Artigo de método

Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

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DOI:

10.3791/54974

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12 de abril de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Division Heart and Lungs, University Medical Center Utrecht, 2MIRA Institute, University Twente

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um novo método para a comparação 3D do tecido do miocárdio todo-coração com a RM. Este é concebido para a avaliação precisa de injecções intramiocárdicos na zona de fronteira do enfarte de um modelo suíno crónica de enfarte do miocárdio.

Resumo

terapias regenerativas cardíacos visam proteger e reparar o coração ferido em pacientes com doença isquêmica do coração. Por injecção de células estaminais ou outros produtos biológicos que aumentam a angio- ou vasculogénese para a zona de fronteira do enfarte (IBZ), a perfusão de tecido é melhorada, e o miocárdio pode ser protegido de danos adicionais. Para efeito terapêutico máximo, é a hipótese de que a substância regenerativa é melhor entregue ao IBZ. Isso requer injeções precisas e levou ao desenvolvimento de novas técnicas de injeção. Para validar estas novas técnicas, criamos um protocolo de validação com base na análise de tecido do miocárdio. Este protocolo inclui o processamento do tecido do miocárdio do coração de todo-que permite detalhada bidimensional (2D) e análise tridimensional (3D) da anatomia cardíaca e injecções intramiocárdicos. Em um porco, enfarte do miocárdio foi criado por uma 90-min a oclusão da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária. Quatro semanas mais tarde, um mixture de um hidrogel com partículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIOs) e esferas fluorescentes foi injectado no IBZ usando uma abordagem minimamente invasiva endocárdico. 1 h após o procedimento de injecção, o porco foi sujeito a eutanásia, e o coração foi excisado e embebidas em agarose (agar). Depois da solidificação do agar, foram realizadas de imagiologia por ressonância magnética (IRM), o corte do coração, e imagens de fluorescência. Depois de pós-processamento, análise 3D foi realizada para avaliar a precisão da focalização IBZ. Este protocolo fornece um método estruturado e reprodutível de avaliação da precisão de segmentação de injecções intramiocárdicos no IBZ. O protocolo pode ser facilmente utilizado, quando o processamento do tecido cicatricial e / ou de validação da precisão injecção de todo o coração é desejada.

Introdução

Doença cardíaca isquêmica tem sido a principal causa de morte no mundo nas últimas décadas 1. O tratamento agudo após enfarte do miocárdio tem como objectivo restaurar o fluxo sanguíneo ao miocárdio através de intervenção coronária percutânea ou enxerto de bypass da artéria coronária. Em infartos graves, uma grande área do miocárdio está cicatrizada, e nestes casos, muitas vezes resultar em insuficiência cardíaca isquêmica (IC) 2. opções de tratamento atuais para foco HF na prevenção e na preservação da função cardíaca dos pacientes com IC, mas não sobre a regeneração.

Na última década, terapias regenerativas cardíacos têm sido investigados como uma opção de tratamento para HF 3. Esta terapia tem como objectivo entregar produtos biológicos, tais como células estaminais ou factores de crescimento, directamente para o miocárdio lesionado para induzir revascularização, protecção de cardiomiócitos, a diferenciação, o crescimento e 4. para um óptimoefeito terapêutico, se a hipótese de que a biológica deve ser injectado na zona de fronteira do enfarte (IBZ) para facilitar uma boa perfusão de tecidos para a sobrevivência da biológica e para um efeito óptimo para a zona alvo 5, 6. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para realizar a identificação e visualização do IBZ para guiar injecções intramiocárdicos 7, 8, 9, 10, 11. Além identificação e visualização do IBZ, a entrega também depende dos biomateriais e cateteres de injecção utilizados. Para validar a precisão injecção das técnicas de entrega, um método de quantificação precisas e reprodutíveis é necessária.

Nós desenvolvemos um protocolo para todo o coração de processamento de tecido do miocárdio que oferece bidimensional (2D) e três dimensional de imagem (3D), o qual pode ser usado para o estudo qualitativo e quantitativo visa. O protocolo abrange o processo de incorporação e da análise de imagem digital. Neste trabalho, nós demonstramos um protocolo para a avaliação da exactidão segmentação de injecções intramiocárdicos na IBZ em um grande modelo porcino de enfarte do miocárdio crónicas.

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Protocolo

A experiência in vivo foi conduzida de acordo com o Guia para o Cuidado e Utilização de Animais de Laboratório preparado pelo Institute of Laboratory Animal Research. O experimento foi aprovado pela Comissão de Experimentação Animal local.

