A estimulação do nervo vago provou ter uma forte eficácia na diminuição da inflamação periférica. Aqui, apresentamos um protocolo de estimulação do nervo vago modificado que permite exames adicionais dos mecanismos anti-inflamatórios colinérgicos em respostas inflamatórias limitadas.
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Artigo de método
Aumento do tempo de recuperação e diminuição da Administração LPS para estudar o nervo vago Estimulação Mecanismos em respostas inflamatórias Limitada
Neste artigo
Resumo
Resumo
A inflamação é uma resposta local à infecção e dano tecidual mediada por macrófagos, monócitos e outras células imunes ativadas que liberam citocinas e outros mediadores da inflamação. Por muito tempo, os mecanismos humorais e celulares foram estudados por seu papel na regulação da resposta imune, mas avanços recentes no campo da imunologia e da neurociência também desvendaram mecanismos neurais específicos com potencial terapêutico interessante. A chamada via anti-inflamatória colinérgica (PAC) foi descrita para controlar as respostas imunes inatas e a inflamação de maneira muito potente. No início dos anos 2000, Tracey e colaboradores desenvolveram uma técnica que estimula o nervo vago e imita o efeito da via. A metodologia baseia-se na estimulação elétrica do nervo vago em baixa voltagem e frequência, a fim de evitar quaisquer efeitos colaterais da superestimulação, como a desregulação da variabilidade da frequência cardíaca. Dispositivos elétricos para estimulação já estão disponíveis, facilitando a configuração da metodologia no laboratório. O objetivo desta pesquisa foi investigar o potencial envolvimento das prostaglandinas na PAC. Infelizmente, com base em tentativas anteriores, não conseguimos usar o protocolo original, pois a resposta inflamatória induzida era muito alta ou não era adequada para propriedades do metabolismo enzimático. As diferentes configurações do protocolo de cirurgia original permaneceram praticamente inalteradas, mas as condições relativas à indução inflamatória e ao momento antes do sacrifício foram melhoradas para atender aos nossos propósitos (ou seja, investigar o envolvimento do PAC em respostas inflamatórias mais limitadas).
A versão modificada do protocolo original, apresentada aqui, inclui um intervalo de tempo mais longo entre a estimulação e a análise do nervo vago, o que está associado a uma menor indução de respostas inflamatórias. Além disso, ao diminuir o nível de lipopolissacarídeos (LPS) para injetar, também encontramos novas observações sobre propriedades mecanicistas no baço.
Introdução
A imunidade inata fornece uma primeira linha imediato de defesa contra infecções e doenças em uma ampla gama de organismos. Não só inicia a resposta imunitária primária para eliminar a ameaça, mas que também desempenha um papel central na activação e educar a imunidade adaptativa, que leva a cabo as respostas imunitárias secundárias em uma maneira específica para o agente patogénico. A inflamação é orquestrado por uma variedade de citocinas e quimiocinas, que por sua vez tem a capacidade para atrair outras culas imunitias para o local da infecção e para induzir os sinais cardinais da inflamação, tais como vermelhidão, inchaço, dor, perda de função e febre . A duração e a intensidade da inflamação depender de vários factores, mas resolver a inflamação e restaurar a homeostase é um passo crítico para evitar o aparecimento de doenças inflamatórias crónicas. Os avanços recentes no campo da neurociência e imunologia ter desvendado mecanismos neurais específicos com imenso potencial terapêutico para controlar inflamação tanto no sistema nervoso central e na periferia. Um destes mecanismos é a via colinérgica anti-inflamatória (PAC), também conhecido como o reflexo inflamatória, que é conduzido pelo sistema nervoso autónomo 4, 5.
