Artigo de método

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na

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DOI:

10.3791/54901

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29 de novembro de 2016

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

Neste artigo

Resumo

Nós apresentamos um método baseado em imagens de imunofluorescência para a localização espacial e temporal da ERK ativo no C. dissecados gonad elegans. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado para a visualização de qualquer sinalização ou uma proteína estrutural na C. elegans gonadal, proporciona-se um reagente de anticorpo adequado está disponível.

Resumo

O sinal extracelular evolutivamente conservadas transdução RTK-RAS-ERK via é um importante da cascata de sinalização da cinase que controla vários processos celulares e de desenvolvimento, principalmente através da activação de ERK, a quinase terminal da via. regulação apertada da actividade ERK é essencial para o desenvolvimento normal e homeostase; Resultados ERK excessivamente activas em termos de proliferação celular excessiva, enquanto subativa ERK provoca a morte celular. C. elegans é um sistema poderoso modelo que ajudou a caracterizar a função e regulação da via de sinalização RTK-RAS-ERK durante o desenvolvimento. Em particular, a via de RTK-RAS-ERK é essencial para C. elegans desenvolvimento da linha germinal, que é o foco deste método., utilizando anticorpos específicos para a forma activa, diphosphorylated de ERK (dpERK), o padrão de localização estereotipada pode ser visualizada no interior da linha germinal. Porque esse padrão é tanto espacialmente e temporalmente controllEd, a capacidade de ensaiar reprodutivelmente dpERK é útil para identificar reguladores da via que afectam a duração de sinal e amplitude dpERK desenvolvimento e, portanto, da linha germinal. Aqui demonstramos como dissecar com sucesso, mancha e dpERK imagem dentro do C. gonad elegans. Este método pode ser adaptado para a localização espacial de qualquer sinalização ou uma proteína estrutural na C. elegans gônadas, desde um anticorpo compatível com imunofluorescência está disponível.

Introdução

O receptor de tirosina-quinase (RTK) -RAt Sarcoma (RAS) de sinal -Extracellular regulado Quinase (ERK) via retransmite sinais extracelulares através de uma cascata de quinase conservada que resulta na fosforilação e activação de ERK 3/1. Proteínas ERK são membros do mapa conservada dirigido prolina-serina / treonina (proteína activada por Mitogénio) da família da quinase, e são directamente accionados pela MEK através de dupla fosforilação na treonina (T) e tirosina (Y) do motivo TEY conservada. ERK activo (designado por ERK diphosphorylated, ou dpERK), em seguida, regula diversos processos celulares e de desenvolvimento através da sua fosforilação de uma bateria de substratos a jusante 1-3. Assim, a actividade de ERK anormal de células conduz a muitos defeitos do desenvolvimento e 4-7.

regulamentação estrita da actividade ERK é crítico para o desenvolvimento normal: em sistemas de mamíferos muita atividade ERK leva à excessiva líder proliferação celularpara o crescimento oncogénica; muito pouca actividade conduz à morte da célula 4,6. Além disso, alterações na duração da actividade ERK pode também levar a resultados distintos: em células PC12, a activação de ERK de 30 minutos ou menos induz a proliferação das células, mas a activação de ERK durante 60 min ou mais induz a diferenciação neuronal 8,9. regulação apertada da actividade ERK é, portanto, claramente essencial para o desenvolvimento normal e homeostase.

C. elegans é um poderoso, e geneticamente maleável sistema modelo para dissecar a função e regulação da via de sinalização RTK-RAS-ERK 3,10-15. Em relação a sistemas de mamífero, o qual contêm vários genes para RAS e ERK, C. elegans contém um gene ras (let-60) e um gene de ERK (mpk - 1), tornando-o um sistema geneticamente mais fácil na qual dissecar a função desta via 3,10-14. A C. elegans linha germinativa é essencialmente um tubo que consiste em mitóticocélulas na sua extremidade distal e oócitos maduros na sua extremidade proximal (Figura 1) 16 haste. Células germinativas iniciar a meiose apenas proximal à zona mitótico distal, e do progresso através de uma prophase estendida meiose (pachytene), depois do qual eles começam a formar oócitos na região do loop, finalmente passando a maturação do oócito na região proximal 16.

