Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Resumo

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Resumo

A adesão celular, a migração e a invasão estão envolvidas em muitos processos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, durante a formação de metástases, as células tumorais devem atravessar barreiras anatômicas para invadir e migrar através do tecido circundante, a fim de atingir o sangue ou vasos linfáticos. Isso requer a interação entre células e a matriz extracelular (ECM). No nível celular, muitas células, incluindo a maioria das células cancerosas, são capazes de formar invadosomes, que são estruturas baseadas em F-actina capazes de degradar ECM. Os invadosomos são estruturas de actina protrusivas que recrutam e ativam metaloproteinases de matriz (MMPs). A composição molecular, a densidade, a organização e a rigidez do ECM são cruciais na regulação da formação e ativação do invadosoma. In vitro , um ensaio de gelatina é o ensaio padrão usado para observar e quantificar a atividade de degradação do invadosoma. No entanto, a gelatina, que é o colágeno I desnaturado, não é uma matriz fisiológica eLement. Um novo ensaio utilizando fibrilas de colágeno de tipo I foi desenvolvido e utilizado para demonstrar que esta matriz fisiológica é um potente indutor de invadossomas. Os invadosomas que se formam ao longo das fibrilas de colágeno são conhecidos como invadosses lineares devido à sua organização linear nas fibras. Além disso, a análise molecular de invadossomas lineares mostrou que o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1) é o receptor envolvido em sua formação. Esses dados demonstram claramente a importância de usar uma matriz fisiologicamente relevante para entender as complexas interações entre células e ECM.

Introdução

A remodelação da matriz extracelular (ECM) ocorre durante processos fisiológicos e patológicos, como angiogênese e invasão de células tumorais. Em condições fisiológicas, muitos tipos de células, principalmente da linhagem hematopoiética, são capazes de degradar elementos ECM. Por exemplo, os macrófagos são capazes de atravessar barreiras anatômicas para atingir os tecidos e osteoclastos degradam a matriz óssea para garantir a homeostase do cálcio. Mais globalmente, todas as matrizes do corpo se renovam para manter suas propriedades físicas e químicas. Nos tecidos do câncer, a composição do microambiente do tumor é alterada. Por exemplo, no câncer de mama e câncer de....

Protocolo

NOTA: Antes da fixação, todas as etapas são completadas em uma capa de fluxo laminar estéril.

1. matriz 2D

NOTA: as matrizes 2D são usadas para determinar a porcentagem de células que formam invadosomes e a área de degradação da matriz por célula.

Figura 1: Protocolo. Resumo do protocolo utilizado para preparar matrizes de gelatina e colágeno I. É possível fazer apenas a matriz de gelatina ou uma matriz mista de gelatina e colágeno I.

Resultados

Usando uma combinação de dois tipos de matrizes, gelatina e colágeno tipo I ( Figuras 1 e 4 ), destacamos um novo tipo de invadosoma, conhecido como invadossomas lineares. A rotulagem dessas matrizes permite a observação da formação de invadosoma linear ao longo de fibras de colágeno I e de suas capacidades de degradação ( Figura 5 ). O número de estruturas invasivas pode então ser quantificado pela macro descrita anteriormente (passo 4........

Discussão

Classicamente, os invadosomas são estudados in vitro , independentemente do microambiente e da matriz em que as células são banhadas. São atualmente utilizados vários tipos de matrizes, incluindo gelatina, fibronectina, vitronectina ou colágeno fibrilar de alta densidade (HDFC) ^{7 , 11} ; No entanto, muitas vezes não são representativas do microambiente em que as células residem e não são fisiologicamente relevantes. Aqui, foi utilizado um novo tipo de ma.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de gelatina	Sigma	G1393	Estoque 20 mg/ml usado a 1 mg/ml
Gelatina de pele de porco Oregon green 488 conjugado	Tecnologias de vida de sonda molecular	G13186	5mg diluído a 1 mg/ml em água estéril
Óculos de cobertura para microscópio	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø 12mm No.1
2.5% Glutaraldeído em tampão de cacodilato de sódio 0.1M pH 7.4	Ciência da microscopia eletrônica	15960	Diluir a 0.5% em água estéril
1x PBS pH 7.4	Gibco da life technologies	10010-015	Use este PBS em todas as etapas antes da fixação
Colágeno I Cauda de rato	Corning	354236
5 carboxi X rhodamin siccinimidyl ester	technologies	C-6125
DPBS 1x + cálcio + magnésio	Gibco da life technologies	14040-091
Paraformaldeído 16% solução	Microscopia eletrônica	ciência 15710	Diluir a 4% em 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x tampão PBS pH 7.4	Ambion	AM9625	Diluir a 1X em água Usar em etapas após a fixação
Anticorpo	Tks5Santa Cruz	sc-30122	Marcadores de invadossomo Diluição: 1/100
Anticorpo Cortactin 4F11	Millipore	5180	Marcadores de invadossomo Diluição: 1/100
Anticorpo DDR1	Sinalização celular	5583	Receptor linear de invadossomo
Diluição: 1/100
Faloidina FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Marcador de actina fibrilar Diluição :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Marcador de núcleo Diluição :1/200
Anticorpos secundários FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H ou FP-647H
Albumina de soro bovino	Sigma	A2153	Diluir a 4% em 1X
PBS Fluoromount G meio de montagem	Interchim	FP 483331
software ImageJ	Domínio		públicohttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Inserção de cultura de células	Corning	353097	8.0µ m tamanho do poro / 24 poços
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma	221465

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