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Artigo de método

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

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DOI:

10.3791/54980

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27 de dezembro de 2016

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1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação de eventos de sinalização intracelular induzidos em células viáveis por interação física com células mortas ou moribundas adjacentes. O protocolo se concentra em eventos de sinalização induzidos pelo reconhecimento mediado por receptor das células mortas, em oposição à sua captação fagocítica ou liberação de mediadores solúveis.

Resumo

As células morrem por apoptose, também conhecida como morte celular regulada, adquirir várias novas actividades que lhes permitam influenciar a função de células vivas adjacentes. actividades vitais, tais como a sobrevivência, a proliferação, crescimento e diferenciação, estão entre as muitas funções celulares modulados por células apoptóticas. A capacidade para reconhecer e responder às células apoptóticas parece ser uma característica universal de todas as células, independentemente da linhagem ou órgão de origem. No entanto, a diversidade e complexidade da resposta às células mandatos apoptóticos que grande cuidado em dissecar os eventos de sinalização e vias responsáveis ​​por qualquer resultado particular. Em particular, deve-se distinguir entre os vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas podem influenciar as vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis, incluindo: o reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, libertação de mediadores solúveis pela célula apoptótica, e / ou acoplamento da phagomáquinas cytic. Aqui, nós fornecemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular que são induzidas nas células respondedoras viáveis ​​após a sua exposição a células apoptóticas. Uma grande vantagem do protocolo encontra-se em atenção o que compensa a dissecção do mecanismo pelo qual as células apoptóticas modulam eventos de sinalização dentro de células que respondem. Enquanto que o protocolo é específico para uma linha imortalizada condicionalmente rato renal proximal tubular de células (células BU.MPT), é facilmente adaptado para linhas de células que são não-epitelial de origem e / ou derivado a partir de outras do que o rim órgãos. A utilização de células mortas, como um estímulo introduz vários factores exclusivos, que podem dificultar a detecção de eventos de sinalização intracelular. Estes problemas, bem como estratégias para minimizar ou contorná-los, são discutidas no âmbito do protocolo. A aplicação deste protocolo deve ajudar o nosso conhecimento expansão da ampla influência que as células mortas ou a morrer exercem sobre os seus vizinhos vivos, tanto na saúde como na diseaSE.

Introdução

Apoptose, ou morte celular regulada 1, contribui de forma essencial para a manutenção e desenvolvimento de tecidos. Vistos os mais simples, as licenças de apoptose envelhecido, danificado ou excesso de células de ser eliminados sem danos a tecidos circundantes 2,3. A contribuição de apoptose para a homeostase dos tecidos, no entanto, é consideravelmente mais dinâmico e variado. As células morrem por apoptose adquirir várias novas actividades, tanto secretada e associada à célula, o que lhes permite influenciar a função de células vivas adjacentes 4-10. Estudos anteriores voltadas para a capacidade das células apoptóticas para suprimir a inflamação 11-16, mas as células apoptóticas também modular uma ampla gama de funções celulares, incluindo actividades vitais tais como a sobrevivência 4,9,10, 4,9,10 proliferação, diferenciação 17, migração de 18 anos, e crescimento de 19. Além disso, estes efeitos não são restritas para os fagócitos profissionais, como macrófagoss, mas se estendem a praticamente todos os tipos de células e linhagens de células, incluindo tradicionalmente não fagocíticas, tais como células epiteliais e endoteliais 7,9,10,18-21.

A resposta específica de células vivas adjacentes após a exposição a células apoptóticas depende de vários factores que se relacionam com as células que respondem tanto viáveis ​​e as próprias células apoptóticas. Por exemplo, embora a exposição a células apoptóticas inibe a proliferação de ambas as macrófagos murinos e as células epiteliais tubulares proximais renais (PTECs), estes dois tipos de células diferem dramaticamente na sua resposta de sobrevivência de células apoptóticas 4,6,9,10. Células em apoptose promover a sobrevivência de macrófagos, mas induzir a morte apoptótica de PTECs 4,6,9,10. Notavelmente, a resposta de células apoptóticas podem variar mesmo entre células que respondem da mesma linhagem, dependendo do órgão da célula responder de origem 10 (por exemplo, nos rins contra PTECs epitelial mamáriacélulas) ou do estado de activação 22 (por exemplo, os neutrófilos). Por outro lado, as células apoptóticas podem evocar respostas diferentes na mesma célula, dependendo da natureza do estímulo 10,23 apoptótica ou a fase de apoptose 10,14.