Estudos genéticos de vários laboratórios, inclusive o nosso, têm mostrado que a via RTK-RAS-ERK é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa em C. elegans 12,13,15,17-19. Especificamente, verificou-se que os controles de ERK e coordena pelo menos nove processos biológicos distintos durante o desenvolvimento da linha germinativa, que vão desde interruptores de desenvolvimento, como a apoptose de células germinativas para a célula processos biológicos, como 11,18 crescimento do oócito. Bem como em sistemas de mamíferos, muita atividade ERK na C. elegans resultados germinativas na produção de vários pequenos oócitos, enquanto também liresultados da actividade ttle em um grande oócito 11. Assim regulação apertada de dpERK é essencial para o desenvolvimento normal da linha germinativa. A forma activa de ERK, como visualizado por um anticorpo específico para dpERK, exibe um, dinâmico, padrão de localização bimodal estereotipada: dpERK é elevada durante a meados de paquíteno (Zona 1, Figura 1), de baixo na região do loop e alta novamente em madura oócitos (zona 2, figura 1). Recentemente, descobriu-se que a nutrição actua através do factor de crescimento insulina-like receptor-1 (DAF-2) para activar ERK na Zona 1 12; trabalho anterior mostrou que o sinal de esperma (através do receptor tirosina-quinase Efrina) activa a ERK na zona 2 13.

Uma vez que ERK funções activas como um reóstato na linha germinal para regular o crescimento de oócitos, localização espacial e temporal, bem como a amplitude de dpERK, é fundamental para compreender o seu resultado normal de sinalização. Utilizando o método descrito aqui, as mudanças nolocalização estereotipada de dpERK pode ser facilmente controlado e as previsões derivadas sobre o impacto das perturbações ambientais ou genéticos sobre a actividade ERK e assim função. Assim, o ensaio para dpERK permite uma compreensão abrangente do seu papel durante o desenvolvimento da linha germinativa.

Protocolo

O protocolo aqui descrito é essencialmente para o sistema de modelo de invertebrado C. elegans, e segue todas as diretrizes éticas estabelecidas pela instituição.

1. Manutenção animal

  1. Manter C. elegans trabalhando culturas de sobre Nematóides Meio de Crescimento 20,21 (NGM, veja Materiais Tabela) agar semeado com E. coli OP50.
  2. Manterem um nível sem-fim, a temperaturas entre 16 ° C e 25 ° C.
    NOTA: A cultura de vermes em temperaturas mais altas resulta em taxa mais rápida de crescimento, muitas vezes, o desenvolvimento da linha germinativa aberrante e tamanhos de cria mais baixos. Além disso, a temperatura genótipos sensíveis irão exibir diferentes fenótipos a diferentes temperaturas.
  3. Transferir vermes para novas placas NGM cada 2 - 3 dias, dependendo da sua taxa de crescimento, de modo a manter um fornecimento constante de vermes bem alimentados.
    NOTA: Para qualquer experimento envolvendo níveis dpERK, vermes não deve ser obtido a partir de uma fome ou multidãoplaca ed. Apinhamento ou impactos de fome insulina sinalização em vermes 22, e sinalização de insulina regula ERK 12 actividade. Assim vermes de placas em jejum ou superlotadas resultará em padrões de coloração variáveis ​​e difíceis de reproduzir.

