Artigo de método

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

DOI:

10.3791/54880

⸱

31 de dezembro de 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.

Resumo

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registos electrofisiolicos de células utilizando a técnica de fixação de membranas permitiram a identificação de diferentes tipos neuronais com base em padrões de disparo. A inclusão de biocitina / neurobiotin no eletrodo de gravação permite a recuperação post-hoc de detalhes morfológicos, que são necessários para determinar a arborização dendrítica e as regiões abrangidas pelos axônios dos neurônios registrados. No entanto, dada a presença de neurônios morfologicamente semelhantes com identidades distintas neuroquímicos e funções, coloração imuno-histoquímica de proteínas específicas de células-type-é essencial para identificar definitivamente neurônios. Para manter a conectividade de rede, secções do cérebro para gravações fisiológicas são preparadas com uma espessura de 300 nm ou mais. No entanto, esta espessura muitas vezes dificulta pós-processamento imuno devido a problemas com a penetração de anticorpos, sendo necessária a ressecção do tecido. Ressecção de fatias é uma arte difícil, muitas vezes ResulTing na perda de tecido e morfologia das células a partir do qual foi obtido dados electrofisiológico, tornando os dados inutilizável. Uma vez que a recuperação da morfologia iria limitar a perda de dados e guia na selecção de marcadores neuronais, adoptámos uma estratégia de recuperar a morfologia celular em primeiro lugar, seguido de imunocoloração secundário. Nós introduzimos uma abordagem prática para biocitina enchimento durante as gravações fisiológicas e subsequente imunocoloração de série para a recuperação da morfologia, seguido pelo restaining de secções para determinar a identidade neuroquímica. Relatamos que as secções que foram preenchidos com biocitina, fixadas com paraformaldeído (PFA), coradas, e lamínulas pode ser removida e corada novamente com um segundo anticorpo primário dias posteriores. Este restaining envolve a remoção da lamela, a lavagem das secções em uma solução tampão, e a incubação de anticorpos primários e secundários para revelar a identidade neuroquímica. O método é vantajoso para eliminar DATuma perda devido a uma incapacidade de recuperar morfologia e para estreitar os marcadores neuroquímicos a ser testados com base na morfologia.

Introdução

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O cérebro é conhecido pela diversidade das características estruturais e funcionais dos seus elementos neuronais individuais. Compreender os papéis de tipos neuronais distintas na função cerebral e patologia exige caracterização e identificação inequívoca dos neurônios. Estruturalmente, as características morfológicas definidos pela localização somato-dendrítica determinar as potenciais entradas que um determinado neurônio recebe, enquanto o padrão de arborização axonal identifica alvos potenciais pós-sinápticos. A diversidade estrutural dos neurônios tem sido apreciado desde os dias de estudos histológicos seminais do Ramón y Cajal 1. O advento das técnicas de gravação de uma única célula revelou que os neurônios estruturalmente distintos também mostram diferenças nos padrões de disparo e características sinápticas. A diversidade na estrutura e fisiologia é particularmente evidente em GABAérgicos neurónios inibitórios 2,3. Além disso, tornou-se cada vez mais evidente que structurallneurônios semelhantes y podem expressar diferentes marcadores neuroquímicos e mostrar correspondentes diferenças funcionais 4. Da mesma forma, os neurónios com os mesmos marcadores neuroquímicos podem ter estruturas e funções distintas 5-10. Assim, na prática, a análise das características funcionais de neurónios e o seu papel na rede requer a definição ambas as identidades morfológicas e neuroquímicas. Mesmo com o advento de linhas de ratinhos repórter segmentação marcadores neuroquímicos específicos, muitas vezes é necessário para determinar a morfologia e a identidade subtipo baseado em 11 imunohistologia.