está atualmente acredita-se que mediadores inflamatórios ativar nervos sensoriais e enviar sinais sobre o estado de inflamação no sistema nervoso central. Uma resposta reflexa é então activada através do nervo vago eferente. Um extenso estudo sobre os detalhes anatômicos da PAC revelou um modelo parassimpático-simpático composto por dois nervos, o nervo vago e nervo do baço, respectivamente 6. No PAC, o nervo vago eferente colinérgica activado termina no gânglio celíaco-mesentérica, resultando na activação do nervo esplénica adrenérgicos por um mecanismo ainda a ser exploradas. O nervo esplénica, assim activado, é conhecido por internovate em estreita proximidade com as células imunitárias na polpa branca, da zona marginal, e polpa vermelha do baço, o órgão principal e obrigatório da tampa 7, 8. Norepinefrina (NE) a partir das terminações nervosas esplénicas liga-se aos receptores adrenérgicos β 2 correspondentes expressas em linfócitos T esplénicos. Isto induz a libertação de colina-acetil-transferase (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que por sua vez activa os receptores nicotínicos de acetilcolina (a7 α7nACh) em macrófagos, limitando assim a produção de citoquinas e inflamação 2. Consequentemente, é agora claro que o sistema nervoso é capaz de regular a inflamação em tecidos periféricos e para restaurar a homeostase imune local.
Tal como o nome sugere da via, o sistema de ACh é de importância fundamental para o funcionamento desta via de regulação neuro-imunitário. Curiosamente, os mecanismos envolvidos na activação dePAC parecem ser diferentes na periferia e no sistema nervoso central. Embora a importância dos receptores nicotínicos (α7nAChR) no baço foi demonstrado anteriormente 9, os receptores muscarínicos (mAChR) são obrigatórios para a activação central da via 10, 11. Mais recentemente, a administração periférica de um agonista muscarico M1 de acção central significativamente suprimidos de soro e de tumor baço α factor de necrose (TNF) durante a endotoxemia letal de murino, uma acção que necessário nervo vago intacta e nervo esplénica de sinalização 12. Também demonstramos recentemente que os ratinhos que carecem de prostaglandina E 2 (PGE 2) não foram capazes de responder à estimulação do nervo vago e não regular negativamente a libertação induzida por LPS de citocinas no soro e no baço 3. Portanto, o PAC também pode ser regulada por outros que o principal Camin ACh sistemasay.
O nervo vago foi nomeado como tal por causa de seu curso errante no corpo, que inervam principais órgãos, incluindo o fígado, pulmão, baço, rins, intestino e 13. Considerando esta grande inervação e o efeito imunossupressor muito potente do nervo vago, o potencial terapêutico da PAC podem abranger uma vasta gama de condições inflamatórias. O nervo vago pode ser electricamente (ou mecanicamente) activado, com controlo sobre a tensão e a frequência, e contrariamente ao tratamento convencional, com nenhuma droga adicionada ao corpo. Estão actualmente em curso ensaios em pacientes reumáticos, por exemplo, para testar a importância clínica da VNS no tratamento da inflamação crónica 14. No total, a comunicação e regulação da inflamação neuro-imunitário estão actualmente sob investigação, a qual irá fornecer um tratamento alternativo possível para a terapia convencional. Portanto, a análise do nervo vago estimulaçãoefeito n nos diferentes órgãos inervados, mas também a caracterização do potencial de ação terapêutica em modelos animais de inflamação crônica, com certeza gostaria de dar perspectivas e esperança para novos potenciais alvos terapêuticos.
A metodologia original desenvolvido por Tracey e colegas 4 não poderia ser transposto para o nosso campo de pesquisa devido a superestimulação da resposta inflamatória (por uma dose letal de LPS) e um intervalo de tempo muito curto entre a activação PAC ea-out ler. No presente estudo, iremos apresentar as alterações feitas no protocolo original, comparar as duas metodologias diferentes sobre os níveis de citocinas, e realçar uma nova observação e oposta sobre o órgão alvo (do baço).
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Karolinska, de Estocolmo. O comitê de ética local segue as directivas da União Europeia sobre cuidados com animais.
NOTA: As principais alterações do protocolo original são o tempo de recuperação após a cirurgia (6 h versus 1 hr) e o nível de LPS injectada (2 mg / kg versus 15 mg / kg). Caso contrário, as diferentes definições relacionadas com a cirurgia em si não foram alteradas.
1. Preparar material para a estimulação
- Ligue o computador e o sistema de aquisição de dados ligado ao eléctrodo de estimulação (figura 1A).