2. Dissecção de vermes adultos para Obtenção Gonads

  1. Escolha 100-150 WT (N2) ou genótipo desejado de vermes no estádio de desenvolvimento desejado e específico (L1, L2, L3, L4, adultos, etc.) Em 100 uL de tampão M9 num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Encher o tubo de microcentrífuga com 900 jil de tampão M9 (ver Tabela Materiais). Centrifugar os tubos a 1000 x g numa microcentrífuga durante 1 minuto à temperatura ambiente.
  3. Remova cuidadosamente 900 l do tampão M9 e descarte. Remover o tampão sob um microscópio de dissecação para assegurar que os vermes são não acidentalmente removido.
  4. Repita os passos 2.2 - 2.3 mais duas vezes com M9 fresco tampão de cada vez.Isso garante que todas as bactérias que foram transitadas com os vermes são efetivamente lavados.
  5. Após a lavagem final remover 900 mL de tampão M9 a partir do tubo e descarte.
  6. Transfira a 100 mL de M9 buffer restante contendo os 100 - 150 vermes com uma ponta de 200 mL-micropipeta para um prato de vidro de relógio de fundo plano. Certifique-se de que a ponta da micropipeta é cortado na marca de 10 uL antes da utilização. Não corte da ponta vai resultar em ruptura dos vermes.
  7. Adicione 1 - 3 mL de levamisol 0,1 M para o prato relógio de vidro contendo os vermes em tampão M9. Agite suavemente o levamisol eo M9 para permitir a mistura ainda até que os vermes parar de se mover.
    NOTA: existências levamisol podem ser armazenadas a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Aqui, utilizar a maior concentração de 1 - 3 mm mais que tem sido descrita na literatura 23 de 0,2 - 0,25 mM de levamisol, a fim de obter uma rápida perda de mobilidade nos animais. Se os animais esfolar em torno de demasiado long na suspensão líquida, os padrões resultantes de dpERK nas gónadas pode ser variável (devido ao stress ou falta de alimentação, ou ambos). padrões de coloração mais reprodutíveis foram alcançados com 1-3 levamisol mM para dissecção.
  8. Anexar duas agulhas 25 G para duas seringas de 1 mL (o tamanho da seringa, não importa, o calibre da agulha é crítica). Posição uma seringa em cada lado (figura 2).
  9. Sob um microscópio de dissecação, a posição de cada agulha por baixo e por cima de cada verme, como mostrado na Figura 2 e colocar um corte fino sobre o verme perto da segunda lâmpada da faringe num movimento do tipo tesoura. Depois de um corte no verme passar para o próximo animal até que todos os animais no prato foram cortados pelo menos uma vez.
    NOTA: Esteja consciente de que as etapas 2,8-2,9 são sensíveis ao tempo. Dissecar todos os vermes no prato em menos de cinco minutos para um padrão dpERK reprodutível. vezes dissecação mais longos irá resultar em uma desligar do sinal dpERK, especialmente em Zum 1. Ajuste o número de vermes por rodada de dissecção (ou seja, 50 vermes vs. 150) se necessário para permanecer no prazo estipulado.
    1. No caso de um gonad extrudido não é visível durante a dissecção, não tente outro corte no mesmo animal. Normalmente, isso só vai cortar o animal e não resultar na extrusão da gônada. Em vez disso, passar para o próximo animal. Worms, onde as gônadas não expulsar aparece como tal nos slides que serão feitas na secção 6 e podem ser ignorados durante o exame
      NOTA: através de todas as etapas de dissecção e processamento, é importante ter em mente que a gônada permanecerá ligado ao corpo / carcaça. Não force a gônada eo corpo distante com a agulha. Muitas vezes uma lágrima no tecido aberrante gonadal em uma tentativa de cortar a gónada do corpo podem resultar em anticorpos sinal espúrio. O corpo / carcaça pode ser ignorado durante os passos de imagem (secção 6), e apenas a gônada trabalhada. Além disso, Sometimes as células intestinais podem também servir como controlos internos / controlos somáticas para o anticorpo a ser ensaiado.

