Desenvolvimento de um Modelo-capeamento pulpar direto para a Avaliação dos pulpar cicatrização de feridas e Formação reparadora dentina em Ratos

Summary

Descreve-se um método passo-a-passo de realização de polpa directo capping em ratos dentes para a avaliação da cicatrização de feridas e formação de dentina pulpar reparadora in vivo.

Abstract

A polpa dentária é um órgão vital de um dente totalmente protegido por esmalte e dentina. Quando a polpa é exposta devido a lesões cariogênicas ou iatrogênicas, muitas vezes é tampada com materiais biocompatíveis para acelerar a cicatrização da ferida pulpar. O objetivo final é regenerar a dentina reparadora, uma barreira física que funciona como um "selo biológico" e protege o tecido pulpar subjacente. Embora esse procedimento de capeamento pulpar direto seja usado há muito tempo na odontologia, o mecanismo molecular subjacente da cicatrização de feridas pulpares e da formação reparadora de dentina ainda é pouco compreendido. Para induzir dentina reparadora, o capeamento pulpar foi realizado experimentalmente em animais de grande porte, mas menos em camundongos, presumivelmente devido ao seu pequeno tamanho e às dificuldades técnicas decorrentes. Aqui, apresentamos um método detalhado e passo a passo de realizar um procedimento de capeamento pulpar em camundongos, incluindo a preparação de uma cavidade semelhante à Classe I, a colocação de materiais de capeamento pulpar e o procedimento de restauração usando compósito dentário. Nosso modelo de camundongo de capeamento pulpar será fundamental na investigação dos mecanismos moleculares fundamentais da cicatrização de feridas pulpares no contexto da dentina reparadora in vivo, permitindo o uso de camundongos transgênicos ou knockout que estão amplamente disponíveis na comunidade de pesquisa.

Introduction

A cárie dentária é uma das doenças bucais mais prevalentes e a principal causa de intervenções cirúrgicas nas dentições em quase todos os indivíduos^1,2. O prognóstico das intervenções cirúrgicas e restaurações de um dente depende em grande parte da resposta pulpar adequada e da cicatrização bem-sucedida da ferida. De fato, a cárie dentária que penetra profundamente através do esmalte e da dentina freqüentemente leva à exposição do tecido pulpar subjacente que muitas vezes é "tampado" com materiais dentários, como hidróxido de cálcio (Ca(OH)₂) ou cimentos hidráulicos de cálcio-silicato (HCSCs), incluindo agregados de trióxido mineral (MTA). O objetivo final de tal procedimento de capeamento pulpar é acelerar a cicatrização de feridas pulpares, regenerando a dentina reparadora, uma barreira física que funciona como um "selo biológico" para proteger o tecido pulpar subjacente e aumentar a expectativa de vida do dente e a saúde bucal geral. No entanto, o mecanismo subjacente da cicatrização da ferida pulpar e da formação reparadora da dentina não é totalmente compreendido.

Para melhor compreender os mecanismos de cicatrização de feridas pulpares e formação reparadora de dentina in vivo, vários animais foram utilizados anteriormente, incluindo macacos, cães e^porcos3-5. Dentre eles, os ratos são frequentemente utilizados por serem relativamente menores em tamanho em relação aos outros animais, mas seus dentes são grandes o suficiente para realizar capeamento pulpar direto sem dificuldades^{técnicas6-10}. Esses modelos animais são alternativas ideais aos estudos em humanos para examinar as respostas pulpares e a formação reparadora de dentina. No entanto, sua utilização é limitada a estudos observacionais no nível celular e dificilmente fornecem insights mecanicistas durante a formação reparadora da dentina no nível molecular.

Avanços técnicos recentes na engenharia genética forneceram ferramentas de pesquisa inestimáveis e indispensáveis - camundongos que abrigam um gene que é superexpresso ou excluído - que são fundamentais para estudar mecanismos moleculares de doenças humanas in vivo. O número de diferentes cepas de camundongos transgênicos ou knockout que são estrategicamente induzíveis de maneira específica para células está crescendo continuamente na comunidade científica. Portanto, examinar a cicatrização de feridas pulpares e a regeneração reparadora da dentina nesses camundongos ajudaria muito a acelerar nossa compreensão desses processos em nível molecular. No entanto, o uso de camundongos é significativamente atenuado, pois realizar um procedimento de capeamento pulpar em um dente de camundongo é tecnicamente desafiador devido ao seu tamanho em miniatura. Aqui, apresentamos nosso método reprodutível de realizar capeamento pulpar direto em camundongos para a avaliação da cicatrização de feridas pulpares e formação reparadora de dentina in vivo.