- Entre no programa de reconhecer.
- Prepara-se uma solução de reserva de LPS numa concentração de 5 mg / ml em 1x PBS, aliquota-lo, e armazená-lo a -20 ° C. No dia do experimento, descongelar uma alíquota e preparar um adequada amostra de LPS (0,5 mg / ml), a fim de injectar cerca de 100 ul no animal, de acordo com o peso.
2. Preparar o animal para a anestesia
- Use ratinhos C57BL / 6. Mantê-los sob condições de temperatura controlada com uma luz de 12 h ciclo / escuro, alimentá-los comida normal para roedores, e dar-lhes água ad libitum.
- Realizar a cirurgia em ratos que pesam cerca de 25 g no dia da experiência.
Nota: Quando são induzidas reacções inflamatórias, que é particularmente importante para realizar exames regulares e observações das reacções clínicas nos animais. Eutanásia prematura por inalação de CO2 é necessário se a condição animal não preenche os critérios éticos. - Configurar o aparelho anestésico.
- Certifique-se de que a tubulação está devidamente conectado e não está danificado de alguma forma. Certifique-se de que a área ventilada está funcionando corretamente. Conecte o filtro chave para a garrafa isoflurano e preencher a vaporizer com uma quantidade suficiente de isoflurano.
- Abra o suprimento de gás (ar e oxigênio) e certifique-se que as garrafas contêm gás suficiente para o experimento. Uma ligação de três vias é então capaz de enviar o fluxo de isoflurano para a câmara de indução ou a máscara.
- Ligue o conector de tr vias para a câmara de indução. Escolher um rato a partir da gaiola de alojamento e inserir o animal para dentro da câmara. Ajustar o regulador de fluxo de 1,0 L / min de oxigénio e 1,0 L / min de ar. Ajustar a concentração de isoflurano a 4 - 5%.
- Quando o nível desejado de anestesia é atingido, quando o nível desejado de anestesia é atingido, raspar a área cirúrgica e mover o animal a partir da câmara para a máscara. Ligue o conector de tr vias para o fluxo de máscara. Ajustar o regulador de fluxo de 0,25 L / min de oxigénio e de 0,25 L / min de ar.
- Ajustar a concentração de isoflurano para 1,5-2,5%. Verifique o nível de anestesia por controle reflexo e freqüência respiratória antes de iniciar o procedur cirúrgicae.
- Fixar as pernas do mouse para a bancada de trabalho com fita adesiva. Certifique-se de que o nariz do animal ainda é cuidadosamente posicionada na máscara.
3. Cirurgia e estimulação do nervo vago
- Desinfectar a área cirúrgica com 70% de etanol.
- Utilizando um bisturi, com cuidado incisão na pele ao nível do gargalo (incisão de cerca de 1 a 1,5 cm).
Nota: No protocolo, o procedimento de cirurgia termina aqui para animais operados ficticiamente. De fato, tem sido demonstrado que apenas tocando o nervo com uma ferramenta de metal já estimula-lo até certo ponto. Portanto, para obter um animal de controle cirurgia mais precisa quando se utiliza uma pequena quantidade de LPS, pare a cirurgia nesta etapa. - Com a ajuda de um microscópio (objectivo 12,5X), isolar o nervo vago esquerda a partir da artéria carótida utilizando um fórceps de dissecação. Primeiro localizar o esternocleidomastoideu através da remoção da pele e de gordura camadas, e, em seguida, retrai-la emfim de colocar a pinça para trás tanto o nervo ea artéria.
Nota: O passo seguinte é muito complicado, como o nervo e artéria estão intimamente a aderir uns aos outros. Portanto, é muito fácil de cortar o navio e matar o animal. No entanto, colocando a pinça muito cuidadosamente entre o nervo e artéria, que, eventualmente, separar, e é possível isolar o nervo. - Colocar o eléctrodo (Figura 1B), sob o nervo vago. O elctrodo de agulha é bastante longo, por isso, mesmo se o nervo move-se ligeiramente durante a estimulação, que estará sempre em contacto com o eléctrodo.
