Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

Resumo

Propomos um protocolo para investigar o transporte de moléculas carregadas e não carregadas através de cartilagem articular com a ajuda de métodos numéricos experimentais e recentemente desenvolvidos.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma doença debilitante que está associada com a degeneração da cartilagem articular e osso subcondral. Degeneração da cartilagem articular prejudica a sua função de suporte de carga substancialmente uma vez que sofre uma tremenda degradação química, isto é a perda de proteoglicano e colagénio de fibrilas de interrupção. Uma via promissora para investigar mecanismos de dano químico durante OA é expor as amostras de cartilagem de um soluto externo e controlar a difusão das moléculas. O grau de dano de cartilagem (isto é, a concentração e a configuração de macromoléculas essenciais) está associada com a perda de energia de colisão de solutos externos enquanto se move através da cartilagem articular cria diferentes características de difusão em relação à cartilagem saudável. Neste estudo, nós apresentamos um protocolo, que é constituída por várias etapas e é baseado no desenvolvido anteriormente experimental micro-C14px; "> omputed T omography (micro-CT) e modelagem de elemento finito o transporte de moléculas iodados carregadas e não carregadas é primeiro registado utilizando micro-CT, o que é seguido pela aplicação de bifásica-soluto e multifásicas modelos de elementos finitos para obter os coeficientes de difusão. e fixa densidades de carga através das zonas de cartilagem.

Introdução

Transporte molecular desempenha um papel fundamental na homeostase de juntas de articulação, a entrega de agentes terapêuticos a cartilagem articular e processamento de imagem de contraste melhorada de cartilagem ^{1, 2, 3.} Factores, tais como integração de cartilagem e intacto, a carga de soluto e tamanho, bem como a osmolalidade e concentração do banho em contacto com cartilagem podem influenciar a taxa de transporte ^{4, 5, 6.} O transporte de solutos, quer neutros ou carregados, pode ser diferente entre as zonas de cartilagem articular, uma vez que cada zona consiste em diferentes concentrações e orientações das principais moléculas da matriz extracelular, ou seja, proteoglicanos (PGs) e colagénio de tipo II ^{1, 7, 8, 9,}lass = "xref"> ^{10, 11.} Mais importante ainda, o transporte de solutos com carga pode ser altamente dependente da concentração de proteoglicanos que compreendem cargas negativas fixos no interior da matriz extracelular o que aumenta através da cartilagem articular ^{8, 9.} Esses parâmetros de densidade de carga particularmente fixa (FCD), orientação das fibrilas de colagénio e variação do teor de água em toda a cartilagem pode ser submetido a alterações quanto a osteoartrite (OA) progride, significando, assim, a importância de se estudar a difusão através da cartilagem.

No estudo actual, um protocolo com base em estudos experimentais e computacionais previamente estabelecidos ^{6, 8, 9} está propostos para investigar com precisão a difusão sob várias condições de contorno utilizando solutos neutros e carregados em um modelo finito-banho de difusão. Tele proposto métodos são compostas de micro-tomografia computadorizada de imagem (micro-CT) de um sistema incluindo cartilagem e um finito-banho suportado por avançado bifásica-soluto e modelos de elementos finitos multifásicas. Esses modelos permitem a obtenção dos coeficientes de difusão das moléculas neutras e carregadas, bem como FCDS através de várias zonas de cartilagem articular. Usando esses modelos, pode-se obter uma melhor compreensão do comportamento dos difusores moléculas neutras e carregadas que poderiam ser usados ​​para investigar as interações entre a cartilagem e sobrepondo finito-banho.

Protocolo

NOTA: O protocolo aqui apresentado é adotada a partir dos procedimentos experimentais e computacionais dos últimos trabalhos de investigação ^{6, 8, 9.} O protocolo é ilustrada na Figura 1.

Os materiais de cadáveres foram coletados com a permissão da Faculdade de Veterinária da Universidade de Utrecht.

1. Exemplo de Preparação e banho

1. Furar tampões osteocondrais cilíndricas (diâmetro de 8,5 mm) a partir de côndilos femorais equino de cadáveres utilizando broca feito por medida (Figura 1) enquanto se pulverizava fresco fosfato-salino tamponado (PBS) para evitar o sobreaquecimento e subsequente lesão da cartilagem.
2. Termorretráctil as fichas osteocondrais com um plástico encolhimento manga para minimizar a difusão lateral do banho de sobreposição.
   1. Montar o tampão osteocondral com cartilagem no the topo inicialmente no interior da manga de plástico e encolhendo seguir por sopragem de ar quente a ela. Adicione os pedaços de algodão molhado na superfície da cartilagem para evitar danos causados ​​pelo calor-relacionado.
3. Prepara-finitos banhos de (por exemplo, 650 mL, 420 mM, ioxaglato, peso molecular (MW) = 1.269 Da, carga = -1,) e neutro (650 mL, 420 mM, iodixanol, MW = 1550 Da) solutos carregados separadamente.
4. Carregar os finitos banhos preparados na superfície da cartilagem utilizando uma seringa e colocar um tampão de cortiça sobre a amostra para evitar a evaporação envolvido durante as experiências à temperatura ambiente (Figura 2A). Para estudar o transporte de soluto neutro, coloque o banho de iodixanol e estudar o banho ioxaglato lugar transporte de solutos com carga negativa na superfície da cartilagem.