Protocol

Os ratos foram adquiridos de Jackson Laboratory e mantidos em um viveiro livre de patógenos na Divisão UCLA de Medicina Laboratorial Animal (DLAM). Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais aprovados pela Comissão de Pesquisa com Animais da chanceler (ARC # 2016-037).

1. Rato anesthetization

1. Use feminino camundongos C57 / BL6 de oito semanas de idade (n = 3).
2. Anestesiar os ratos usando cetamina (80-120 mg / kg de peso de rato) / xilazina soluções (5 mg / kg de peso de rato) e administrar por via intraperitoneal (ip) a uma dose de 10 ml / kg.
3. Preparar cetamina (80-120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluções e administrá-los por via intraperitoneal (ip) a uma dose de 10 ml / kg.
4. Confirmar que os ratos são anestesiados completamente através da realização de um aperto do dedo do pé.

2. Procedimento-capeamento pulpar

1. Coloque o suporte da boca na boca do mouse.
2. Fixar o suporte da boca sobre a mesa de tal modo que a eleanúncio é voltado para cima.
3. Coloque o microscópio (10X) em cima da boca de modo que o primeiro molar superior é totalmente visível.
4. Usando a ¼-round broca em uma caneta de alta rotação em 200.000 rpm, remover a parte do esmalte do dente no meio até que a polpa é visível através da dentina transparente. Não expor a polpa com a broca.
5. Usando um K-lima endodôntica # 15 (diâmetro de 150 mm), perfuram a dentina e expor a polpa.
   NOTA: Cuidados especiais devem ser tomados para que os detritos dentina não se empurrado para dentro da polpa. Isto pode ser evitado através da rotação do ficheiro-K trimestral e, em seguida, puxando o K-arquivo para fora.
6. Misture MTA com H ₂ O esterilizada de acordo com as instruções do fabricante. Entregar e colocar o MTA sobre a polpa exposta com a ponta do explorador. Use o lado de trás do papel ponto (fino) para embalar o MTA na polpa exposta, agitando ligeiramente. O lado mais grosso do ponto de trabalho é plana e, portanto, permitepara a condensação apropriada do MTA na polpa exposta.
7. Etch o dente por 15 s, colocando o etchant ácido fosfórico 35% em que apenas cobre o dente. Tome especial cuidado para limitar a colocação do produto corrosivo, uma vez que pode irritar os tecidos gengivais.
   NOTA: O produto corrosivo vem em uma seringa e é usado para irritar as superfícies dos dentes de modo que os adesivos dentários podem fluir em para mediar a ligação de micromecânica para o dente. Porque eles são viscoso, que pode ser auto-suficiente pela aplicação de pequenas quantidades directamente no dente.
8. Use sucção negativa pressionados para remover o produto corrosivo. Utilize uma bolinha de algodão que é levemente embebido com H ₂ O para remover os resíduos do decapante. Repetir esta etapa até que o agente condicionador é completamente removido do dente.
9. Usando um espanador de ar comprimido, secar suavemente o dente.
10. Aplicar os adesivos dentárias utilizando a parte de trás do ponto de papel.
11. Faça a camada adesiva fina com ar comprimido por 3 s.
12. Cure os adesivos dentais durante 20 s utilizando a unidade de cura luz.
13. Colocar o composta fluida em pequenas quantidades para o dente que foi tampado com MTA. Use a ponta do explorador a fluir o compósito nas ranhuras de dentes.
14. Curar o composto por 30 s utilizando um aparelho fotopolimerizador para polimerizar-lo. Confirmar que o composto está totalmente curado e dura usando o explorador.

3. Post-op Cuidados

1. Administrar carprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea (SC), imediatamente após o processo de nivelamento de celulose.
2. Coloque os ratos sobre uma almofada de aquecimento em baixa potência para manter os animais quente antes de acordar.
3. Devolver os ratos para o biotério para a habitação.

Procurement 4. Tissue

1. Depois de 5 - 6 semanas, sacrificar os ratinhos por deslocamento cervical, sob uma condição de anestesia completa com isoflurano.
2. Remova cuidadosamente a maxila para fora da base do crânio e colocá-lo em um tubo de 50 ml. Fixar o entire maxila que contém tanto o dente cobertas de celulose e o dente destapado contralateral em 4% de paraformaldeído em PBS, pH 7,4, a 4 ° C durante a noite, e em seguida armazená-lo em uma solução de etanol a 70%.
   NOTA: O paraformaldeído é tóxico e cancerígeno. O uso paraformaldeído adequada devem ser monitorados, conforme descrito nos procedimentos operacionais padrão (SOP).
3. Digitalizar o maxillae mouse usando a digitalização μCT. Para garantir a maxila durante a digitalização, enrole as amostras com gaze embebida com 70% de etanol e colocá-los no tubo de cultura de células de 15 mL.