1. Preparação de injectáveis ​​e incorporação Solução

  1. Prepara-se o gel injectável.
    1. Preparar 1 mL de ureído-pirimidinona gel (UPy) de acordo com protocolos anteriormente descritos 12, 13.
    2. Adicionar partículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIOs) à solução para obter uma concentração de 15 ug / mL e agita-se a mistura durante 5 min para distribuição uniforme.
    3. Adicionar as microesferas fluorescentes à solução para obter uma concentração de 10.000 contas / ml e agita-se a mistura durante 5 min para distribuição uniforme.
    4. Armazenar a mistura resultante à temperatura ambiente em um ambiente escuro. Quente e vortex ou agitação tele solução pouco antes do procedimento de injeção.
  2. Preparar a solução de embebimento.
    1. Comece com água da torneira à temperatura ambiente e adiciona-agarose (agar) a uma concentração de 4% em peso.
    2. Lentamente aquecer a solução para o ponto de ebulição usando um forno de microondas e mexa com freqüência durante o aquecimento. Ao atingir o ponto de ebulição, armazenar e manter a solução de agar superior a 70 ° C durante 2 h para permitir que o ar preso para a superfície.
    3. Permitir que a agar de arrefecer à temperatura ambiente, a uma temperatura entre 50 e 60 ° C até ao momento da incorporação.

2. Injeção Procedimento

  1. Realizar uma pré-medicação (agentes anti-arrítmicos, a terapia anti-plaquetas, e medicação para a dor), anestesia, o acesso venoso, e intubação, tal como previamente descrito 14.
  2. Realizar injecções, usando um cateter de injeco intramiocardial (Tabela de Materiais). Para cada injecção, 0.2 ml da mistura é injectada em um bólus a uma velocidade constante de cerca de 0,3 mL / min, utilizando um dispositivo de injecção. Coloque as injecções em diferentes posições ao longo da IBZ 12.
  3. Administrar 0,2 ml / kg (1,0 mmol / mL) de uma base de gadolínio-agente de contraste de 15 min antes da eutanásia do animal.
  4. Administrar 20 mL de cloreto de potássio a 7,5% por via intravenosa, para eutanásia do animal.
  5. Acesso seguro mediastino seguinte protocolo passos 8,2-8,3, tal como descrito por Koudstaal et al. 14. Cortar a veia cava inferior a 5 cm da aurícula direita e remover efusão de sangue com um dispositivo de sucção. Excisar o coração e lave-o com 0,9% de soro fisiológico à temperatura ambiente.

3. Embedding Procedimento

  1. Prepare o coração.
    1. Remover o pericárdio do coração, mantendo os átrios e ventrículos intacta. Dissecar a aorta ascendente ± 1 cm acima da válvula aórtica utilizando Klinkenbergtesouras. Cortar a veia cava inferior ± 1 cm desde o átrio, e fazer o mesmo para as veias pulmonares.
    2. Suturar o vértice do coração para o fundo de um recipiente de plástico incorporando (17 x 15 x 15 cm, W x D x H), utilizando um fio de sutura 2-0 para evitar a flutuação do coração durante a incorporação (Figura 1A).
    3. Suturar a parte restante da aorta aos aros do recipiente usando 2-0, certificando-se de que o coração está centrado e não tocar as paredes do recipiente (Figura 1B).

figure-protocol-1
Figura 1: Vista geral esquemática e fotografia da incorporação de recipiente. (A) vista geral esquemática do processo de embebimento. O coração (vermelho) é fixado no recipiente (azul) utilizando suturas. Após o enchimento do coração com a solução de agar, o espaço em torno do coração está cheio. Finalmente,dois tubos de plástico rígida (amarelo) estão posicionados no recipiente, ao lado de, mas não tocando o coração, para servir como uma referência durante o registo de imagens. (B) fotografia de um coração fixado no recipiente de incorporação. As suturas são presas até a borda do recipiente utilizando grampos de mosquito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Incorporar o coração em uma geometria diastólica final-like.
    NOTA: A prevenção da criação de bolhas de ar é necessária. Se grandes bolhas de ar presentes na solução de agar, manter o agar a 40 ° C, permitindo que as bolhas de ar à superfície.
    1. Prender o cava inferior veia usando braçadeiras de mosquito. Lentamente injectar o líquido de agar utilizando uma seringa de 50 ml no átrio direito, através da veia cava superior, até que tanto a aurícula e o ventrículo direito são completamente preenchido.
    2. Fixar as veias pulmonares usando MosquitO grampos. Suavemente passar uma seringa cheia de agar-50-mL retrogradamente através das válvulas aórticas. Lentamente, injectar a solução no ventrículo esquerdo (VE) até que o LV e o átrio esquerdo está completamente cheia. Após o enchimento do VE, prender a aorta para manter o agar no VE.
    3. Verter a ágar remanescente para dentro do recipiente até que o coração está totalmente coberta. Colocar dois tubos de plástico rígido no interior do recipiente incorporando a servir como estruturas de referência para o registo de imagem mais tarde (Figura 1A). Certifique-se os tubos não toque nas paredes do recipiente ou o coração.
    4. Deixar o agar solidificar a 2-7 ° C.

