sorológico 10  mL	Falcon	357551
Tesoura, Microscópio Estereomicroscópio Cirúrgico Mayo	Miltex	5-SC-16
	Nikon, Olympus, Leica	várias
almofadas de gaze estéreis, 4" x 4"	Kendall Healthcare	6939
Soro sintético	Life Global, ou	LGPS-20; 20 mL, ou	armazenado em 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 mL	lote de compra de baixa endotoxina
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Alíquota em 50  frascos de mL, 1 ano; 17,1 g/frasco + Meio a 50 mL; faz uma solução de 1 M; Filtro com 0,22 µ m unidade
Temporizador	Nalgene	5016-001
Solução de Descongelamento	Inovadora Cryo Enterprises	BL-TS (≤ 1,0 M Sacarose)	T1, T2, T3, T4; tored em 2 - 8 º C para ≤ 1 mês após a abertura
da solução de vitrificação*,**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (≥ 7,9 M [Glicerol/EG])V1	, V2, V3; armazenado a 2 - 8 º C para ≤ 1 mês após a abertura
* Aditivos crioprotetores não permeantes podem incluir: sacarose, ficoll e hialuronato de sódio
** Outras preparações comerciais são tipicamente etilenoglicol (EG)/dimetilsulfóxido (DMSO; 30% v/v; 4,8 M), mas podem ser EG/propilenoglicol (32% v/v; 5,2 M). Soluções mistas são normalmente usadas para reduzir as preocupações de criotoxicidade de uma solução molar alta. As soluções comerciais normalmente incluem uma solução ES e VS. A formulação da preparação comercial é tipicamente propriedade proprietária.