3. Gonad Fixation

  1. Após a dissecção está completa, adicionar 2 ml de 3% de paraformaldeído (PFA) directamente para o prato de vidro contendo o relógio 100 mL de M9 e os animais dissecados e cobrir com Parafilm. Coloque o prato de vidro de relógio coberto por uma Cobertura de vapores químicos.
    Cuidado: PFA é um produto químico perigoso. Assim, a fixação deve ser realizada na hotte química.
  2. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  3. Usando um descartável pipeta 9 "Pasteur de vidro adicionar 3 mL de 1x PBS-T (ver Materiais Tabela) para o prato de vidro de relógio contendo os animais dissecados. Mistura, extraindo a solução PFA e o 1x PBS-T com os animais dissecados no Pasteur pipeta e liberando o suavemente para o prato de vidro de relógio. não vortex os tubos durante as lavagens.
  4. Usando uma frepipeta Pasteur sh vidro chamar a 5 ml de líquido (contendo vermes dissecados, PFA e 1x PBS-T) do prato de vidro de relógio para a pipeta Pasteur e transferir o conteúdo em um 5 ml tubo cônico de vidro fresco.
  5. Centrifugar os tubos cónicos de 30 segundos em uma centrífuga clínica a 1000 x g. Use pipetas Pasteur de vidro e tubos cônicos como gônadas dissecados ficar com plástico.
  6. Remova e descarte o sobrenadante tendo o cuidado de modo a não perturbar os animais dissecados. Remover o líquido após cada lavagem do tubo cónico sob um microscópio de dissecação, de modo a não afectar as gónadas dissecados, e minimizar a sua perda.
  7. Com uma pipeta Pasteur fresca, adicione 5 mL de 1x PBS-T aos tubos cônicos. Centrifugar os tubos cónicos em uma centrífuga clínica durante 30 segundos a 1000 x g. Remova e descarte o sobrenadante tendo o cuidado de modo a não perturbar os animais dissecados.
  8. Repetir o passo 3.7 para um total de três vezes.
  9. Com uma pipeta Pasteur fresca, adicione 2 mL de 100%metanol para os tubos, e misture delicadamente as gônadas com o metanol através da elaboração para a pipeta Pasteur. Incubar o tubo à temperatura de -20 ° C durante um mínimo de 1 h.
    NOTA: dissecado gónadas pode ser armazenado em metanol durante 2 dias para coloração dpERK. Armazenamento durante mais de 2 dias e até 2 semanas é compatível com outras aplicações de coloração de anticorpo, tais como anticorpo anti-Lamin, mas não com o anticorpo dpERK.
  10. Após o tempo de incubação desejado, repetir o passo 3.7 para um total de três vezes, a fim de lavar as gónadas. Não vortex dos tubos durante as lavagens. Após a lavagem final sair 500 ul de 1x PBS-T no tubo cónico de 5 mL.
  11. Usando uma pipeta de Pasteur fresco transferir o conteúdo do tubo de vidro cónico para um novo tubo de vidro de 1 mL (6 mm x 50 mm). Permitir que os animais dissecados para resolver pela força da gravidade para 5 - 10 min.
  12. Usando uma pipeta de Pasteur fresco e sob um microscópio de dissecação, remover tanto da lavagem como possíveis a partir de 1 ml a tubos de vidro witHout perturbar as gônadas dissecados.

4. Bloqueio e Antibody Tratamento Primário

  1. Adicionar 100 uL de 30% de Soro normal de cabra (NGS) diluído em 1x PBS-T (ver Tabela Materiais) para os animais dissecados nos tubos de vidro de 1 ml. 30% NGS serve como o tampão de bloqueio. Cobrir o tubo com Parafilm para evitar a evaporação do líquido. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 ° C durante a noite.
  2. Após o tempo desejado de incubação, remover o tampão de bloqueio usando uma pipeta de Pasteur fresco, removendo tanto líquido quanto possível. Use um microscópio de dissecação para garantir que as gônadas não estiver redigido na pipeta Pasteur.
  3. Diluir o anticorpo MAPKYT (ver Materiais Tabela, que se refere este método como dpERK) a 1: 400 em 30% NGS. Prepare diluição do anticorpo suficiente para usar 100 mL por tubo. anticorpo não utilizado, diluído pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana.
  4. Adicionar 100 ul do anticorpo anti-dpERK diluída assimlução para os tubos de vidro de 1 ml contendo os animais dissecados. Selar os tubos com Parafilm. Incubar os tubos a 4 ° C durante a noite.
  5. Após incubação durante a noite, adicionar 800 ul de 1x PBST para os tubos à TA.
  6. Desenhar a amostra em uma pipeta de Pasteur de vidro frescos e libertar suavemente para assegurar que as gónadas estão uniformemente suspensos no 1x PBS-T. Deixe as gônadas para liquidar o fundo com a gravidade. Remover o sobrenadante. Isso garante que as gónadas dissecados são lavadas mas não danificado durante o processo.
  7. Repita os passos de 4,5-4,6 para um total de três lavagens. Não vortex dos tubos durante as lavagens. Após a terceira lavagem certifique-se de remover e descartar o máximo possível sobrenadante sem perturbar os animais dissecados. Certifique-se que uma pipeta Pasteur fresco é usado cada vez.

