Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Resumo

O estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, fornecendo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Apresentamos um protocolo para induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) usando gravidade centrífuga (CG). A regulação positiva de SOX9 induzida por CG resulta no desenvolvimento de fenótipos condrogênicos.

Resumo

A cartilagem prejudicada não pode cicatrizar naturalmente. Atualmente, a terapia mais avançada para defeitos na cartilagem é o transplante de condrócitos diferenciados de células-tronco por meio de citocinas. Infelizmente, a diferenciação condrogênica induzida por citocinas é cara, demorada e associada a um alto risco de contaminação durante a diferenciação in vitro. No entanto, os estímulos biomecânicos também servem como fatores reguladores cruciais para a condrogênese. Por exemplo, o estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, sugerindo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Neste estudo, demonstramos que a gravidade centrífuga (CG, 2.400 × g), um estresse mecânico facilmente aplicado por centrifugação, induziu a regulação positiva da região determinante do sexo Y (SRY)-box 9 (SOX9) em células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), fazendo com que expressassem fenótipos condrogênicos. As ASCs centrifugadas expressaram níveis mais altos de marcadores de diferenciação condrogênica, como agrecan (ACAN), colágeno tipo 2 alfa 1 (COL2A1) e colágeno tipo 1 (COL1), mas níveis mais baixos de colágeno tipo 10 (COL10), um marcador de condrócitos hipertróficos. Além disso, a formação de agregados condrogênicos, um pré-requisito para a condrogênese, foi observada em ASCs centrifugados.

Introdução

Defeitos na cartilagem articular não curam naturalmente. Consequentemente, transplante de células estaminais tem sido proposto como uma abordagem promissora para a reparação de cartilagem deficiente. No entanto, este método requer a aquisição de um número suficiente de células estaminais e a indução destas células para sofrerem diferenciação condrogénica. medula óssea (MO) tem sido amplamente utilizado como uma fonte de células estaminais, mas o isolamento de células a partir de BM tem duas grandes desvantagens: a invasividade e rendimento insuficiente. Devido à sua facilidade de aquisição, o tecido adiposo é uma fonte preferida de células estaminais. Estudos anteriores demonstraram a possibilidade de isolar as células estaminais a partir de tecido adiposo e indução da diferenciação condrogénica nestas células utilizando citoquinas, tais como TGF-β1 ^{1, 2.} Esses métodos são eficazes, mas caro.

Como uma alternativa de baixo custo para as citocinas, a tensão mecânica pode ser usado parainduzir a diferenciação condrogênica. Carga mecânica desempenha um papel crítico na manutenção da saúde da cartilagem articular ^3, e pode induzir fenótipos condrogênicos em várias células. Por exemplo, a pressão hidrostática induz fenótipos condrogênicos em células progenitoras derivadas de sinóvia por meio da via da MAP-cinase / JNK ^4, e a compressão mecânica induz condrogénese em células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) por regulação positiva de genes condrocítico ^5. Além disso, a tensão de cisalhamento contribui para a expressão de matriz extracelular relacionada com a condrogénese (ECM) em ⁶ MSCs humanas. Centrífuga gravidade (CG), um stress mecânico controlado facilmente aplicada e gerado por centrifugação, pode induzir a expressão diferencial de genes em células de ^7. Por exemplo, em células de carcinoma epitelial de pulmão, a expressão de interleucina (IL) -1-B é regulado positivamente por centrifugação ^8. Tor conseguinte, como um stress mecânico experimentalmente indutível, CG pode ser utilizado para induzir a expressão de genes em células estaminais condrocítico. No entanto, não fica claro se CG pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco.

Neste estudo, descobrimos que CG induziu a regulação positiva de SOX9, um regulador mestre da chondrogenesis, no ASC humanos, resultando na superexpressão de genes condrocítico. Além disso, comparou-se os efeitos de CG em condrogénese com aqueles de TGF-β1, o factor de crescimento mais comumente usado para induzir a condrogénese in vitro em células estaminais.

Protocolo

Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC16EAME0162) e realizada de acordo com as diretrizes do NIH. Todos os tecidos foram obtidas com consentimento informado por escrito.