- Realizar uma injecção intraperitoneal (ip) de LPS (2 mg / kg) com a ajuda de uma seringa (para a leitura e para fora sobre os níveis de citocinas, ou seja, para medir o efeito de regulação para baixo).
- Esperar 5 min antes do início da estimulação.
- Estimular o nervo vago durante 5 min a 5 V e 1 Hz, empurrando o botão de arranque no programa Reconhecer.
- Rémova o eletrodo e suturar o ferimento do animal com fio de sutura cirúrgica.
- Spray de um Sem Sting Barreira Film (NSBF) sobre a ferida, a fim de melhorar a cicatrização e para proteger contra infecções.
4. Recuperação do animal
- Após a cirurgia, mover o animal de volta para sua gaiola para despertar e de recuperação. Sob a luz infra-vermelha, a fim de manter a temperatura corporal, certifique-se de monitorar o animal até a plena consciência foi recuperada.
- Deixe o animal recuperar em sua gaiola, durante 6 h antes de serem sacrificados para análise.
Nota: O efeito da estimulação do nervo vago é muito rápida e tem também sido mostrado para ser de longa duração (até 48 horas), de modo que o tempo de recuperação pode ser definido pelo experimentador de acordo com as necessidades do estudo.
5. Sacrifício, para posterior análise
- Colocar o animal numa gaiola ligada a um dispositivo de administração de CO 2.
- Defina o dispositivo em um 5ciclo-min de inalao de CO 2.
- Quando a eutanásia é feito, recolher os órgãos de interesse e congelá-los directamente em gelo seco para posterior análise (por exemplo, a medição dos níveis de citocinas em extractos de baço usando um rato de TH1 / TH2 9-Plex ensaio) 3.
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Resultados
Nível de TNFa e Interleucina-1β (IL-1β) depois de aumentar o espaço de tempo após a cirurgia e a diminuição da dose de LPS
Como mostrado previamente, utilizando o protocolo original, VNS diminuiu os níveis de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg em SHAM contra 39,7 ± 10,8 pg / mg em VNS, p <0,001) e IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg em SHAM contra 191,7 ± 27,2 pg / mg em VNS, p <0,01) no baço após injecção intraperitoneal de LPS (15 mg / ...
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Discussão
Desde a sua descoberta no início de 2000, os mecanismos da PAC, foram exaustivamente estudados. Temos agora uma boa imagem da via, e em particular, o órgão-alvo, o baço, onde NE, as células T de memória, Ach, e macrófagos trabalho em equipa muito eficiente para regular negativamente a mediadores inflamatórios 2. Temos também recentemente publicada dados sobre a importância de um sistema funcional de prostaglandinas em ratinhos, em particular, de PGE 2, que é, obviamente, um componente ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado pelo Conselho Sueco de Pesquisa, pela Associação Sueca de Reumatismo, pelas Fundações do Instituto Karolinska, pelo Conselho do Condado de Estocolmo, pela Fundação Wallenberg e pela Fundação GV 80 Anos para pesquisa. Os autores também gostariam de agradecer a Hannah Aucott pela revisão do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Computador | Toshiba-Qualquer | computador é realmente compatível | |
| com o sistema de aquisição de dados MP-150 | Biopac Systems | MP150WSW | |
| software de reconhecimento | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl / 6 | Charles River | ||
| Máquina anestésica | Simtec Engineering | ||
| Garrafa de oxigênio médico | Garrafa de | médica | |
| AGA | 108639 | ||
| Vetflurano (1.000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Solução salina | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluído 10 vezes para concentração usada |
| Seringa (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Agulhas 23 G | KD-FINE | 0,6 x 30 mm (azul) | |
| Pinça de microdissecação (curva) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Tesoura de dissecação | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Sutura cirúrgica 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Unidade de eutanásia | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon Filme | de barreira sem picada3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex ensaio, kit ultrassensível | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Dispositivo de eletrodo estimulante | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis barbeador | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Dieta para roedores de Lantmannen, Estocolmo, Suécia |
Referências
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Reimpressões e permissões