O método padrão utilizado para caracterizar células registrados em fatias cerebrais agudas é para os encher biocitina ou neurobiotin durante a gravação, corrigir as seções de paraformaldeído (PFA), seguindo as gravações, e usar a imunohistoquímica para revelar a morfologia e neuroquímica. Uma vez que a espessura das secções para a fisiologia fatia são tipicamente 300 mmou mais, e porque a maioria dos anticorpos não conseguem penetrar todo o caminho através do que a profundidade, as fatias devem ser re-seccionados a 60 um ou menos, para permitir a imunocoloração simultânea para biocitina e marcadores neuroquímicos 12-14. Infelizmente, é trabalhoso ressecção; corre o risco de perda de tecido durante o corte; e pode conduzir a diferenças de encolhimento do tecido, o que complica reconstruções morfológicas. Além disso, o conhecimento prévio da morfologia poderia ajudar a diminuir os marcadores candidatos que são susceptíveis de ser expressa pelas células. Temos modificado os protocolos imunohistologia biocitina padrão para permitir o processamento em série de secções em primeiro lugar para a recuperação de morfologia e, em seguida, para a identificação de potenciais marcadores neuroquímicos.

A imuno-histoquímica é o estudo de distribuição de antigénio em células ou tecidos e pode ser visualizada utilizando uma enzima, marcadores fluorescentes, elementos radioactivos, ou partículas coloidais de ouro 15. O procedimento involves usando anticorpos primários para marcar especificamente e amplificar um ou mais antigénios específicos, seguido pela utilização de anticorpos secundários fluorescentes segmentação do anticorpo primário para visualização. Devido à necessidade de diferenciar os espectros de fluorescência de cada anticorpo secundário sem sobreposição, apenas um número limitado de antigénios podem ser examinados simultaneamente. Assim, o conhecimento prévio da morfologia poderiam ser úteis para seleccionar os marcadores neuroquímicos candidatos para a classificação de células. Conceptualmente, a razão de processamento em série de secções coradas já baseia-se na premissa de que imunomarcação para uma proteína ou péptido não deve interferir com a antigenicidade e imunomarcação subsequente para um péptido estruturalmente independente 16. Esta falta de interferência é devido à ligação dos anticorpos para um epítopo da proteína específica num antigénio e, portanto, permite a coloração simultânea de múltiplos antigénios no mesmo tecido. O número de antigénios revealed por imunocoloração é limitada pela necessidade de espectros de não sobreposição dos anticorpos secundários fluorescentes e pela necessidade de direccionar antigénios individuais com anticorpos criados em diferentes espécies de modo a eliminar a reactividade cruzada 17,18. Enquanto este é o raciocínio por trás de rotulagem de série em vez de em simultâneo com dois anticorpos diferentes que podem interagir, a nosso conhecimento, imunocoloração para um segundo antigénio não foi relatado após a conclusão da imunomarcação para um ou mais antígenos em seções montadas. Aqui, descrevemos um método para imuno série de secções previamente coradas e montadas. Embora pormenor este processo para um processo de imunomarcação de série para a recuperação da morfologia seguido por coloração para marcadores de proteína / péptido em secções espessas, os mesmos procedimentos podem ser usados ​​no padrão, secções histológicas finas bem. Além disso, descreve-se uma abordagem prática para encher neurónios gravados com biocitina e o processo para desalojar oeléctrodo da célula após a conclusão de gravações para optimizar o enchimento do axonal e mandris dendríticas de neurónios, tal como apresentado na nossa recente 6,8 trabalho.

A vantagem mais importante do processo aqui descrito é que a morfologia da célula gravado pode ser totalmente recuperado e fotografada antes de tentar a ressecção ou imunocoloração das fatias. Embora os problemas com a penetração de determinados anticorpos podem tornar necessária a fatias de ressecção para imunocoloração secundário, os procedimentos detalhados aqui iria eliminar a necessidade de reconstruir neurónios complexos de múltiplas secções e evitar problemas devido à perda de tecido e o encolhimento diferencial, o que pode comprometer a reconstrução seguinte ressecção. Uma vantagem adicional é que o processo irá reduzir custos, tempo, esforço e anticorpos caros, limitando imunocoloração e re-corte às fatias em que os neurônios-cheia biocitina são recuperados. O aspecto mais prático é o anúncioimunocoloração nal que pode ser realizada em secções coradas meses antes de usar a técnica acima mencionada. Em particular, a recuperação da morfologia reduziria consideravelmente o potencial que os dados fisiológicos das células é rejeitado devido a uma incapacidade para obter uma caracterização morfológica básica do tipo de célula.