5. μCT Scanning

1. Preparar as amostras para digitalização μCT. Resumidamente, enrole as amostras com gaze embebida com 70% de etanol e fixá-los em um tubo cônico de cultura de células genérico de 15 mL. Montar o tubo sobre a plataforma de varrimento μCT, conforme descrito nas instruções do fabricante.
2. Definir a fonte de raios-X para uma corrente de 145 mA, uma tensão de 55 kVp, e um tempo de exposição de 200 ms.
3. Realizar a aquisição de imagens com o scanner μCT com uma resolução de 20 um e com um filtro de Al de 0,5 mm.
4. Reconstruir a imagem e visualizá-lo ^11.
5. Uma vez que o varrimento está completo μCT, iniciar a descalcificação com EDTA a 5% e 4% de sacarose em PBS (pH 7,4) durante 2 semanas.

6. Processamento de tecido e da coloração

1. Incorporar os tecidos descalcificados em parafina. Antes de embutir, a guarnição da maxila, fazendo um corte sagital imediatamente anterior ao primeiro molar. Enquanto a incorporação, a posição desta superfície para baixo, de tal modo que a secção longitudinal do primeiro molar é a superfície de corte.
2. Usando o micrótomo, preparar 5 slides mm de espessura. As áreas de capeamento polpa geralmente coincidem com a raiz distopalatal (DP), o qual pode ser utilizado como um ponto de referência. Determinar a área exacta de interesse examinando a histologia sob o microscópio de luz e comparar as imagens μCT.
3. Para H & E coloração, Deparaffinize e hidratar as lâminas com xileno (2 x) e etanol diluídos em série (100% de EtOH 2x, EtOH a 95% 2x e 70% de EtOH 1x).
4. Lavar as lâminas com água corrente da torneira.
5. Mancha com uma solução de hematoxilina de 2,5 minutos e enxaguar com água da torneira.
6. Mergulhar as lâminas em etanol a 95% durante 1 min.
7. Mancha com uma solução Eosina durante 1 minuto e enxágüe com água da torneira.
8. Desidratar com etanol diluído em série (EtOH a 70% 1x, 95% 2x de EtOH, e 100% de EtOH 3x) e xileno (3x).
9. Montar as lâminas com solução de montagem.

Results

Aqui, nós mostramos os procedimentos passo-a-passo para realizar pulpar direta em ratos dentes. Um dos aspectos-chave de proteção pulpar direta em ratos é ter o aparelho apropriado. A este respeito, tendo o microscópio com uma ampliação de 10X de energia é essencial (Figura 1A). Para criar uma preparação Class-I-like no dente, usamos uma rebarba de ¼ de volta em uma alta rotação elétrica em 200.000 rpm (Figura 1B). Em alternativa, quaisquer outros motore...

Discussion

Atualmente, existem vários modelos experimentais disponíveis para validar os efeitos in vivo de materiais dentários, andaimes, ou fatores de crescimento sobre a diferenciação odontogênico de células-tronco da polpa dentária (DPSC) ^13. Estes modelos incluem o transplante autólogo de ectópica DPSC em um órgão, tal como a cápsula renal, ou a transplantação subcutânea de DPSC em ratinhos imunocomprometidos com andaimes ^14,15. No entanto, estes métodos estão limitados no que o seu efeito sobre ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio estéreo BM-LED	MEIJI Techno		Microscope
Optima MCX-LED	Bien Air Dental	1700588-001	Motor de motor eclético
isoflurano	Henry schein saúde animal	NDC 11695-0500-2
1/4 broca redonda	Brasseler	001092T0
Endodôntico K-file	Roydent	98947
ProRoot MTA	Dentsply	PROROOT5W	MTA
Ponto de papel	Henry schein	100-3941
Ultra-Etch	Ultradent product Inc.		Ácido fosfórico
OptiBond SoloPlus	Kerr	29669	Adesivos
Coltolux LED	Coltene/whaledent Inc.	C7970100115	Unidade de luz de cura
Caracterização matiz	Bisco	T-14012	Composto fluido
Skyscan	Breuker	1275	uCT scanner
Microm	Thermo	HM355S	Micrótomo
Hematoxilina-1	Thermo Scientific	7221
Eosin-Y	Thermo Scientific	7111
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-16	Solução de montagem