4. Aquisição de Imagem

  1. Execute transversais ex vivo exames de ressonância magnética do coração que está incorporado no recipiente.
    1. Colocar o recipiente com o coração encaixado no interior de uma bobina de cabeça (Tabela de Materiais).
    2. Angulate as fatias paralelas ao fundo do recipiente. Usara mesma orientação e angulação em cada sequência ex vivo de ressonância magnética.
    3. Para visualizar miocárdio, executar uma recuperação inversa atenuada-fluido sequência (DOM) com os seguintes parâmetros: tempo de repetição [TR] / tempo de eco [TE] = 10 s / 140 ms, ângulo aleta = 90 °, o tamanho de pixel = 0,5 x 0,5 mm, campo de visão [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 da matriz, e a espessura do corte de 3 mm.
    4. Para visualizar o enfarte do miocárdio, realizar um fim de gadolínio sequência (LGE) com os seguintes parâmetros: [TR] / [TE] = 5,53 ms / 1,69 ms, ângulo aleta = 25 °, o tamanho de pixel = 1,0 x 1,0 mm, [ FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 da matriz, e de 3 mm de espessura de corte.
    5. Para visualizar SPIOs, executar um gradiente ponderadas em T2 * sequência de eco com os seguintes parâmetros: [TR] / [TE] = 88,7 ms / 15 EA igualmente distribuídos com uma gama de 1,9 - 24,6 ms, ângulo aleta = 15 °, de pixel tamanho = 0,5 x 0,5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 da matriz, e de 3 mm de espessura de corte.
  2. proces tecidocantar
    1. Fazer rodar o recipiente de cabeça para baixo e permitir que o ar entre o agar e os lados do recipiente para remover a solução de agar sólido, incluindo o coração, a partir do recipiente. Retirar as hastes de plástico a partir do agar sólido.
    2. Secção do bloco de agar contendo o coração em fatias de 5 mm a partir do vértice para a base do coração utilizando um cortador de carne. Manter a angulação das fatias cortadas da mesma forma que nas imagens de RM adquiridos por corte paralelo à parte inferior do bloco de agar.
    3. Manchar as fatias de agar (incluindo o coração) durante 15 min em 1% em peso de 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) dissolvido em 0,9% de solução salina a 37 ° C, e fotografar as fatias de ambos os lados a partir de uma vista perpendicular (Figura 2A). Em seguida, lavar cuidadosamente as fatias em 0,9% de soro fisiológico.
      NOTA: Neste estudo, foi utilizada uma configuração de DSLR com uma lente / objetivo for o caso, um tripé e iluminação uniforme. No entanto, as fotografias só serviu como um controle para a avaliação da região da cicatriz,portanto, poderíamos ter usado uma configuração diferente.
  3. imagens de fluorescência
    NOTA: Dependendo das excitação e emissão de comprimentos de onda das microesferas fluorescentes, seleccionar os blocos de filtro e de excitação lasers apropriados (por exemplo, as microesferas vermelhos usados aqui têm excitação e emissão de comprimentos de onda de 580 nm e 605 nm, respectivamente e, portanto, o laser de excitação seleccionado e filtros de banda de passagem foram ajustados para 532 nm, 580/30 nm e 610/30 nm, respectivamente).
    1. Selecionar imagens em modo de fluorescência no scanner de modo variável. Definir o tubo fotomultiplicador para 430 V ou equivalente e o tamanho do pixel de 100 x 100 mm. Selecione um laser de excitação (532 nm) mais próximo ao comprimento de onda de excitação das microesferas fluorescentes.
    2. Para o primeiro bloco de filtragem, selecionar um filtro passa-banda (nm 580/30) que se sobrepõe com o comprimento de onda de emissão de fluorescência das esferas injectados (canal 1). Seleccionar um filtro passa-banda para o segundo bloco de filtro (610/30) do lado de fora da ecomprimento de onda missão (canal 2).
      NOTA: O segundo bloco de filtro serve como um controlo negativo e para remover auto-fluorescência, mantendo os locais de injecção intacta.
    3. Digitalizar ambos os lados das fatias de agar no modo de fluorescência do scanner a laser de modo variável usando os dois canais. Certifique-se de que cada fatia é completamente digitalizado, incluindo os furos de referência.