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Protocolo

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1. biocitina enchimento durante Eletrofisiologia

NOTA: Os leitores podem se referir a fontes alternativas de técnicas básicas de patch-clamp gravação e instrumentação 19-22, que não são elaborados em cima aqui. As etapas detalhadas aqui supor que o equipamento e os procedimentos para as gravações de patch-clamp já estão estabelecidos, e a descrição será restrito aos detalhes relacionados com biocitina-enchimento e imunocoloração post-hoc. Todas as experiências descritas neste manuscrito foram realizadas em ratazanas.

  1. Usando um vibratome, preparar secções de cérebro vivo da região desejada, com uma espessura de 300-350 uM 23.
  2. Prepara-se uma solução contendo 0,2% interna biocitina por adição de 2 mg de biocitina a 1 ml de solução interna 6. Para melhores resultados, sonicar a solução interno de 10 - 15 minutos até que a biocitina dissolve-se completamente. Em seguida, carregar a solução interna numa seringa de 1 ml, equipado com um 0,2 &# 160; de poro ponta de filtro de tamanho de polipropileno ligado a um microloader. Manter esta seringa de carga em uma mala de frio para manter a estabilidade do Mg-ATP e GTP-Na na solução interna.
    NOTA: Uma gluconato de potássio solução interna contendo (mM de K-gluconato 126, KCl 4 mM, HEPES 10 mM, 4 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GTP, e fosfocreatina 10 mM) é óptima para a recuperação de certos marcadores neuroquímicos, incluindo parvalbumina, durante imunomarcação. Na nossa experiência, utilizando cesium- e soluções internas à base de cloreto reduz a capacidade de recuperar a imunocoloração para determinados marcadores neuroquímicos. Neurobiotin ou um, fixável, traçador polar célula-impermeabilizante combinando um fluoróforo com Alexa biocitina pode ser usado como uma alternativa para biocitina.
  3. De acordo com contraste de interferência diferencial de infravermelhos, visualizar a célula apropriado para gravação. Para minimizar qualquer interrupção do axônio, a abordagem do corpo celular, diminuindo a pipeta ao longo de seu eixo, utilizando o "approach" função disponível na maioria dos micromanipuladores. Estabelecer gravações de célula inteira sob contraste de interferência diferencial de infravermelho usando protocolos fisiologia de patch-clamp 19-22.
    NOTA: Evitar a aproximar-se da célula a partir da direcção do axónio putativo, uma vez que irá cortar o axónio, visualizado como uma vesícula na extremidade de corte (seta verde na Figura 1). Além disso, evitar a aplicação de alta pressão positiva para a pipeta de gravação, enquanto que se aproxima da célula para minimizar o derrame de biocitina, o que resultará na coloração de fundo elevado.

figure-protocol-1
Figura 1. Sugestão de avião para se aproximar de células para biocitina preenchimentos. A imagem ilustra um celular Granule (GC) encher com biocitina durante a gravação que foi processada para revelar biocitina (em vermelho usando estreptavidina 594 conjugado). O GC tem suas dendrites orientadas no plano XY. Observe a célula granular cortadaaxônio (seta verde) devido ao movimento da pipeta ao longo do plano XY. Note que é ideal para abordar este neurônio ao longo do plano XZ. Barra de escala: 50 ^ m.