Tendo em conta a diversidade e a complexidade da resposta de células apoptóticas, muito cuidado deve ser tomado em dissecar os eventos de sinalização e responsáveis ​​para vias qualquer resultado particular. Em primeiro lugar, as respostas que requerem interação física direta entre células viáveis e apoptóticos devem ser diferenciados daqueles provocada por mediadores solúveis liberados ou geradas pelo celular por apoptose 3,6-10. Se é necessária a interacção física, em seguida, uma maior diferenciação deverá ser executado. eventos de sinalização pode depender de reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, independente de imersão subsequente, ou na captação de fagocitária, independente do receptor específico que se liga a célula apoptótica 3-7,9,10,19. No último caso, a resposta não é específico para células apoptóticas, e pode ser desencadeada por qualquer material fagocítica 4,6.

A importância destas diferenças pode novamente ser apreciado por contraste as respostas de macrófagos e PTECs renais. Para ambos os tipos de células, a exposição a células apoptóticas altera a actividade da pró-sobrevivência quinase Akt. A modulação é dependente da interacção física, uma vez que a separação de células apoptóticas e de responder de uma membrana de policarbonato de 0,4 um suprime a resposta 4,9,10,19. No entanto, a resposta de PTECs é mediada pelo receptor e independente de fagocitose, enquanto que a resposta de macrófagos é impulsionado por fagocitose 4,9,10,19. Esta conclusão é reforçada pelo facto de a exposição a esferas de látex, um estímulo neutro fagocitária, não tem nenhum efeito sobre a actividade de Akt em PTECs, mas imita o efeito de células apoptóticas em macrófagos 4,9.

"> Embora menos bem estudadas, as células morrem por necrose ou morte acidental de células 1, também modulam a função de células viáveis nas proximidades 3-10,19. Tal como as células apoptóticas, células necróticas exercem os seus efeitos através de uma variedade de mecanismos, nomeadamente a fuga de conteúdo intracelular através da sua membrana celular rompido 3,5,6,9,24. Muitas células, incluindo PTECs e macrófagos, possuem receptores não concorrentes distintos para as células a morrer por necrose 5,9. Engagement desses receptores induz eventos de sinalização que são muitas vezes oposta às induzidas por acoplamento dos receptores de células apoptóticas 4-10,19. por exemplo, em PTECs, células necróticas aumentar a fosforilação da Akt, enquanto que as células apoptóticas diminuir a fosforilação 9,10,19.

Aqui, descrevemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular induzidos em PTECs rins viáveis ​​através do reconhecimento mediada pelo receptor de PTECs apoptóticos adjacentes 9,10,19. Enquanto que o protocolo é específico para uma linha de células imortalizadas condicionalmente PCTEE conhecidas como células BU.MPT 9,10,19,25,26, é facilmente adaptado para linhas de células que são não-epitelial de origem e / ou derivado a partir de outros órgãos o rim. Mais importante, a utilização de células apoptóticas, como um estímulo de células coloca certas dificuldades inerentes experimentais não apresentam ligandos solúveis. O mais importante destes é o de que as células apoptóticas deve ser adicionado como uma suspensão em vez de uma solução. Estas dificuldades, bem como estratégias para minimizar ou contorná-los, são discutidas no âmbito do protocolo. Quase todas as técnicas descritas no protocolo são simples e padrão de cultura de células. A vantagem deste protocolo reside na sua atenção para os vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas modulam a transdução de sinal dentro das células que respondem. Estes mecanismos incluem a ligação via determinantes da superfície ou ponte moléculas a receptores específicos na recelular pondente, a liberação de mediadores solúveis e / ou do envolvimento da máquina fagocítica. células necróticas estão incluídos em todas as experiências para assegurar que os resultados são específicos para o tipo de morte celular, e não uma resposta generalizada de células mortas. A abordagem cuidadosa, como recomendado neste protocolo, é fundamental para a nossa compreensão da influência cada vez maior de que as células morrem exercem sobre os seus vizinhos ao vivo, na saúde e na doença.