1. centrífugas Gravidade carregar e Cultura Pellet

1. Cultura de células e colheita
   1. ASC Culture (P2-P3; ver Lista de Materiais) em modificação Médio-baixo teor de glucose de Eagle da Dulbecco (DMEM-LG) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2.
   2. Quando as células atingem a confluência de 80%, descartar o meio e lava-se as células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
   3. Adicionar 1 ml de PBS contendo EDTA 1 mM e incuba-se durante 2 min a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2.
   4. Toque da placa de cultura suavemente, adicionar 4 ml de meio fresco e transferir para as célulasum tubo de 15 mL cónico, e centrifugar as células a 250 x g durante 2 minutos à temperatura ambiente (TA).
2. Carregando gravidade centrífuga
   1. Após centrifugação (passo 1.1.4), remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM-LG com FBS a 10%. Contar as células usando um hemocitômetro.
   2. Por CG carga, transferir 2,5 x 10 ⁵ células para um novo tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 2400 x g durante 15 min.
3. cultura pellet
   1. Imediatamente após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e adicionar 500 mL de meio de diferenciação condrogénica definido (CDM, DMEM-elevado teor de glucose suplementado com FBS a 1%, com 100 nM de dexametasona, 1x MEM não essenciais solução de aminoácidos 1% ITS + Premix, 50 ug / ml de L-prolina, e 1% de penicilina / estreptomicina). Adicionar 50? G / ml de ácido L-ascórbico 2-fosfato preparada de fresco a cada mudança de meio. Como um controlo positivo, induzir differentiati condrogênicasem células não centrifugada por adição de MDL contendo 10 ng / mL de TGF-β1.
   2. Colocar os tubos tapados frouxamente contendo os peletes numa posição de pé e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2.
   3. Alterar o meio em dias alternados durante 3 semanas.
4. cultura Micromass
   1. Imediatamente após a centrifugação (passo 1.2.2; 2400 × g durante 15 min), aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de MDL.
   2. Para formar um Micromass, colocar as células ressuspensas no centro de um poço de uma placa de 24 poços.
   3. Após 2 h, adicionar cuidadosamente 1 mL de MDL para o poço, pipetando contra a parede da placa para evitar perturbar o Micromass. Como um controlo positivo, realizar uma cultura de micromassa com células não centrifugada por adição de MDL contendo 10 ng / mL de TGF-β1.
   4. Incubar a Micromass a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2.
   5. Alterar o ev médioery outro dia durante 3 semanas.

2. Transcriptase Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) para detectar transcricional A sobre-regulação de marcadores condrogénica Diferenciação

1. No dia 14, utilizar uma pipeta para transferir os peletes esferoidais para um novo tubo de 1,5 mL e lavá-las em PBS 1x.
2. Extrai-se a ARN total a partir dos peletes utilizando o tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio método de extracção ^9.
3. Sintetizar ADNc a partir de 2 ug de ARN total utilizando a transcriptase reversa de acordo com o protocolo do fabricante (incubar a 42 ° C durante 1 h e, em seguida, desactivar a enzima a 70 ° C durante 5 min).
4. Executar PCR com primers específicos para os marcadores de diferenciação condrogênicas ^10.

