Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Resumo

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Resumo

O complexo LINC foi hipotetizado como a estrutura crítica que medeia a transferência de forças mecânicas do citoesqueleto para o núcleo. A nesprina-2G é um componente-chave do complexo LINC que conecta o citoesqueleto de actina às proteínas de membrana (proteínas de domínio SUN) no espaço perinuclear. Essas proteínas de membrana se conectam às lâminas dentro do núcleo. Recentemente, uma sonda de força de transferência de energia de ressonância (FRET) de Förster foi clonada em mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (sensor de tensão)) e usada para medir a tensão através do Nesprin-2G em fibroblastos NIH3T3 vivos. Este artigo descreve o processo de uso de Nesprin-TS para medir as forças do complexo LINC em fibroblastos NIH3T3. Para extrair informações de FRET do Nesprin-TS, também é apresentado um esboço de como desmisturar espectralmente imagens espectrais brutas em canais fluorescentes aceitadores e doadores. Usando software de código aberto (ImageJ), as imagens são pré-processadas e transformadas em imagens raciométricas. Finalmente, os dados FRET de Nesprin-TS são apresentados, juntamente com estratégias de como comparar dados entre diferentes grupos experimentais.

Introdução

Sensível à força, sensores de FRET geneticamente codificados surgiram recentemente como uma ferramenta importante para a medição de forças de tracção baseada em células vivas, fornecendo informações sobre como as forças mecânicas são aplicados em proteínas ^{1, 2, 3, 4.} Com essas ferramentas, os pesquisadores podem imagem não-invasiva forças intracelulares em células vivas usando microscópios fluorescentes convencionais. Estes sensores consistem de um par de FRET (proteínas fluorescentes dadores e aceitador, mais frequentemente um dador e ace....

Protocolo

1. Obter Nesprin-2G DNA do sensor e outras DNA plasmídeo

1. Obter Nesprin-2G TS (sensor de tensão) de controlo, Nesprin-2G HL (sem cabeça), mTFP1, Vénus, e TSmod a partir de uma fonte comercial. Propagar todos os plasmídeos de ADN e purificá-los utilizando estirpes de E. coli convencionais, tais como DH5-α, como descrito anteriormente ^{12, 13.}

2. Células transfectar com Nesprin-2G e outro ADN de plasmídeo

1. Cultivar células de fibroblastos NIH 3T3 de 70-90% de confluência numa placa de cultura de células de 6 poços numa incubadora de cultura de célul....

Resultados

Seguindo o protocolo acima, o DNA de plasmídeo foi adquirida a partir do repositório de ADN e transformado em células de E. coli. E. coli que expressam o ADN do sensor foram seleccionados a partir de placas de LB / Ampicilina e amplificado em um caldo de LB líquido. Após a amplificação dos vectores, plasmídeos de ADN foram purificados em tampão TRIS-EDTA utilizando um padrão, disponíveis comercialmente kit de isolamento de ADN. Usando um espectrofotómetro, o ADN purific.......

Discussão

Um método e demonstração da imagem de células vivas da tensão mecânica através Nesprin-2G, uma proteína no complexo nuclear LINC, foi descrito acima. Antes deste trabalho, várias técnicas, tais como a aspiração micropipeta, magnético-grânulo citometria, e microscopia laser de ablação, têm sido usados para aplicar pressão sobre o núcleo da célula e para medir as suas propriedades de material a granel ^{16, 17, 18.} No .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Recuperar de https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Recuperar de https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Recuperar de https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Recuperar de https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Recuperar de células https://www.addgene.org/26021/
competentes	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Placas de cultura bacteriana	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US
Ampicilina	Sigma	A9518
Espectrofotômetro	Biorad	273 BR 07335	Cubeta de quartzo SmartSpec Plus
	Cubeta	de 1702504	Biorad para SmartSpec Plus
Kit de isolamento de DNA	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
Placa de cultura de células de 6 poços	Falcon-Corning	353046	Multiwell Placa de cultura de polistreno de 6 poços
Meio de águia modificado de Dulbecco, (DMEM)	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Soro bovino	Life Technologies	16170-078
mídia de células de soro reduzido	Gibco	31985-070	Meio de soro reduzido, "optimem"
Lipídio Solução transportadora	invitrogen	11668-019	Reagente lipídico, "Lipofectamine 2000"
Tubo de plástico estéril de 1,5 mL	Denville	c2170
Tripsina	Gibco	25200-056	0,25% Tripsina-EDTA (1x)
prato de visualização de microscópio com fundo de vidro	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	prato de 35 mm com poço de fundo de 20 mm #1,5 vidro
Fibronectina	ThermoFisher	33016015	fibronectina proteína humana, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL tubo de centrífuga estéril	Greiner bio-one	188261
centrífuga de rotor oscilante	Thermo electron	Centra CL2	Rotor oscilante thermo electron 236
capa de biossegurança para cultura de células	Forma Scientific	1284
incubadora de cultura de células climatizada	ThermoFisher	3596
microscópio fluorescente de campo amplo com LED invertido	technologies	EVOS FL
Clear HEPES tamponado meios de imagem	Sondas moleculares
Fetal bovino Serum	Life technologies	10437-028
Temperatura Controlada-Confocal invertida com fontes de laser de 458 e 515 nm	Zeiss	LSM 710-w/detector
Mídia de Crescimento	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblastos	ATCC	CRL-1658

Life A14291DJMETA espectral