Quantificação histológico de miocárdio crônico infarto em ratos

Resumo

A avaliação post-mortem do infarto do miocárdio (IM) em roedores é baseada na quantificação do infarto em cortes cardíacos corados. Descrevemos um método preciso para quantificar o tamanho do infarto usando amostragem sistemática de corações de ratos colhidos da base ao ápice e análises de imagem de cortes histológicos corados com tricrômio.

Resumo

O infarto do miocárdio é definido como a morte de cardiomiócitos devido à isquemia prolongada; uma resposta inflamatória e formação de cicatrizes (fibrose) seguem a lesão isquêmica. Após a fase aguda inicial, o remodelamento crônico do ventrículo esquerdo (VE) modifica a estrutura e a função do coração. A ligadura coronária permanente em pequenos animais tem sido amplamente utilizada como modelo de referência para um modelo crônico de infarto. O afinamento da parede infartada evolui progressivamente para fibrose transmural. A avaliação histológica do tamanho do infarto é comumente realizada; No entanto, falta uma padronização dos métodos de quantificação. De fato, aspectos metodológicos importantes, como o número de seções analisadas e os métodos de amostragem e quantificação, geralmente não são descritos e, portanto, impedem a comparação entre as investigações. Muitas vezes, a quantificação é realizada em um único corte obtido ao nível dos músculos papilares. Como novas estratégias destinadas a reduzir a expansão e remodelação do infarto estão sendo investigadas, há uma necessidade importante de padronização de protocolos precisos de amostragem cardíaca. Descrevemos um método preciso para quantificar o tamanho do infarto usando uma amostragem sistemática de coração de rato colhido e análises de imagem de cortes histológicos corados tricromáticos obtidos da base ao ápice. Também fornecemos evidências de que o cálculo do índice de expansão (IE) permitiu a avaliação do tamanho do infarto, levando em consideração as alterações do ventrículo esquerdo ao longo do remodelamento.

Introdução

O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo. A doença cardíaca coronária é a causa principal; MI resulta de isquemia consecutiva a eventos coronarianos, como a oclusão. Quando reperfusão não é realizada dentro do primeiro 6 horas, isquemia induz necrose miocárdica irreversível. Em pacientes, o caracterização de MI conta com diferentes ferramentas de diagnóstico, incluindo sinais clínicos, eletrocardiograma, avaliação dos níveis plasmáticos de biomarcadores, ecocardiograma, imagiologia de ressonância magnética, e histológica ^1. MI aguda e crónica são classificados como duas fases diferentes da lesão de acordo com a temporização da necrose do miocárdio em relação ao momento da oclusão coronária. A fase aguda, ocorrendo durante os primeiros 7 dias, está associada com a perda de cardiomiócitos, inflamação extensiva, e o recrutamento de fibroblastos. A fase sub-aguda, caracterizada por a cura do tecido cardíaco e a formação de uma cicatriz, ocorreentre 1 e 4 - 6 semanas. Expansão do infarto, afinamento da parede do ventrículo, e dilatação do ventrículo caracterizar a fase crônica. Remodelação extensa do ventrículo esquerdo resulta progressivamente de insuficiência cardíaca grave ^2.

MI induzida pelo permanente anterior esquerda artéria descendente (LAD) ligadura representa o modelo de roedor padrão de infarto crônico do miocárdio. Os imita ligadura coronária oclusão coronária. O tamanho do enfarte depende do local da ligadura. Caracterização de lesão isquémica do miocárdio em um modelo de roedor é classicamente realizada utilizando os níveis plasmáticos de biomarcadores, como a troponina I e T ^3, ecocardiograma, ressonância magnética, e histologia ^4,5. níveis de biomarcadores são correlacionados com a extensão da morte de cardiomiócitos. Ecocardiografia avalia a esquerda comprometimento da função ventricular resultante de anormalidades de movimento de parede regional. Além disso, técnicas de imagem não invasivos, como a ressonância magnética ou de alta resoluçãoecocardiografia, permitir a avaliação da redução do movimento da parede, o volume da área da cicatriz com diminuição da perfusão e miocárdio viável, eo afinamento da parede. dimensões do VE permitir a avaliação precisa do tamanho do infarto. Finalmente, a quantificação do miocárdio viável e mortos podem ser post-mortem realizados usando manchas específicas de secções histológicas de corações colhidas e permite a verificação do tamanho do enfarte (IS). Outra característica importante é a avaliação do índice de expansão do enfarte (EI) ^6. A EI é associado com o infarto transmural e começa nos primeiros 3 dias. A EI é caracterizada por uma redução progressiva da espessura da parede, um aumento no tamanho da cavidade do VE, e consequentes alterações na forma do LV.