  1. Na configuração de fixação de voltagem, determinar a capacitância de células inteiras e resistência em série, em resposta a pequenas (5 mV), breves (30 ms) tensão etapas usando o teste usando a função da membrana no modo de banho em uma aquisição de dados e software de análise de electrofisiologia. Isto irá assegurar o estabelecimento de condições de gravação de célula inteira para permitir biocitina-enchimento.
  2. Realizar gravações fisiológicas no modo quer observação de correntes ou de tensão-clamp, conforme necessário. Um mínimo de tempo de gravação de> 10 min a 34 ° C é ideal.
    NOTA: Longer tempos de gravação podem ser necessários para os exames realizados à temperatura ambiente.
  3. Após a conclusão das gravações fisiológicas, re-estabelecer a configuração de patch-clamp, movendo-se lentamente a pipeta de gravação em pequenas etapas, alternadas para cima (ao longo do eixo Z) epara fora (ao longo do eixo X) no modo de voltagem-grampo.
  4. Simultaneamente monitorar a capacitância e entrada de resistência utilizando a função "membrana teste" para visualizar a perda de transientes capacitivo eo colapso das respostas atuais para uma linha reta, indicando a re-vedação da célula e o estabelecimento de um fora-out- remendar na ponta da pipeta. Segurando o celular em um potencial despolarizado (-40 mV) facilitará o processo de vedação re-.
    NOTA: Este procedimento para a remoção de uma célula normalmente garante a recuperação completa do soma e dendritos. Não aplicar pressão positiva para a pipeta de gravação durante este processo ou durante a separar a célula a partir da pipeta. Visualização da soma da célula registrado na fatia indica desligamento bem sucedido. A presença de fragmentos celulares ou um remendo de membrana na extremidade da ponta individual geralmente indica o deslocamento do soma e não irá produzir a morfologia celular completa.
  5. à réer separar da pipeta a partir da célula, reter a fatia na câmara de gravação para 3-5 min para garantir o transporte do corante para dendrítica distal e processos axonais.
  6. Transferir as fatias para uma placa de 24 poços contendo PFA a 4% para a fixação.
    CUIDADO: PFA é cancerígeno, e equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas e uma máscara facial, deve ser usado para evitar a irritação da pele e inalação. PFA é inflamável e devem ser mantidos fora do alcance de fogo. PFA nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico. PFA fixação deve ser isolado a partir de superfícies utilizadas para a preparação fatia vivo para evitar a contaminação da instalação fisiologia, incluindo pipetas de transferência.
  7. 24 - 48 h após a fixação PFA, transferir as fatias de 0,1 M de fosfato salino tamponado (PBS) para armazenamento antes da imunocoloração.
    NOTA: Idealmente, biocitina recuperação e imunocoloração são melhores quando realizada logo após a fixação, embora por coloração formado dentro de 7 d de rendimentos de fixação bons resultados. As fatias podem ser mantidas em PBS com 0,02-0,05% de azida de sódio para a coloração e realizada até mais de 90 dias após a fixação. Embora a fixação durante a noite em PFA funciona bem para a maior parte dos anticorpos, é possível que alguns anticorpos funcionam melhor quando a duração da incubação no fixador é diminuído. Fixação em PFA durante mais 48 h reduz a disponibilidade de antigénios e diminui a probabilidade de sucesso para a imunocoloração secundário marcadores neuroquímicos.
    CUIDADO: A azida de sódio é extremamente perigoso e irritante em contacto com a pele ou com os olhos ou a ingestão ou inalação. Grave excesso de exposição pode resultar em morte. A carcinogenicidade e mutagenicidade do composto não são conhecidos. Use equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas, óculos contra respingos, um jaleco e um respirador de poeira. A azida de sódio nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico.
e_title "> 2. A coloração do primeiro anticorpo primário e biocitina

(Dia 1)
NOTA: O seguinte procedimento é imunocoloração para secções de flutuação livre e requer agitação continua a uma velocidade baixa (2 revoluções / min, rpm) num agitador durante todas as etapas de incubação.