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Protocolo

1. Preparações

Nota: Neste protocolo, duas ou mais linhas celulares ou culturas de células primárias, estão independentemente preparado sob condições específicas. Estas preparações incluem células em apoptose (Protocolo 1), células necróticas (Protocolo 2), e células de resposta saudáveis ​​(Protocol 3). Após a preparação independente, as células apoptóticas ou necróticas são adicionados a células de resposta e a transdução de sinal resultante é monitorizada (Protocolos 4, 5 e 6).

  1. Prepare meio de cultura e reagentes
    1. Preparar 500 mL de meio de cultura (para utilização, quando o crescimento de células sob condições permissivas, ver secção 1.2), combinando o seguinte: 1x Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de glucose, 584 mg / L ʟ-glutamina, 110 mg / l de piruvato de sódio, 100 unidades / mL de penicilina-estreptomicina, 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS), e 10 unidades / mL de interferão-γ (IFN-γ).
    2. Preparar 500 ml de meio de cultura de B (para uso WHen células-fome de soro sob condições não permissivas, ver secção 1.2), omitindo de FBS e IFN-γ da receita do meio de cultura de A. Para cultivar células sob condições não permissivas (antes de soro-inanição), adicionar 10% v / v de FBS para meio de cultura de B.
    3. Prepare a 0,4% (v / v) de paraf ormaldeído, pH 7,2, em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x (DPBS) a partir de 4% de paraformaldeído estoque para a fixação de células mortas.
      Nota: O paraformaldeído é tóxico, e cautela apropriada deve ser exercido na sua utilização.
  2. células BU.MPT Cultura
    1. Descongele de azoto líquido de um frasco de células BU.MPT.
      Nota: BU.MPT é uma linha de ratinhos renal proximal tubular célula epitelial (PTEC) derivado de um ratinho transgénico tendo uma (TS) mutação sensível à temperatura (tsA58) do antigénio tumoral grande de SV40 (TAG) sob o controlo do rato grande complexo de histocompatibilidade (MHC) H-2K b classe I promotor 25,26.
    2. células da placa em polystyr estérileno plasma vácuo-gás tratados pratos de cultura de tecidos (~ 5 X 10 6 células por prato de 100 mm de diâmetro).
    3. Cultivar células sob condições permissivas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
      Nota: As condições permissivas, que são definidos como a cultura em 33-37 ° C na presença de IFN-γ, permitir uma expressão estável do transgene TAg tsA58-mutada. Ao contrário das culturas primárias de rim de rato, PCTEE que não sobrevivem mais do que uma única passagem ou duas, BU.MPT cultivadas sob condições permissivas podem ser passadas indefinidamente.
      1. células de passagem pelo menos três vezes após o descongelamento antes de usá-los em um experimento.
        1. Para as células de passagem, adicionar 1 ml de tripsina a 0,05% por placa de 100 mm, e incuba-se numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 a 37 ºC durante 5 min. Neutraliza-se a tripsina por adição de 10 mL de meio A. Aspirar as células isoladas, e divididas 1: 3 a 1: 5 em novas 100 mm de poliestireno estéril de plasma de vácuo-gás tratado TISSplacas de cultura de ue. Adicionar meio A para levar o volume até um total de 10 mL por placa de 100 mm.
    4. Em preparação para uso experimental como células que respondem, crescer as células até à confluência numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições não permissivas (isto é, a 39 ° C na ausência de IFN-γ [meio B, contendo 10% v / v de FBS]).
      Nota: Sob condições não permissivas, a expressão do transgene TAg-tsA58 mutado é inibida por> 95%, e células BU.MPT se comportam como culturas primárias de rim de rato PCTEE.