5. Tratamento Secundário Anticorpo

  1. Durante o anticorpo primário lavagens preparar a diluição para o anticorpo secundário. Diluir o anti-rato seanticorpo cundária a 1: 500 em 30% NGS. Tal como acontece com o anticorpo primário, utilizar 100 uL por tubo. anticorpo não utilizados podem ser armazenados a 4 ° C durante uma semana.
  2. Adicionar 100 uL solução de anticorpo secundário para os tubos de vidro de 1 ml contendo os animais dissecados. Cobrir cada tubo com parafilme, e, em seguida, enrolar os tubos em papel de alumínio para manter o conteúdo do tubo no escuro. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 2 h, ou, alternativamente, a 4 ° C durante a noite.
  3. Após o tempo desejado de incubação, adicionar 800 ul de 1x PBS-T para os tubos e repetir os passos 4,5-4,6 para um total de três vezes. Após a lavagem final, remover e descartar o máximo do sobrenadante quanto possível sob um microscópio de dissecação com uma pipeta de Pasteur fresco.
  4. Preparar a solução de DAPI durante as lavagens para o anticorpo secundário. Dilui-se 1 mL de DAPI (a partir de uma 1.000x estoque de 1 mg / ml armazenadas a -20 ° C) in- 1 mL de 1x PBST.
  5. Adicionar 800 ul da solução diluída DAPI para os tubos contendo oanimais dissecados. Cubra a boca do tubo com parafilme, e enrole cada tubo em papel alumínio. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
  6. Após a incubação com DAPI, remover o máximo da solução DAPI quanto possível, com uma pipeta de Pasteur fresco, sob um microscópio de dissecação, de modo a não perturbar os animais dissecados.
  7. Adicionar uma gota de solução para os tubos de montagem. Enrole cada tubo em papel alumínio.
    NOTA: Para visualizar a coloração dpERK, gônadas coradas devem ser montadas para microscopia imediatamente. Para outras aplicações de anticorpos, tais como serina fosforilada 10 Histona H3, gónadas pode ser mantido em meio de montagem para um máximo de 2 semanas a 4 ° C no escuro.

6. Montagem Slides e imagem

  1. Coloque uma camada de fita de laboratório longitudinalmente, na parte superior, de duas lâminas de microscópio de vidro (25 mm x 75 mm x 1 mm) como pode ser visto na Figura 3. Coloque uma lâmina de microscópio de vidro limpa fresca, entre as duas lâminas gravadas.
    NOTA: A espessurada fita ajuda a gerar uma almofada de agarose sobre a lâmina secundária. A espessura da almofada de agarose é quase igual à da fita, tal como a fita serve como um espaçador para criar a almofada de agarose.
  2. Gota ~ 200 uL de derretido agarose a 2% (feito em água destilada) na lâmina de microscópio em meio. colocar rapidamente uma lâmina limpa fresca, perpendicular e em cima, do agarose.
  3. Deixe o Solidify de agarose (1-2 min).
  4. Remover a lâmina de microscópio topo muito suavemente, de modo que o bloco de agarose não é destruída. A almofada de agarose pode permanecer ligado quer ao topo ou o slide inferior. Não importa qual deslizar o bloco de agarose permanece ligado a, contanto que é uma superfície lisa de agarose.
  5. Usando uma pipeta de Pasteur, transferir os animais dissecados para a almofada de agarose. Remover qualquer excesso de líquido a partir da lâmina utilizando uma pipeta de Pasteur sob um microscópio de dissecação.
  6. Usando um cabelo cílios ou capilar finamente desenhadas, empurre o gônadas e intestinos de umcaminho um do outro, a fim de espalhar as gônadas fora no slide.
  7. Cobrir a lamela de microscópio com um tamanho de lamela de 24 milímetros x 50 milímetros. Ter o cuidado de assegurar que a lamela é abaixado delicadamente sobre a lâmina com o mínimo de bolhas de ar que está sendo formada entre as lamelas e a corrediça.
  8. Armazenar a 4 ° C durante a noite numa caixa de corrediça (uma caixa corrediça opaca com as lâminas encontra-se plana, lamela acima) para permitir que o excesso de líquido a evaporar e das gónadas para tornar-se um pouco achatada (devido ao peso da lamela sobre as gónadas). O ligeiro achatamento das gônadas permite uma melhor imagem de um tubo gonadal de outra forma redonda.
    1. Uma vez que a lamela está montado, não se aplicar pressão sobre a parte superior da lamela com os dedos. Muitas vezes, isso resulta em distorção da gônadas e perda do sinal dpERK.
    2. Achate as gônadas durante a noite apenas para uma imagem mais eficaz. As lâminas estão prontos para ser visto, logo que eles são montados. Para tirar fotografias imediatamente, absorver suavementeo excesso de líquido entre a lamela eo slide a partir dos cantos usando um tecido laboratório limpo.
  9. Após o período durante a noite, selar o slide e lamela com unha transparente acabamento polonês sobre os quatro cantos da lamela eo limite slide. A / selo lamela unha polonês garante que a lamela não se mover enquanto imagem e protege contra a destruição das amostras.
  10. Imagem das gônadas com um microscópio composto em 63X. No entanto, a lente objectiva e o microscópio pode ser variado em função da disponibilidade de microscópios e aplicação do utilizador. Uma vez que o tamanho de todo o gónada da região proliferativa para os oócitos é maior do que pode ser capturado em uma imagem, as imagens são tomadas como uma montagem com limites de sobreposição, como mostrado na Figura 4. 11-14, 18.
    1. Em muitos casos, editar a carcaça após a imagem e montagem final, contanto que não há grandes alterações são feitas à imagem da linha germinativa. loja tele imagens brutas ao longo da imagem montada para permitir a comparação entre o 'antes' montagem / edição e 'depois' de montagem / edição das imagens.
      NOTA: As imagens de microscopia não devem ser alteradas por força do sinal ou a saturação durante a montagem da montagem.