  1. Lavar o tecido 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
    NOTA: PBS 0,1 M podem ser comercialmente adquiridas ou feitas em laboratório, como se segue (faz 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 em 1 L de dH 2 0.
    NOTA: Se o marcador neuroquímica desejado é conhecido, a coloração por uma proteína / péptido pode ser realizada simultaneamente com coloração de biocitina (passos 2,2-2,4). Se coloração para biocitina somente, vá para o passo 2.5.
  2. OPCIONAL: Bloco com 10% de soro de bloqueio (BS; soro normal de cabra (NGS) diluído em 0,3% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à TA).
    NOTA: Cada poço devereceber o mesmo volume da solução; o volume recomendado é de entre 250-500 mL / poço. A selecção do soro de bloqueio baseia-se nas espécies em que os anticorpos secundários são levantadas (por exemplo, NGS é usado para anti-cabra conjugado com corante (respectivas espécies de anticorpo primário)). Se surgir a necessidade de utilizar anticorpos secundários criados em diferentes espécies de imunocoloração secções, incluem 10% de cada soro normal no bloqueio de fase (2) e 3% de cada soro normal para os passos de incubação do anticorpo primário e secundário.
  3. (OPCIONAL) Incubar as secções em anticorpo primário, CB 1 R (policlonal, cobaia) com 0,3% de Triton X-100, e 3% de BS em PBS a 0,1 M, à TA S / N. CB R 1 é utilizado para identificar o tipo de receptor canabinóide uma expressão.
    NOTA: Este passo é opcional e não é necessário para revelar o recheio biocitina. A Figura 2 ilustra uma secção marcada por biocitina e CB 1 R durante o primeiro processo de coloração. O / N incubation à TA é suficiente para a maioria dos anticorpos primários; no entanto, certos anticorpos primários, incluindo CB 1 R, requerem 3-5 d de incubação. Se a incubação precisa ser mais longo do que 1 d, recomenda-se a incubar a 4 ° C por causa de Triton X-100 pode permeabilizar fatias e pode conduzir à desintegração do tecido durante a incubação prolongada à temperatura ambiente. Incluir um controlo negativo a que falta o anticorpo primário em, pelo menos, uma secção para cada série de experiências como controlo para a especificidade do anticorpo secundário. Para controlos negativos, o anticorpo primário é omitido, mas a 0,3% de Triton X-100 em PBS a 0,1 M e são adicionados BS.

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Figura 2. sucedida CCK Coloração 1 semana após a recuperação de biocitina Coloração e C annabinoid Receptor tipo 1 (CB1 R) - rotulagem. (A - C) As imagens confocais a 60X mostrando o neurónio encheu-biocitina (A) e CB 1 R imunorreactividade (B), indicado pela seta. A mesma secção foi processada para a imunocoloração CCK após 1 semana (C). A sobreposição de imagens é mostrado na D. CCK imunorreatividade foi revelado usando far-vermelho e foi pseudo-colorido em ciano. (E) a reconstrução morfológica da célula-cheia biocitina em A. Observe que a biocitina e CB 1 R coloração são evidentes mesmo após a segunda imunocoloração CCK. Observe também a distribuição esperada de CB 1 R e padrões de positividade CCK. (F - H) imagem ampliada do axônio da célula, como em A, show de perto co-localização de biocitina e CB 1 R nos axônios (cabeças de seta). Barra de escala: 50 um (A - D), 100 um (E), e 10 uM ( et al. 2015 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

(Dia 2)