2. Preparação de células em apoptose BU.MPT (Protocolo 1)

Nota: Este protocolo é específico para células BU.MPT como fonte de células em apoptose, e estaurosporina como o método de indução de apoptose. Em alternativa, uma outra linha celular ou cultura celular primária, pode ser utilizada como uma fonte de células apoptóticas, com a apoptose induzida por Protoco padronizadoLS para esse tipo de célula particular e método de indução de apoptose.

  1. Após passagem para 100 mm de diâmetro de poliestireno estéril de plasma de vácuo-gás tratados pratos de cultura de tecidos, as células crescer até à confluência BU.MPT numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições permissivas (isto é, a 37 ° C em meio de cultura A na 10 ml por placa de 100 mm), conforme descrito no ponto 1.2.3.
  2. Lavar a monocamada de células aderentes três vezes com meio de cultura B, utilizando 10 mL por lavagem.
  3. Induzir a apoptose através da incubação das células em meio de cultura contendo estaurosporina B, um inibidor de proteína cinase não selectivos, a 1 ug / mL durante 3 horas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 a 37 ºC.
  4. Aspirar o meio contendo estaurosporina contendo "flutuante" células apoptóticas que têm destacadas a partir da monocamada. Centrifugar este meio durante 10 minutos a 500 xg, descartar o sobrenadante, o sedimento de lavar três vezes com meio de cultura B, eadicionar o sedimento volta a células recolhidas no passo seguinte, 2.5.
  5. Separe as células aderentes restantes passos de 2,3 e 2,4 por adição de 5 mM (ácido etilenodiaminotetracético) de EDTA em 1x Ca 2 + - + 2 e Mg livre de DPBS a 1 mL por placa durante 5 min. Aspirar o meio contendo EDTA contendo células apoptóticas destacadas, e reunir as células isoladas com os "flutuante" células apoptóticas do passo 2.4 em um tubo estéril de centrífuga de 15 mL de poliestireno.
  6. Lavam-se as células apoptóticas três vezes por centrifugação durante 10 min a 500 xg e re-suspensão em 10 mL de 1x de Ca + 2 - e Mg + 2 Livres de DPBS por lavagem.
  7. Após a última lavagem, suspender as células em apoptose em fresco meio de cultura B em ~ 5 x 10 6 células por ml antes do uso para estimular células de resposta. Em alternativa, fixar as células apoptóticas foram lavadas em 0,4% (v / v) de paraf ormaldeído em 1X DPBS durante 30 minutos e, em seguida lavar três vezes com culturameio B, antes da suspensão em meio de cultura B.
  8. Conforme apropriado, confirmar a indução da apoptose por citometria de fluxo utilizando uma preparação em separado de células apoptóticas (ou reservando algumas células para esta finalidade), como previamente descrito 6,9,10,15.
    Nota: as células iniciais apoptóticos têm membranas celulares intactas, e aparecem como iodeto de propídio (PI) células -negative e anexina V positiva de diminuição do tamanho da célula (em relação a células viáveis). Final de células em apoptose têm membranas celulares não intactos, e aparecem como células PI-positivas e anexina V positiva de diminuição do tamanho das células. Usando o protocolo atual, preparações típicas contêm ~ 85% de apoptose precoce e ~ 15% de células em apoptose final.
  9. Adicionar células apoptóticas de células de resposta BU.MPT (Protocolo 3) a uma razão apoptótica-a-respondedor de células de 1: 1, quer directamente, quer após a fixação de células apoptóticas durante 30 minutos com 0,4% (v / v) de paraf ormaldeído em 1X DPBS .
    Nota: fixação celular por apoptose antes da estimulação de respostas devenão afectam os resultados, a menos que os eventos de sinalização observados são devidos a libertação de um mediador solúvel (Tabela 1).

3. Preparação de células necróticas BU.MPT (protocolo 2)

Nota: Este protocolo é específico para células BU.MPT como fonte de células necróticas, e aquecimento como o método de indução de necrose. Em alternativa, uma outra linha celular ou cultura celular primária, pode ser utilizada como uma fonte de células necróticas, com necrose induzida por protocolos normalizados para esse tipo de célula particular e o processo de indução da necrose.