Resultados

Em animais adultos WT hermafroditas, dpERK é normalmente visualizada na região intermédia paquíteno, zona 1, e nos oócitos maduros mais de -1 a -4 ou -5 (Zona 2). Perturbações neste teste padrão de activação reflectir alterações na via de sinalização. Linhas germinais femininas não especificar esperma, e, portanto, não exibem activação de ERK na zona 2, com apenas fraca activação na Zona 1. Estes estão representados na Figura 5.

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Figura 1: C. elegans germinal Morfologia. image Diferencial contraste de interferência (DIC) de um hermafrodita adulto com braço gônada em forma de U esboçada com a linha branca. A gônada hermafrodita adultos contém células mitóticas na ponta distal. As células mitóticas entrar em meiose e progresso através de prófase meiótica (pachytene) desenvolver em mature oócitos em gônada proximal. Zona 1 e Zona 2 marca de localização estereotipada de dpERK em uma gônada hermafrodita adulto. Escala:. 20 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Demonstração de agulha posições durante dissecações esquerda:. A fotografia de uma dissecção no processo. Direita:. Posições da agulha, com referência ao worm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Demonstração de agarose Deslize Preparação. (A) Coloque uma fita lengthwise por 2 lâminas de microscópio limpas. Coloque uma lâmina de microscópio limpa e fresca entre as duas lâminas com a fita como mostrado. Os três slides são próximas umas das outras longitudinalmente. (B) Adicionar derretido agarose para o slide no centro. (C) Coloque uma lâmina de microscópio fresco perpendicular, e ainda por cima, o slide meio, carregando a gota de agarose. ( D) Permitir que a agarose para solidificar. (E) Remova o cursor superior, deixando para trás o bloco de agarose solidificada. Use a lâmina inferior com o bloco de agarose para linhas germinais montagem dissecados e corados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Imagens de slides como uma montagem Montagem de um tipo de linha germinativa selvagem com DAPI (t.op) e dpERK canal (em baixo). As imagens tomadas em 63X com sobreposição de limites, caixas brancas para o painel A e B e caixas verdes para o painel B e as imagens C. O DAPI e dpERK para cada painel foram tomadas simultaneamente em dois canais diferentes. A imagem montada é mostrada na Figura 5A. Barra de escala:. 20 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Dinâmica Temporal / Spatial A ativação de ERK. (AC) WT (N2) adulto (24 horas passado estágio meados de L4 do desenvolvimento) linhas germinais hermafroditas coradas para DNA (B, DAPI, branco) e dpERK (C, vermelho). O sinal dpERK na Zona 1, a região de pachytene, e Zona 2, os oócitos maduros é realçado. (DF)nevoeiro-2 (oz40) linhas germinais femininas (em 8 h passado fase meio-L4 de desenvolvimento) coradas para ADN (E, DAPI) e dpERK (F). linhas germinais fêmeas novos dpERK exibir fraca na zona 1, e num oócito de um modo independente do esperma. Zona 2 é dependente do esperma, e, portanto, ausentes na linha germinativa feminina. Barra de escala:. 20 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