  1. Lava-se a secções do cérebro 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
  2. Incubam-se as secções em estreptavidina conjugado de corante vermelho (concentração: 1: 1000; excitação: 594 nm com emissão no espectro vermelho visível) com 0,3% de Triton X-100 e 3% de BS em PBS a 0,1 M a 4 ° CO / N na escuro (embrulhados em papel alumínio) para revelar o biocitina. Opcional: inclua um anticorpo secundário, cabra porco anti-guiné (concentração: 1: 500; excitação: 488 nm e emissão em verde), com a incubação acima, se após a primeira incubação opcional na etapa 2.3.
    NOTA: anticorpo secundário será apenas necessário se a coloração de anticorpo primário opcional (passo 2.3) é executada. Para visualizar biocitina, um streconjugado ptavidin-fluoróforo com um espectro de emissão em vermelho é recomendado, uma vez que ajuda a visualizar os axônios mais finas em detalhe e com melhor contraste (Figuras 1 - 3). Durante a imunocoloração dupla ou tripla, a fim de evitar a reactividade cruzada de anticorpos secundários uns com os outros, anticorpos secundários adicionar uma após a outra em série (2 h de intervalo entre adições de série dos anticorpos é suficiente). A Figura 3A ilustra uma célula cheia de biocitina processadas sem o anticorpo primário coloração opcional e fotografada antes da ressecção.

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Figura 3. sucesso Segundo imunocoloração após a recuperação de biocitina Morfologia e ressecção. (A1) confocal imagem de uma fatia de 300 mm que mostra a recuperação da morfologia dendrítica de uma célula cheia de biocitina. ( A2) traços de tensão membrana do neurônio em resposta a +500 e -100 pA injeções atuais. (B) A recuperação da soma cheio de biocitina em uma seção 50 mm obtido após ressecção da secção 300 mm (na A1) após a montagem e imagem. (B2) imunocoloração subsequente da seção fina revelou co-localização da soma cheio de biocitina (painel à direita) com CCK (painel do meio). A imagem mesclada é ilustrado no painel da direita. Barra de escala: 50 ^ m. Painel A2 é reproduzido com permissão de Yu et al. , No prelo 25. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

(Dia 3)

  1. secções cerebrais Lavar 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
  2. Para proteger a fluorescência e para facilitar a re-coloração no futuro, montar o segções em um meio de montagem de base aquosa e selar as bordas da lamela com unhas polonês claro.
    NOTA: É melhor restain seções o mais cedo possível para evitar dificuldades na remoção da unha polonês a partir do slide, infestação de fungos, e desidratação do tecido devido à fuga do meio de montagem da lâmina de vidro. A contaminação microbiana pode ser prevenida utilizando 0,02% de azida de sódio em PBS.
    CUIDADO: A azida de sódio é altamente tóxico e inflamável quando está em contacto com a água. Por favor, consulte os procedimentos operacionais padrão para o manuseio e descarte de produtos químicos perigosos.
    (Dias 4 - 7)
  3. Realizar imagem confocal com excitação a 594 e 488 nm e com uma ampliação de 20X ou 40X para revelar neurônios cheio de biocitina em marcadores vermelhos e neuroquímicas (CB 1 R) em verde. Avaliar colabeling (Figura 2).
  4. Definir a exposição da câmera para menos de 100 ms para evitar a fotodegradação e obtaem pilhas de imagens confocal dos mandris axonais e dendríticas de todo o neurônio. Use pilhas de imagens confocal e pacotes de software de rastreamento de neurônios para reconstruir a morfologia neuronal.

3. Coloração de o segundo anticorpo primário

Nota: Embora o segundo passo pode ser realizado imunocoloração 90 d após a primeira coloração, coloração óptima é conseguida, se a segunda coloração de anticorpo primário é realizada dentro de 7-10 d.