  1. Após passagem para 100 mm de diâmetro de poliestireno estéril de plasma de vácuo-gás tratados pratos de cultura de tecidos, as células crescer até à confluência BU.MPT numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições permissivas (isto é, a 37 ° C em meio de cultura A na 10 mL por prato), conforme descrito no ponto 1.2.3.
  2. Lavar a monocamada de células aderentes três vezes com meio de cultura B, usando10 mL por lavagem.
  3. Separe as células por adição de EDTA a 5 mM em 1x Ca + 2 - e Mg + 2 Livres de DPBS a 1 mL por placa durante 5 min. Aspirar o meio contendo EDTA contendo as células isoladas, e adicionar a suspensão de células para um tubo de poliestireno estéril de centrífuga de 15 mL.
  4. Lavam-se as células três vezes por centrifugação durante 10 min a 500 xg e re-suspensão em 10 mL de Ca + 2 - e Mg + 2 Livres de DPBS por lavagem.
  5. Após a última lavagem, suspender as células em meio de cultura fresco B a 5 x 10 ~ 6 células por mL.
  6. Induzir a necrose de células por aquecimento a 70 ºC durante 45 min num banho de água, suavemente vórtice da suspensão de células a cada 10 min.
  7. Incubar as células durante 2 horas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 a 37 ° C. Suavemente vortex a suspensão de células a cada 15 min.
  8. Conforme apropriado, confirmar a indução de necrose por citometria de fluxo utilizando uma preparação separada de necrotic células (ou reservando algumas células para esta finalidade), como anteriormente descrito 6,9,10,15.
    Nota: as células necróticas ter rompido as membranas celulares, e aparecem como células PI-positivas aumentou de tamanho de célula (em relação a células viáveis). Usando o protocolo atual, preparações típicas contêm ≥ 95% de células necróticas. Alternativamente, a indução da necrose e perda da integridade da membrana pode ser confirmada por coloração com azul de Tripano.

4. Preparação de células BU.MPT Responder (Protocol 3)

Nota: Este protocolo é específico para células BU.MPT como fonte de células de resposta. Em alternativa, uma outra linha celular ou cultura celular primária, podem ser utilizados como células de resposta. Antes da utilização experimental, quiescência durante a noite pode ser induzida por protocolos normalizados dentro do laboratório.

  1. Cultivar células BU.MPT em 100 mm pratos de cultura de tecidos estéreis sob condições permissivas em meio de cultura A a 10 mL por placa, até que consigam ~85% de confluência.
  2. cultura Aspirar meio de A, e lave as células três vezes com meio de cultura B em 10 mL por lavagem. Soro-privar as células durante a noite, durante 18 a 24 horas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições não permissivas (isto é, a 39 ° C em cultura de meio B a 10 ml por placa), tal como descrito na secção 1.2 0,4, de modo a induzir a quiescência. Alternativamente, crescer as células em meio de cultura B mais 10% (v / v) de FBS a 39 ºC durante um dia antes de as células de soro durante a noite em meio de fome cultura B sem FBS.
  3. Rotular um prato de cultura de tecidos em separado das células BU.MPT confluentes para cada condição experimental.
  4. Incluem os seis seguintes condições: a estimulação de respostas BU.MPT viáveis ​​com factor de veículo ou de crescimento epidérmico (EGF) durante 15 min, após a sua exposição durante 30 minutos para que, ou não, células apoptóticas, ou células necróticas.
    Nota: a exposição a células mortas podem estimular ou inibir o nível de actividade de um given molécula sinalizadora. A estimulação é melhor detectado acima de uma linha de base baixa (por exemplo, ausência de EGF), enquanto que a inibição é mais detectado a partir de uma linha de base elevada (por exemplo, a presença de EGF). Uma vez que o efeito de estimulação com células mortas é a priori desconhecido, recomenda-se realizar todos os estudos, tanto na ausência e na presença de EGF.