ERK ativa (dpERK) segue um padrão localização espacial e dinâmica estereotipada na C. da linha germinal elegans. Este padrão estereotipado dpERK espacial (Figura 5), e a amplitude de um adulto C. elegans gonadal, pode ser eficazmente correlacionados com os diversos processos biológicos que regula ERK. Por exemplo, uma incapacidade para ativar ERK na zona 2 resulta em uma prisão em oócitos na prófase da meiose, um fenótipo observado em linhas germinais femininas que não especificam esperma, e, portanto, não ativar ERK em oócitos maduros (Figura 5). Acasalamento com os resultados dos machos na acumulação eficaz de dpERK na Zona 2 nas linhas germinais femininas 11,13, juntamente com o início da maturação do oócito ea ovulação. Assim, a análise de padrões espaciais e activação temporal dpERK em certas perturbações genéticas (como interferência de RNA inativação de genes mediada) ou tratamentos químicos permite a identificação de fatores que Regulasinalização ERK tarde e processos biológicos, assim, ERK-dependentes. Essas análises também permitem a descoberta de novas interacções genéticas entre vias de sinalização.

Um ponto crítico para qualquer análise de imagem com base é a disponibilidade de reagentes funcionais, tais como anticorpos que são específicos para a aplicação. Se um tal reagente existe, em seguida, métodos tais como o descrito acima pode ser facilmente adaptado para a análise do padrão de localização para qualquer proteína de interesse. A aplicação está assim limitada pela disponibilidade de um anticorpo de funcionamento. Além disso, porque o método descreve a dissecção e coloração em um determinado momento do desenvolvimento, que só permite a captura de informações em um único período de tempo, e não lançar luz sobre a dinâmica ou a regulação de proteínas em tempo real ou taxa de rotatividade de proteína.

O método descrito acima é adaptado de Francis et ai. 23, que é distinta da Seydoux e Dunn mé todo 24 para extrusão gônadas e coloração de anticorpos. O método baseado em Francis et al., Será chamado o "método de suspensão" e o método de Dunn e Seydoux chamado de "congelar craqueamento método" para comparação. O método de suspensão tem sido muito eficaz nas nossas mãos para a obtenção de padrões de localização reprodutíveis de moléculas de sinalização, tais como dpERK, que são inerentemente mais sensível às condições de manuseamento severos. No caso de dpERK localização, na nossa experiência, o sinal na zona 1 é virtualmente indetectável com o método de congelação de craqueamento. Além disso, a secagem da amostra, o que muitas vezes pode ocorrer com o método de congelação de craqueamento, resulta em sinais espúrios de anticorpos. O método de suspensão minimiza a secagem da amostra, uma vez que as gónadas são suspensos no líquido durante todo o processo. Nós também achamos que o método de suspensão é útil para geração de imagens múltiplas genótipos diferentes em um único slide. Por exemplo, se dois genótipos, tais como hermafroditas vsfêmeas estão a ser comparados directamente para dpERK localização, os dois genótipos podem ser misturados e processados. Isto é possível porque os fenótipos são distintos e podem ser distinguidas através de morfologias DAPI. Coloração no mesmo tubo seguido por imagem no mesmo slide permite a comparação directa entre as gônadas de diferentes genótipos. Alternativamente, se as morfologias DAPI não se distinguem, em seguida, uma coloração de anticorpos de dois passos pode ser adoptado. Primeiro cada genótipo individual é tratada com dois anticorpos diferentes, Anticorpo Um anticorpo para a WT e B para o mutante (ambos os anticorpos têm de ser levantada num hospedeiro diferente do anticorpo dpERK). Uma vez que os dois genótipos foram coradas com o anticorpo primário, e lavou-se, eles podem ser misturados em um tubo e agora corado com o anticorpo dpERK, seguido por um tratamento com o anticorpo secundário para visualizar todos os anticorpos no tubo. A capacidade de comparar diferentes genótipos em um único slide, especialmente quando Deductions de padrões de ativação estão sendo feitos garante interpretações precisas que não são afectadas por condições de coloração distintas.