(Depois de 7-90 d)

  1. Aplicar acetona para um cotonete e tira a unha polonês fora da lâmina de vidro.
  2. Retirar as lamelas com cuidado usando uma pinça de ponta fina e coloque algumas gotas de 0,1 M PBS nas seções.
  3. Remova cuidadosamente as seções do slide usando um pincel fino e lavá-los em 0,1 M PBS durante 24 - 48 h num agitador coberto de folha de alumínio com pouca luz a 4 o C.
    NOTA: É crucial para cobrir seções com umfolha luminum para evitar a fotodegradação.
  4. Para assegurar a remoção completa do meio de montagem, lavar as secções 1 - 2x no dia seguinte em PBS a 0,1 M durante 10 min cada.
  5. Prosseguir com incubação no segundo anticorpo primário (por exemplo, a colecistocinina, um neuropeptídeo encontrado em certos interneurónios sensíveis a GABA (CCK; concentração: 1: 1000; anticorpo monoclonal de ratinho)) para um d (Figura 2).
    NOTA: Este procedimento é semelhante para a etapa 2.3, mas utiliza um anticorpo diferente. Além disso, o passo de bloqueio for omitido durante a re-coloração.
  6. Lavam-se as secções de cérebro três vezes durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
  7. Mancha com o secundário anticorpo de cabra anti-ratinho fluoróforo-conjugado (concentração: 1: 500; de excitação comprimento de onda: 647 nm), certificando-se que os espectros de excitação das emissões do anticorpo secundário não se sobrepõem com estreptavidina (concentração: 1: 1000; comprimento de onda de excitação: 594 nm) e imunofluorescência préviamanchas.
  8. Montar as seções no meio de montagem aquoso e selar as bordas da lamínula com unhas polonês claro.
    Nota: Armazenar as secções a 4 ° C numa caixa de armazenamento de opaco para proteger a fluorescência.

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Resultados

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Após a conclusão, as secções mantêm o preenchimento biocitina e a imunomarcação realizado no Passo 2 e pode ser fotografada usando confocal ou microscopia de epifluorescência. Além disso, as secções processadas também vai mostrar a imunocoloração para o antigénio marcado durante o processamento subsequente na etapa 3. Na secção ilustrada na Figura 2, a morfologia de um neurónio encheu-biocitina numa secção grossa (300 um) foi revelada utilizando estreptavidina visualizad...

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Discussão

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Passos críticos dentro do Protocolo

Encher a célula remendado com biocitina é o passo mais crucial para garantir a recuperação completa da morfologia. Para a completa recuperação da célula, é essencial para seleccionar uma orientação fatia ideal para minimizar o rompimento de processos durante o corte. Esta orientação pode variar de acordo com o tipo de circuito e celular em exame. Em seguida, é essencial para que haja tempo suficiente para o biocitina para difundir os dendr...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer o apoio do NIH / NINDS R01 NS069861 e NJCBIR CBIR14IRG024 para VS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NaClSigmaS7653Imunocoloração
KClFluka60129Imunocoloração
Na2HPO4 SigmaS7907Imunocoloração
KH2PO4 Sigma229806Imunocoloração
Triton X-100SigmaT8787Imunocoloração
para porquinho da Índia anti CB1 SigmaAf530-1Immunostaining
Mouse anti CCKCURE, UCLAcortesia de G. OhningImmunostaining
Rabbit anti ParvalbuminSwantPV27Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor conjugadoSondas molecularesS11227Immunostaining
Soro de cabra normal (NGS)SigmaG9023Immunostaining
Vectashield Vector LabsH-1000Imunocoloração
AnticorposSecundários Invitogen Sondasmoleculares Alexa Corantes conjugados com flúorImunocoloração
Labnet orbit agitador de baixa velocidadeBioexpressS-2030-LSPinça de imunocoloração
Dumont11231-30Imunocoloração
Pastas de lâminasEMS71520Imunocoloração
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066Electrophysiology
Multiclamp 700B amplificadorDispositivos molecularesMulticlamp 700BElectrophysiology
pCLAMP 10 SoftwareMolecular devicespCLAMP 10 Eletrofisiologia
DigitizerMolecular DevicesDigidata 1440 digitizerElectrophysiology
Filter tipsNalgene171-0020Electrophysiology
SonicatorFisher Scientific15-335-100de Eletrofisiologia
Eppendorf930001007
Electrophysiology BiocytinSigmaB4261Eletrofisiologia
Microloaders

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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