5. Estimulação de células de resposta com apoptose e células necróticas (Protocolo 4)

  1. Aspirar meio de cultura B, desde pratos pré-rotulados de repouso (privadas de soro) BU.MPT células de resposta (Protocolo 3).
    Nota: Após cultura durante a noite sob condições não permissivas, as células BU.MPT deve comportar-se como culturas primárias de rim de rato PCTEE.
  2. Por placa de 100 mm, adicione 2 mL de um dos seguintes procedimentos: meio de cultura B (sem células); suspensão de células apoptóticas em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 1); ou de suspensão celular por necrose em ~ 5 x 10 6 células por ml in meio de cultura B (protocolo 2).
    1. Distribuir a suspensão 2 mL de células mortas uniformemente sobre a placa de 100 mm e manter o tempo para que eles se depositam no mínimo. Para alcançar este objectivo, a distribuir gota de suspensão de células mortas a gota, com uma ampla pipeta de ponta ao longo de toda a superfície dos pratos de células de resposta. Utilizar um volume de 2 ml, tal como um compromisso entre a minimizar o tempo de estabilização e evitar a aglomeração de células mortas.
      Nota: O uso de uma suspensão de células mortas, como um estímulo implica um certo número de considerações especiais, que são descritos abaixo em maior detalhe (Tabela 2 e Discussão).
    2. Alcançar uma proporção de células mortas-a-respondedor de ~ 1: 1 por adição de 2 mL de células mortas em ~ 5 x 10 6 culas por ml para uma placa de 100 mm confluentes, que contém ~ 10 x 10 6 células. Alternativamente, a fim de estabelecer a dependência da dose de quaisquer eventos de sinalização observadas, variar a proporção de morte para células que respondem de forma contínua por diluição progressiva em cultoure meio B das suspensões de células mortas preparados nos protocolos nºs 1 e 2.
  3. Agite suavemente os pratos, em seguida, incuba-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
  4. Após 30 min, estimulam as células de resposta, quer com veículo ou 50 nM de EGF, de acordo com o pré-marcação do prato de cultura.
  5. Incubar durante 15 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
  6. Lave as células mortas pela adição de 5 mL de gelada 1x DPBS, agitando o prato, e aspirar o fluido da lavagem. Repita três vezes.
  7. Colocar imediatamente os pratos de células de resposta em gelo para posterior processamento.
  8. Prepare lisados ​​celulares
    1. Preparar tampão de lise celular contendo o seguinte: 1 × solução salina tamponada com Tris (TBS), pirofosfato de sódio 10 mM, 0,5% w / v de desoxicolato, 0,1% w / v de SDS, 10% glicerol, e 25 mM de fluoreto de sódio.
      1. Imediatamente antes da lise celular, adicione a seguinte na ordem exata dada na indconcentrações icated: Mini cocktail inibidor da protease livre de EDTA (1 comprimido por 10 mL de tampão de lise), 10% (v / v) de Triton X-100, ditiotreitol 1 mM (DTT), fluoreto de fenilmetanossulfonilo 1 mM (PMSF), e 10 mM ortovanadato de sódio.
    2. Adicionar 700 ul de tampão de lise de células gelada por placa de 100 mm de fresco estimuladas células respondedoras em gelo a partir do passo 5.7. Raspar as células com um raspador de células, e transferir o lisado para pré-refrigerada microtubos de 1,5 mL. Manter os tubos em gelo durante 15 min.
    3. Sonicar lisados ​​em gelo com 10 pulsos de 20 Hz, menos de um segundo cada de duração. Evitar a criação de espuma na interface gás / líquido, tal como este pode sobreaquecer as amostras. Totalmente mergulhe a sonda de ultra-sons para os microtubos contendo lisados ​​antes de ligar o sonicator, e alternar a sonicator antes de retirar a sonda a partir dos lisados.
    4. Centrifuga-se a 20000 xg durante 10 min a 4 ° C, transfere-se os sobrenadantes em microtubos pré-gelada fresca, E armazenar a -70 ºC.
    5. Efectuar a electroforese em gel e imunotransferência em sobrenadantes de lisados, como anteriormente descrito 6,9,10,15.