A fim de avaliar a eficácia terapêutica de novos tratamentos - em particular, as estratégias baseadas em células regenerativas, matrizes, e o gene de avaliação de entrega precisas de MI em roedores é de importância primordial.Quando medido em uma única seção transversal obtida ao nível dos músculos papilares, o tamanho é pode ser tendenciosa, devido à grande variabilidade que existe no desenvolvimento do infarto seguinte ligadura LAD; o enfarte apex pode ser, em seguida, ocultado. Importante, as metodologias mais precisas para o tamanho determinado MI têm sido descritos para ratinhos ou ratos ^{7-9 10.} No entanto, é insuficiente para quantificar com precisão remodelação LV ou reduções induzidas terapeuticamente (ou prevenções) da remodelação. Com efeito, este modo é geralmente expressa como uma percentagem do volume total do VE avaliada em secções transversais do coração. Embora este método é válido para infarto agudo do miocárdio, o afinamento da parede do LV que ocorre durante a remodelação permanece sub-avaliada ^11,12. A quantificação morfométrica completa do tamanho do infarto e mudanças estruturais devem quantificar vários parâmetros, tais como comprimentos do endocárdio e epicárdio e diâmetros, bem como enfarte e áreas saudáveis. Nós descrevemos um aprox metodológicaoach para avaliar com precisão MI e remodelação em um modelo de rato crônica.

Protocolo

Todos os animais receberam cuidados de acordo com a Convenção Europeia dos Animal Care. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados em conformidade com a Lei de Protecção dos Animais Suíça depois de obter autorização do Serviço Veterinário do Estado, Fribourg, aprovado pelo Swiss Federal Veterinário, Suíça.

Colheita 1. Coração

NOTA: Todas as intervenções cirúrgicas foram realizadas sob anestesia isoflurano. Foram feitos esforços para diminuir o sofrimento animal. Em particular, todos os animais receberam uma injecção subcutânea de 0,1 mg / kg de buprenorfina pré-anestésica. O protocolo cirúrgico para indução de enfarte do miocárdio foi anteriormente descrito noutro local ^13.

1. Executar uma esternotomia sobre um animal myocardially infartada sob anestesia (animal entubado, 2,5% de isoflurano, a anestesia adequada confirmados pela pata pitada reflex).
   1. Abra o animal por o corte da pele e, em seguida, os músculoscom uma tesoura cirúrgica. Corte as costelas do lado esquerdo e direito, e em seguida, remover o peito.
   2. Retirar as adesões restantes após a cirurgia anterior (LAD ligadura). Cortar a aorta e remover o coração. Colocar o tecido em KCl 1 M (em PBS), e em seguida lavar com PBS.

2. Preparação do Tecido

1. Colocar o coração infartado longitudinalmente em uma matriz de coração de rato acrílico. Mantê-lo a -20 ° C durante 1 h.
2. Cortar o coração diretamente na matriz usando uma lâmina de barbear com uma transversal. Certifique-se de cada fatia é de 2 mm de espessura. Cortar aproximadamente 5-7 diapositivos para cada coração (com base no nível de remodelação); isso é chamado de amostragem sistemática.
3. Neste passo, realizar a coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) é opcional (manter a orientação da base de fatias de coração-a-ápice).
   1. Incubar em 1% de TTC em PBS durante 50 min a 37 ° C. Incubar-lo em 4% de paraformaldeído (PFA) durante 20 min a 1 h. Coloque as seções between duas placas de vidro com espaçadores de 2 mm e tirar fotos com um microscópio estereológica acoplado com uma câmera de 15X de ampliação.
      CUIDADO! O paraformaldeído é tóxico.
4. Deslize congelamento (1 opção ^st)
   1. Colocar cada lâmina em um molde de plástico (10 x 10 x 5 mm) com meio para cryotomy (temperatura de corte óptima, outubro) de montagem, manter a orientação (colocar o lado do vértice orientado da secção para baixo na parte inferior do molde). Congelar os blocos com vapores de 2-metilbutano em atmosfera de azoto líquido de arrefecimento para 10 - 15 min. Finalmente, armazenar o tecido a -80 ° C.
5. Parafinização (2 opção ^nd)
   1. Colocar cada lâmina na incorporação de cassetes (manter a orientação, colocando o lado orientado para o vértice da secção para baixo na parte inferior da cassete) e, em seguida, em PFA a 4% durante 24 h. Coloque-o em uma noite máquina de processador de tecidos.
      1. Incubar-lo em etanol a 70% durante 2 h. Incubar em que etanol 95% durante 2 h. Incubar-lo em etanol a 100% durante 3 h. Incubar-lo em xilol durante 4 h. Incubar-lo em parafina (derretida a 60 ° C num forno), durante 5 h. Finalmente, fazer blocos, incorporando cada slide coração em parafina.