5. Pós-processamento

NOTA: O primeiro passo para pós-processamento é a segmentação manual do miocárdio usando scripts in-house desenvolvidos para traçar a endo e fronteiras do epicárdio, bem como os locais de injecção. Este é o mesmo para ambos ressonância magnética e exames de fluorescência.

  1. Segmento do miocárdio nos exames de ressonância magnética.
    1. Segmento do endocárdio e LV borders epicárdio nas imagens da sequência FLAIR ressonância magnética.
    2. Copiar a segmentação LV do passo 5.1.1 ao conjunto de dados LGE-MRI e segmento a cicatriz na sequência LGE MRI.
    3. Copie a segmentação do miocárdio do passo 5.1.1 do T2 * conjunto de dados ponderadas e segmento dos depoimentos SPIO no miocárdio LV.
  2. Processar as imagens de fluorescência e realizar segmentações.
    1. Carregar os arquivos obtidos a partir do scanner de modo variável e fazer uma imagem separada de cada fatia coração transversal.
    2. Virar as fatias que foram digitalizados em base para o ápice orientação e classificar as imagens de fluorescência para uma pilha para ambos os canais que é orientada a partir do vértice para a base.
    3. Segmento do endocárdio e LV borders epicárdio nas imagens de fluorescência.
    4. Segmento da cicatriz manualmente nas imagens de fluorescência e utilizar a LGE-exame de ressonância magnética e as fotografias para confirmar a morfologia da cicatriz.
    5. Subtrair a pilha de imagens do canal 2 a partir da pilha de imagem de um canal de excluir auto-fluorescência. segmento manualmente os depoimentos e microbead fluorescentes usar o T2 * imagens para confirmação.
  3. Para criaruma geometria 3D-anatomicamente correcto, executar um registo rígida das fatias na pilha de imagem com base nas estruturas de referência (os furos criados pelos tubos rígidos). Calcular e armazenar a tradução aplicada e rotação de cada imagem.
  4. Aplicar as transformações armazenados para as pilhas de imagens e as segmentações. Linearmente interpolar os segmentações de ambos os lados das fatias para reconstruir a espessura da fatia original e para criar um modelo 3D dos dados.

6. Análise

  1. Realizar medições 2D e / ou 3D da distância entre os centros dos locais de injecção e do IBZ para avaliar a precisão da injeção. Medir a distância ao longo da fronteira endocárdica da segmentação LV. Na Figura 2C e 2F, um exemplo das medições de 2D e 3D é indicado pela linha vermelha.

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Resultados

Embedding Tissue

Através do processo de incorporação, uma geometria diastólica final semelhante foi estabelecido. O ágar aderido com sucesso ao tecido do coração, permitindo que o tecido a ser cortado no desejado angulação com espessuras iguais (Figura 2A e 2C).

Avaliação Scar- e no local da injecção

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Discussão

Total de coração de processamento de tecido do miocárdio 3D de acordo com este protocolo proporciona um método estruturado que permite a análise 3D do enfarte, o IBZ, e as injecções realizadas com respeito à anatomia cardíaca. O volume de enchimento do coração depende da análise desejada. Neste estudo, para avaliar a precisão da injeção, que teve como objetivo preencher o coração para assemelhar-se a geometria diastólica final, tanto quanto possível. Para aplicar este, o apex LV é fixado ao fundo do recipiente e a VE é ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer Marlijn Jansen, Joyce Visser, e Martijn van Nieuwburg por sua assistência com as experiências com animais. Nós reconhecemos muito Martijn Froeling e Anke Wassink por sua assistência com a imagem de ressonância magnética.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,9% SalinoBraun
AgaroseRoche DiagnosticsÁgar multipropósito de grau científico
Scanner de fluorescência biomolecular Typhoon 9410 GE Healthcare Recipiente
de embutirPlástico, dimensões 17 x 14,5 x 14 cm
Microesferas de Poliestireno FluoSpheresInvitrogenF8834vermelho, 10 µ m
GadolínioGadovist1.0 mmol / mL
dS 32 canais bobina de cabeçaPhilipsOu similar
MatlabMathworksPara garantir a compatibilidade 2015a ou mais recente
Cortador de carneBerkel
Myostar cateter de injeçãoBiosense Webster
Super partículas de óxido de ferro paramagnéticasSinerem
Cloreto de trifenil-tetrazólioMerck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0Ethicon

Referências

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