6. Prevenir o contato físico direto entre Metas e respondedores Usando um semipermeável Policarbonato Membrana (Protocolo 5)

  1. Prepare células de resposta BU.MPT de acordo com o Protocolo nº 3, com uma exceção; crescer as células em cultura de tecidos de poliestireno estéril tratada conjuntos de 12 poços.
  2. Em poços selecionados, coloque um sistema de suporte permeável contendo uma membrana de policarbonato de 0,4 mm para evitar a interação física entre as células mortas e de resposta. Incluem poços de controlo, sem uma membrana na mesma experiência.
  3. Aspirar meio de cultura B de poços experimentais de células BU.MPT de resposta privadas de soro.
  4. Seguir o protocolo 4 para a estimulação de células de resposta com células apoptóticas ou necróticas, com as seguintes modificações:
    1. Por poço da 1cluster de 2 bem, adicione 0,1 mL de um dos seguintes procedimentos: meio de cultura B (sem células); suspensão de células apoptóticas em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 1); ou suspensão celular necrótica em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 2).
      Observação: Como bem confluente de um cluster de 12 poços contém ~ 0,5 x 10 6 células, a adição de 0,1 mL de células mortas em ~ 5 x 10 6 culas por mL produz uma proporção mortos-a-respondedor celular de ~ 1: 1.
    2. Para poços que contêm o sistema de suporte permeável, adicionar as células mortas no topo da membrana de policarbonato de 0,4 um dentro do sistema de suporte permeável, de modo que não existe qualquer interacção física directa entre células mortas e respondedoras.

7. A inibição da fagocitose com citocalasina D (Protocolo 6)

  1. Prepare células de resposta BU.MPT de acordo com o Protocolo nº 3.
  2. Prepara-se o inibidor do citoesqueleto citocalasina D na dimethil sul f óxido (DMSO) a 4 mg / ml (1000 ×). Adicionar pratos de pré-marcados de células de resposta, quer BU.MPT 10 ul de veículo (DMSO) ou 10 mL de citocalasina D para alcançar uma concentração final de 4 ug / mL em 10 mL de meio de cultura B.
    Nota: A esta concentração de citocalasina D, a fagocitose por células BU.MPT e uma linha celular de macrófagos foi inibida por ≥90% 9,10.
  3. Incubar durante 2 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
  4. Siga o protocolo nº 4 para a estimulação de células de resposta com células apoptóticas ou necróticas.
  5. Conforme apropriado, confirmar a inibição da fagocitose de células mortas por citometria de fluxo utilizando uma preparação em separado de células mortas e as células de resposta (ou reservados para esta finalidade), como previamente descrito 9,10.

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Resultados

Na Figura 1, é proporcionado um diagrama esquemático que descreve as etapas de temporização e críticos envolvidos na preparação de células apoptóticas (Protocolo 1) e células necróticas (Protocolo 2) e a estimulação de células de resposta com suspensões de células apoptóticas e necróticas (Protocolo 4).

Na Figura 2, que fornecem resultados representativos que mostram o efeito de células apoptó...

