Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados por separação de esferas magnéticas de células mononucleares do sangue periférico após centrifugação por gradiente de densidade de sangue anticoagulado humano. Após a incubação por 5 dias, os monócitos humanos são diferenciados em células dendríticas imaturas e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico.
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Artigo de método
Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células dendríticas (DCs) reconhecem estruturas estranhas de diferentes patógenos, como vírus, bactérias e fungos, por meio de uma variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) expressos em sua superfície celular e, assim, ativam e regulam a imunidade.
A principal função das DCs é a indução de imunidade adaptativa nos linfonodos, apresentando antígenos via moléculas de MHC I e MHC II para linfócitos T virgens. Portanto, as DCs precisam migrar da periferia para os linfonodos após o reconhecimento de patógenos nos locais de infecção. Para experimentos in vitro ou estratégias de vacinação DC, DCs derivadas de monócitos são usadas rotineiramente. Essas células mostram semelhanças em fisiologia, morfologia e função com as células dendríticas mieloides convencionais. Eles são gerados pela estimulação da interleucina 4 (IL-4) e do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) de monócitos isolados de doadores saudáveis. Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados e estimulados a partir de sangue humano anticoagulado após o enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por centrifugação por gradiente de densidade. Os monócitos humanos são diferenciados em DCs imaturos e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico após 5 dias de incubação.
Introdução
As células dendríticas (CDs) são as células especializadas apresentadoras de antigénios mais importantes do nosso sistema imunitário. DCs imaturos (iDCs) residem na pele ou nos tecidos das mucosas e são, por conseguinte, entre as primeiras células imunes para interagir com os agentes patogénicos invasores. DCs representam a ponte entre o inato eo sistema imunitário adaptativo 1, uma vez que podem activar respostas T e de células B após a detecção de patógenos. Além disso, contribuem para as respostas imunitárias pró-inflamatórios devido à secreção de grandes quantidades de citocinas, tais como IL-1β, IL-6, e IL-12. DCs também activar as células NK e outras....
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Protocolo
declaração de ética: consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes doadores de sangue por parte do Instituto Central de Transfusão de Sangue & Departamento de Imunologia, Innsbruck, Áustria. O uso de amostras de sobras anónimos para fins científicos foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Medicina de Innsbruck Ética.
1. enriquecimento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC)
- Concentração de PBMC por centrifugação.
- Abra o pacote de sangue e dividida em tubos de centrífuga de 50 ml estéreis de acordo com a quantidade de sangue recebida.
- Se necessário, ajustar o volume a 50....
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Resultados
Após centrifugação do sangue anti-coagulado usando uma almofada de sacarose, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são enriquecidas numa interfase no topo do meio de gradiente de densidade (Figura 1). Após as PBMC são retirados, a análise FACS é realizada para caracterizar as diferentes populações de células dentro das CMSPs usando marcadores de linhagem (por exemplo, para os linfócitos T CD3, CD14 para monócitos, e CD19 para linfócitos B).
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Discussão
Este protocolo descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) através do isolamento de monócitos humanos a partir de sangue anti-coagulado usando um ensaio baseado em nanopartícula magnética. Neste protocolo, os passos de centrifugação são realizados a montante do processo de isolamento de células, o que leva a um enriquecimento da fracção de PBMC. Embora as células são perdidas durante a centrifugação, para sobrepor o conteúdo de um saco de sangue inteiro no meio de gradiente de densidade exig.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à nossa técnica Karolin Thurnes, Divisão de Higiene e Microbiologia Médica, e à Dra. Annelies Mühlbacher e ao Dr. Paul Hörtnagl, do Instituto Central de Transfusão de Sangue e Departamento Imunológico, por sua valiosa ajuda e apoio em relação a este manuscrito. Agradecemos ao Austrian Science Fund por apoiar este trabalho (P24598 para DW, P25389 para WP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Partículas Magnéticas | BD Biosciences 557769 | ||
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Fração de Albumina V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Placas de múltiplos poços tratadas com TC transparente Costar 6 Well | Costar | 3506 | |
| Mídia gradiente de densidade: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Pipeta Sorológica | Corning 357551 | ||
| Falcon 25 ml Pipeta Sorológica | Corning 357525 | ||
| Falcon 50 ml Tubo de centrífuga PP de alta clareza | Corning | 352070 | |
| Falcon Tubos de fundo redondo | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Reagente de Viabilidade Celular) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| FBS (soro bovino fetal) inativado por calor, aprovado pela UE Origem (América do Sul) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Tampão de isolamento: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| solução de L-glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575020 |
Referências
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Tur....
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Reimpressões e permissões