3. Masson-Goldner tricromo

1. Fazer secções de tecido a partir de blocos de parafina com um micrótomo manual (espessura: 5 ^ M) ou a partir de blocos PTU com um criostato ajustado para -18 ° C (espessura: 7 mm).
2. Manchar um slide de cada peça do coração para cada rato (3 - 4 secções transversais por slide) com Masson-Goldner tricromo (ver anexo).
   NOTA: Iniciar a partir deste passo para as seções de parafina.
   1. Derreter as lâminas a 60 ° C num forno. De acordo com um exaustor, eles Desparafinar duas vezes em xilol durante 10 minutos cada. Rehidratar-los em 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol, e água destilada, durante 3 minutos cada.
      NOTA: Iniciar a partir deste passo para o criocortes.
   2. Corrigi-los em Bouin solução durante a noite. Em seguida, lave-os em água corrente por 10 - 15 min. Lave-os em água destilada. Incubar-los em hematoxilina de Mayer por 3 min.
   3. Retirar as lâminas e deixá-los em água destilada durante 5 minutos. Em seguida, incubam-los em ácido fucsina-Ponceau durante 5 min. Lave-os em ácido acético a 1% durante 1 min.
   4. Em seguida, incubam-los em ácido fosfomolíbdico Orange G durante 1 min. Lave-os em ácido acético a 1% durante 1 min, incubar-las à luz corante verde durante 10 minutos, e lavá-los em ácido acético a 1% durante 1 min.
   5. Desidratar-os em 70% de etanol (30 seg), 95% de etanol (30 seg), e etanol a 100% (5 min). Coloque uma gota de um meio de montagem resinoso nas secções de tecido, cobri-los com lamelas, e deixe-os secar.

Análise Tamanho 4. Infarto

1. Adquirir uma imagem de cada slide em uma lupa estereoscópica (15X de ampliação) acoplado com uma câmera. Fotografar uma régua com a mesma configuraçãos.
2. Use software de análise de imagem para medir a espessura da cicatriz no meio do enfarte, a espessura do septo, área da cavidade do ventrículo esquerdo (VE), a área de enfarte e área de tecido do LV utilizando.
   1. Definir a escala com a imagem régua (Figura 1A).
      1. Clique em Medidas, em seguida, selecione Definir Fator de Conversão. Desenhar uma linha na barra de calibração. Botão direito do mouse sobre a imagem e clique sobre a calibração End. Observe o valor bar, e, em seguida, clique em OK.
   2. Escolha do LV a partir da imagem do coração coradas (Figura 1B). Use a ferramenta segmento múltipla. Selecione o ponto-a-ponto LV, e clique depois à direita Copiar / colar em qualquer lugar.
   3. Medir a espessura da cicatriz e do septo usando a ferramenta de medição único segmento (Figura 1C ).
   4. Detectar automaticamente o LV cavidade, enfarte, e áreas LV utilizando a ferramenta de medição de área automático no modo RGB (Figura 1D).
      1. Clique na ferramenta. Ative Só Fronteiras e Contígua no modo RGB. Finalmente, clique dentro da área de interesse para detectá-lo. Se necessário, use ferramentas de precisão.
3. Calcular o tamanho do enfarte como a relação da área de enfarte e a área de LV.
4. Calcular o índice de expansão da seguinte forma: [área da cavidade LV / toda a área LV] / [espessura enfarte / espessura do septo], com toda a área de LV incluindo tanto a cavidade do VE e áreas de tecido do LV.
5. Finalmente, calcule uma "média" para cada coração como segue: [média de índice de expansão das lâminas infartados] * [Número de lâminas infartados / número total de slides].

Resultados

pós-LAD ligadura seis semanas, corações foram colhidas de ratos Lewis. secções de tecido de 2 mm foram obtidas a partir do vértice para a base. Um procedimento de coloração TTC foi realizada para visualizar a área de enfarte, que aparece em branco, eo miocárdio saudável, que aparece em vermelho (Figura 2). Dependendo do local de ligação da ADA, a dimensão do enfarte varia. Para grande MI, infartos transmurais foram observados a partir do vértice para a base (Figu...

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

tecido fibrótico pode ser avaliada com precisão em um modelo de rato MI crónica utilizando amostragem sistemática do coração e imagem colhida análises dos cortes histológicos tricromáticas-manchado obtidos a partir da base para o ápice. Dois passos são particularmente importantes para implementação do protocolo de sucesso. Em primeiro lugar, o uso de KCl para a colheita coração permite que o músculo cardíaco a ser mantido num estado relaxa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz acrílica do coração do rato 2 milímetros	72-5015	Harvard Appartus
Inspira ventilador controlado volume avançado	Aparelho de Harvard	557058
cateter Insyte 14 G	BD	381267
O.C.T	BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	Sigma Aldrich
Mayer hematoxilina	MHS32-1L	Sigma Aldrich
Ácido Fucsin CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
Laranja G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
Verde claro CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
KCl	P9333-500G	Sigma Aldrich
Xylol	10315083	HoneyWell
Etanol absoluto	10303990	HoneyWell
2-metilbutano	M32631-1L	Sigma Aldrich
Microscópio estereogical	SM2800	Nikon
Formaldeído	99340	Reactolab
de incorporação	K113.1	Carl Roth
Bersoft Software		Bersoft.com	Software licenciado

de medição de imagem