Embora vantajosa, existem múltiplos passos ao longo do método de suspensão que requerem manipulação cuidadosa. É fundamental que as dissecações ocorrer de forma eficiente tempo; importante, as dissecações não deve demorar mais de 5 min. vezes dissecação mais longos resultar em sinal dpERK variável, que muitas vezes podem ser mal interpretadas como mudanças regulamentadas ativação ERK, ao invés de falhas como técnicas. É fundamental começar com mais de 100-150 animais para cada dissecção porque ao longo dos vários passos de lavagem das gónadas pode ser facilmente perdida dos tubos devido a erros de pipetagem. Perda de gónadas pode ser reduzida através da dissecção em vários pequenos lotes (como três lotes de 50 animais cada) que podem ser combinados, ou dissecando um grande lote de 150. Outro desafio é fazer as gônadas de mentir em um bem-espaçados formaçãono slide para que toda a gônada distal pode ser trabalhada. Para habilitar isso, use uma pestana em um palito de fósforo ou uma pipeta puxado para o espaço fora das gônadas. No entanto, deve ser tomado cuidado para não danificar as gônadas durante este processo. Muitas vezes, com essas técnicas que leva várias tentativas para dominar as dissecações, bem como arranjos das gônadas nas lâminas.

Uma vez que esta técnica tem sido dominada, ela serve como um poderoso método para análises biológicas variadas, e pode ser usado para estudar mais do que apenas níveis dpERK. Por exemplo, este método pode ser usado para visualizar os níveis activos de p38, ou níveis de CDK activos, ou qualquer proteína para a qual existe um reagente de anticorpo. Além disso, o método pode ser acoplado com uma tela de inibição química em animais inteiros para ensaio para novos inibidores ou activadores da via, por meio de ensaio para os níveis de dpERK. Isto irá permitir uma leitura tanto in vivo de reacção e a sensibilidade a quaisquer inibidores que podem interact com a via de sinalização RTK-RAS-ERK. Além disso, este método pode ser usado em combinações de anticorpo com várias saídas de sinalização que podem ser utilizados e visualizados de uma só vez. Utilizando múltiplos anticorpos permite correlação entre múltiplas vias, o seu estado de ativação, e os resultados todos dentro do mesmo tecido, permitindo um melhor entendimento destas interações. Estes são apenas alguns exemplos de novas aplicações deste método, mas este sistema pode ser modificado para estudar vários interesses de pesquisa.

Divulgações

Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Agradecimentos

O trabalho no Arur Lab é apoiado por doações do National Institutes of Health, NIHGM98200; Instituto de Pesquisa de Prevenção do Câncer do Texas, CPRIT RP160023; o Prêmio Acadêmico de Pesquisa da American Cancer Society (ACS RSG014-044-DDC); e pelos Fundos Anna Fuller.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseSigma Inc.A9539Dissolva 2 g em 100 mL para fazer a solução a 2%
Prato de relógio de vidro de fundo planoAgar ScientificAGL4161Usamos vidro porque as gônadas dissecadas geralmente grudam em agulhas de plástico
25 GSeringas de 305122
(podem ser 1 ou 5 mL)Seringas BD1 mL: BD 309659
Lâminas de microscópio (25 x 75 x 1,0 mm)Fisherbrand12-550-343
Lamínulas (24 x 50 mm)Corning2935-245
5 mLCorning8060-5
Fisherbrand13-678-20D
Centrífuga
Tubos de vidro (6 x 50 mm)Solução Fisherbrand14-958-A
*M9
LevamisolSigmaL9756
3% Paraformaldeído (PFA)Serviços de microscopia eletrônica17500Obtido como solução a 16% em ampolas e diluído a 3% em tampão fosfato de potássio
1x PBS-T1x PBS com 0,1% Tween 20
MetanolServiços de microscopia eletrônica18510
Cabra normal soro (NGS)Sinalização Celular5425Diluído a 30% em 1x anticorpo PBS-T
MAPKYT (dpERK) Sigma Inc.M9692Diluição 1:400 em 30% NGS
Anticorpo secundárioInvitrogenA-11005Diluição 1:500 em 30%
NGS DAPISigmaD9542
VectashieldVector LabsH-1000
*M9 Buffer Receita3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O a 1 L. 
**PBS (1x)8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 0,133 g de CaCl2, 0,10 g de MgCl2, H2O a 1 L
de meio de crescimento de nematóides (NGM)3 g de NaCl, 17 g de ágar, 2,5 g de peptona, 975 mL de água em 2 L de frasco Erlenmayer. Autoclave por 50 min. Resfrie e adicione 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 5 mg/mL de colesterol, 1 mL de 1 M MgSO4 e 25 mL de 1 M KPO4. 
deBD PrecisionGlideTubo cônico de vidro Pipeta descartável Pasteur de 9" de bancada clínica

Referências

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