3. Coloração para detectar a sobre-expressão de condrogênica Diferenciação marcador Proteínas

1. peletes de células-parafina
   1. No dia 21,usar uma pipeta para colher os granulados esferóides e lavá-los com PBS 1x.
   2. Fixar os peletes esferoidais por imersão em paraformaldeído a 4% durante 24 h.
      Cuidado: O paraformaldeído é altamente tóxico. Evitar o contacto com os olhos, pele ou membranas mucosas. Minimizar a exposição e evitar a inalação durante a preparação. Use equipamento de proteção pessoal apropriado.
   3. Descartar o fixador e lavar os sedimentos celulares com água desionizada (DW).
   4. Coloque uma camada de gaze para a cassete e transferir os peletes fixos utilizando uma pipeta. Cobrir o sedimento por dobragem a gaze e fechar a tampa do estojo.
   5. Desidratar os peletes.
      1. Mergulhar as pelotas em 70% de etanol (EtOH) durante 5 min à TA.
      2. Mergulhar as pelotas em 80% de EtOH durante 5 min à TA.
      3. Mergulhar os peletes em EtOH a 95% durante 5 min à TA.
      4. Mergulhar os peletes em EtOH a 100% durante 5 min à TA. Repita duas vezes.
      5. Mergulhar as pelotas em 100% de xileno durante 15 min à TA. Repita twice.
   6. Incorporar as pelotas de células fixadas em parafina a 56 ° C num molde; as pelotas podem ser embutidos em parafina utilizando sistemas de processamento de tecido automatizados especializados.
   7. Cortar secções de 5 um de espessura a partir do sedimento de células embebidas em parafina utilizando um micrótomo rotativo.
   8. Flutuar as seções em 50% EtOH e depois transferi-los para um banho de água a 50 ° C usando um slide.
   9. Coloque as seções flutuantes em lâminas.
2. Safranina O e coloração azul Alcian
   1. Reidratar os cortes de parafina.
      1. Imergir as lâminas em xileno durante 15 min. Repita duas vezes.
      2. Imergir as lâminas em EtOH a 100% durante 5 min. Repita duas vezes.
      3. Imergir as lâminas em 90% EtOH durante 5 min.
      4. Imergir as lâminas em 80% EtOH durante 5 min.
      5. Imergir as lâminas em etanol 70% para 5 min, e em seguida lavá-los em 1x PBS.
   2. Manchar as seções reidratadas com solução de safranina O 1% e 3% de azul Alcian para30 minutos.
   3. Descartar a solução de coloração e enxaguar as seções com DW.
   4. Corar as secções com solução Hematoxilina / Eosina (counterstain) durante 1 min.
   5. Descartar a solução de coloração e enxaguar as seções com DW.
   6. Colocar uma gota de meio de montagem sobre uma lamela após a remoção de qualquer água residual. Com cuidado, coloque o slide (celular voltado para baixo) sobre a lamela contendo o meio de montagem.
   7. Permitir que as lâminas secar durante 2-3 h à TA.
   8. Capturar imagens usando um microscópio de campo brilhante (microscópio vertical automatizado, 50X e 200X).
3. imunofluorescência
   1. Reidratar as seções como descrito no ponto 3.2.1.
   2. Mergulhar as lâminas em tampão de citrato de sódio (citrato de sódio 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) e, em seguida, mantê-los a uma temperatura sub-ebulição durante 10 min, utilizando um microondas.
   3. Arrefecer as lâminas durante 20 minutos a TA e, em seguida, lavá-las com água da torneira.
   4. Incubar as lâminas em 3%H ₂ O ₂ (em 1x PBS) durante 15 min, e em seguida, lavá-las com água da torneira durante 15 min, ^11.
   5. Bloquear as lâminas com tampão (soro de cabra normal a 10% em PBS) de bloqueio, durante 1 h.
   6. Aspirar a solução de bloqueio, e, em seguida, aplicar um anticorpo primário diluído com soro de cabra normal a 5% para as lâminas.
   7. Incubar as lâminas durante a noite a 4 ° C.
   8. Lavam-se as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 minutos cada.
   9. Incubar as lâminas em anticorpo secundário conjugado com fluorocromo diluiu-se com soro de cabra normal a 5% durante 1 h à TA no escuro.
   10. Lavam-se as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min cada, no escuro.
   11. Incubar as lâminas com DAPI (1 ug / ml) durante 10 min, e em seguida, lavá-los duas vezes em 1X PBS durante 5 minutos cada.
   12. Colocar uma gota de meio de montagem sobre uma lamela após a remoção de qualquer água residual. Com cuidado, coloque o slide (celular voltado para baixo) no meio de montagem.
   13. Permitir que os slides para secar por 2-3h no escuro à temperatura ambiente.
   14. Visualizar os slides usando microscopia de fluorescência (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X e ampliação de 200X) ^12.

Resultados

gravidade centrífuga induz a superexpressão de marcadores de diferenciação condrogênicas em células-tronco derivadas de tecido adiposo.

Para determinar o grau de força da gravidade centrífuga que é adequado para induzir a diferenciação condrogénica, ASC foram estimuladas com diferentes graus de CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) durante 15 min. Após a estimulação, as ASC foram re-semeadas em placas de cultura e cultivadas duran...

Discussão

O estado stemness de células é muito importante para a superexpressão induzida por CG de SOX9. Em nosso estudo, a expressão SOX9 poderia ser induzida por CG na ASC cedo-passagem (2-3), mas não no ASC depois-passagem. Tem sido relatado que, durante o cultivo, ASC conter células CD34 + 3 até ¹⁶ passagens. ASC tendem a perder a expressão de CD34 como as células são passadas, resultando em uma baixa resposta de CG.

Com força da gravidade centrífugo, a pressão hidrostática...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plasticware
100 mm Prato	TPP	93100
60 mm Prato	TPP	93060
50 mL Tubo Cornical	SPL	50050
15 mL Tubo Cornical	SPL	50015
10 mL Pipeta Descartável	Falcon	7551
5 mL Pipeta Descartável	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Baixa glicose	Life Technologies	11885-084	meio de base de crescimento
Penicilina Estreptomicina	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine	Serum Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	condrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexametasona	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilina Estreptomicina	Life Technologies	P4333	1%
Soro Bovino Fetal	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbato-2-fosfato	Sigma Aldrich	A8960	50 μ g/mL
L-prolina	Sigma Aldrich	P5607	50 μ g/mL
ITS	BD		1%
TGF&beta humano; 1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materiais
18 mm Vidro de cobertura	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Inovação	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
de Vetor	Albumina de Soro Bovino	SP-5050
Anti-Colágeno II	anticorpo abcam	ab34712	1:100
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Alexa Sonda molecular conjugada Fluor 594		A-11037	1:200
DAPI	Sonda molecular	D1306
Prolongar o reagente antidesbotamento de ouro	Invitrogen	P36934
Vidro de corrediça, revestido	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Clorofórmio	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Etanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polimerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
estrela de carregamento	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) marcador de escada de DNA	Enzynomics	DM003
Células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (ASCs)	Células