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Discussão

Apresentamos aqui um protocolo para a caracterização dos acontecimentos de sinalização intracelular induzida em células viáveis ​​após a sua exposição a células que sofrem apoptose, ou outras formas de morte celular. O protocolo enfatiza os vários mecanismos pelos quais a exposição a células apoptóticas podem modulam vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis. Estes mecanismos incluem: a interacção (via ponte moléculas ou determinantes da superfície sobre a célula morta ou suas vesículas...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado, no todo ou em parte, por fundos institucionais do Dr. José A. Arruda e da Seção de Nefrologia da Universidade de Illinois em Chicago (para J. S. L.); e financiamento do Departamento de Medicina da Universidade McGill e do Instituto de Pesquisa do Centro de Saúde da Universidade McGill (para J. R.)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais de cultura de células
DMEM, 1x com [4,5 g/L] de glicose, ʟ-glutamina e piruvato de sódio-piruvatoMediatech (Manassas, VA)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, soro fetal bovinoGE Healthcare (Logan, UT)SH30066,03adicionar 10% (v/v)  ao meio de cultura A
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina, 100xLife Technologies (Grand Island, NY)10378-016adicionar 100 unidades/mL aos meios de cultura A e B
γ-Interferon, camundongo recombinante, de Escherichia coliCalbiochem, Millipore (Billerica, MA)407303adicionar 10 unidades/mL ao meio de cultura A
Placas tratadas com cultura de tecidos de poliestireno Falcon, Corning não pirogênico(Durham, NC)353003estéril, Tubos
centrífuga de poliestireno FalconCorning (Durham, NC)352095estéreis, 15 mL
de tripsina-EDTA, 0,05%, GibcoFisher (Waltham, MA)25300062estéreis, 100 mL
NomeEmpresaCatálogoComentários
Produtos químicos e inibidores
Staurosporina, de Streptomyces sp.Sigma (St. Louis, MO)S4400use em [1 μ g/mL] por 3 h para induzir a apoptose
Fator de crescimento epidérmico (EGF), [1 mg/mL]Millipore (Billerica, MA)EA140use a 50 nM para estimular as células respondedoras
UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies (Grand Island, NY)15575-038use 5 mM para separar células aderentes
Solução de azul de tripano, 0,4%MP Biomedicals (Santa Ana, CA)91691049para coloração de células mortas
Solução de paraformaldeído, 4% em DPBSAffymetrix (Santa Clara, CA)19943use 0,4% (v / v) em 1x DPBS para fixação celular
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14040133solução de estoque
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), livre de Ca2+- e Mg2+-free, 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14190367solução estoque
Citocalasina D, 4 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), de Zygosporium mansoniiSigma (St. Louis, MO)C8273use em [4 μ g/mL] para inibir a fagocitose
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma (St. Louis, MO)D2650solvente para citocalasina D
[header]
Ingredientes do tampão de lise celular
Tris-tampoed salino (TBS), 10x, pH 7,4BioRad (Hércules, CA)1706435para tampão de lise celular
Pirofosfatode sódioSigma-Aldrich (St. Louis, MO)22136810 mM para tampão de lise celular
Desoxicolato de sódioSigma-Aldrich (St. Louis, MO)D67500,5% p/v para tampão de lise celular
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)L3771 0,1% p/v para tampão de lise celular
GlicerolSigma-Aldrich (St. Louis, MO)G551610% para tampão de lise celular
Fluoreto de sódioSigma-Aldrich (St. Louis, MO)45002225 mM para tampão de lise celular
Mini comprimido de coquetel de inibidor de protease sem EDTA completoRoche Diagnostics (Indianápolis, IN)4693159001para tampão de lise celular, 1 comprimido por 10 mL de tampão
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)T878710% para tampão de lise celular
Ditiotreitol (DTT)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)11DTT000051 mM para tampão de lise celular
Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)48002631 mM para tampão de lise celular
Ortovandato de sódioMP Biomedicals (Santa Ana, CA)215966410 mM para tampão
de lise celularNomeEmpresaCatálogoComentários
Equipamento
Sorvall T6000B centrífugaDu Pont (Wilmington, DE)T6000B
Fisher Tissuemat, banho-mariaFisher (Waltham, MA)
Desametrator sônico (sonicador), modelo 100Fisher (Waltham, MA)
Diversos
Câmara de contagem de células, NeubauerHawksley (Lancing, Sussex, Reino Unido)AC2000
Kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC IIMillipore (Billerica, MA)CBA059para coloração PI e Anexina V para determinar o estágio de apoptose
Tubos microcntrifuge Eppendorf, 1.5 mLSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T9661
Suporte permeável ao transpoço, 0.4 μ m membrana de policarbonatoCorning (Corning, NY)3413estéril, poliestireno, cultura de tecidos tratada
Nome< / forte>Empresa< / forte>Catálogo< / forte>Comentários< / forte>
Anticorpos < / forte>
Fosfoglicogênio sintase quinase-3&alfa;/β (GSK-3&alfa;/β) (Ser21/9), anticorpo policlonalTecnologia de Sinalização Celular9331anticorpo policlonal de coelho
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) monocorpo monoclonal ( (14C10) )Tecnologia de Sinalização Celular2118anticorpo monoclonal de coelho
de de 100 mm de diâmetro, fundo cônico

Referências

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