2. Imagem e Processamento de Imagem

1. Coloque as amostras embrulhadas isolados com tampão de cortiça sobre um suporte feito por medida ligada à platina motorizada de um micro-CT. lugar tele amostra de modo a que a superfície da cartilagem coberto com uma solução de agente de contraste é voltada para cima.
2. Digitalizar usando o micro-CT (tamanho de voxel de 40 × 40 × 40 m ^3, o tempo de varredura de 2 min, voltagem do tubo de 90 kV e a corrente do tubo de 180 uA) um campo de visão que consiste em cartilagem, placa subcondral, e finito banho em vários pontos de tempo até que o estado de equilíbrio (48 h) é alcançado (Figura 2A). O estado de equilíbrio é conseguido quando os valores de concentração não mudam ao longo do tempo.
3. Registrar as imagens 3D em diferentes pontos de tempo com base na imagem inicial para facilitar o posicionamento da região de interesse (ROI) usando o software do fabricante (por exemplo, Analisar).
4. Converter a imagens 3D reconstruídas micro-CT em 2D Tagged Image File Format (TIFF) pilha antes de processá-los usando o software do fabricante.
5. Globalmente segmento (ImageJ> Ajustar> Limiar) a cartilagem do osso subcondral e sobrementindo banho no software.
6. Obter o valor de cinza média de cartilagem em momentos diferentes (ImageJ> Analisar> Measure) usando a máscara de cartilagem gerada na etapa anterior.
7. Dada a concentração do banho inicial e a concentração inicial do agente de contraste na cartilagem, usar uma curva de calibração linear para converter os valores de cinzentos médios para a concentração real de solutos. Os dados anteriores suportam o facto dos valores cinzentos manter uma relação linear com a concentração de agentes de contraste.
8. Traçar as concentrações do soluto em comparação com pontos de tempo experimentais.

3. Modelagem Computacional

NOTA: A difusão em este problema é assumida para ter lugar em 1D (ao longo do eixo z), o que está em conformidade com a condição de contorno experimental. Portanto, a geometria poderia ser criado de forma arbitrária.

1. Construção de modelos de cartilagem multi-zona com base finito-banho: 1) de cartilagem que consiste em zona superficial (20% da espessura total da cartilagem), zona média (50% da espessura total da cartilagem) e zona profunda (30% da espessura total da cartilagem) ¹² e 2) finito-banho em Febio ^{13, 14} (Figura 2B).
2. Atribuir as propriedades mecânicas e físicas de diferentes zonas de cartilagem e casas de banho em Febio. assumiu-se o módulo de Young (10 MPa), para ser suficientemente elevada para resistir à pressão osmótica exercida pelo banho sobrejacente e, por conseguinte, protegem a cartilagem de deformações excessivas.
   1. Usar uma permeabilidade hidráulica de 10 ^-3 mm ⁴ / N e o coeficiente de Poisson de 0. Uso coeficiente de difusão de soluto real do banho nas simulações ^{8, 9.}
3. Gerar malha (8 elementos de nó trilinear hexaedro) e refinar que perto dos limites (Figura 2B)class = "xref"> ^{8, 9.}
4. modelo bifásico-soluto
   1. Aplicar concentração inicial de soluto na pressão banho e eficaz que lhe corresponde. Olhar para a descrição de uma pressão eficaz na ^{9, 15.}
   2. Executar o modelo no modo transiente para obter a concentração de soluto em relação curvas de tempo de acordo com os coeficientes de difusão previstos em diferentes zonas de cartilagem.
5. modelo Multiphasic
   NOTA: A flutuação eléctrico entre o banho e o tecido pode ser contornado pela adição de dois monovalentes contra-iões tanto para o banho e o tecido.
   1. Para os modelos de estado estacionário: utilizar as mesmas pressões de fluido eficazes e concentrações em cartilagem e banho sobrejacente ao aumentar FCD ao seu valor desejado.
   2. Para modelos transientes: criar um finito-banho, bem agitada, mantendo o coeficiente de difusão de soluto no banho suficientemente alta. Injectar asoluto a partir do interface de banho ao ar para dentro do banho de atingir o seu valor de concentração desejado.
   3. Transitória: remover a condição de limite de concentração de soluto prescrito na etapa anterior e reverter o coeficiente de difusão do finito-banho para o seu coeficiente de difusão efectiva.
   4. Executar o modelo para obter soluto curvas de concentrao-tempo com base em FCDS aplicadas e coeficientes de difusão em diferentes zonas de cartilagem.
6. Interface Febio-MATLAB
   1. Desenvolver um código MATLAB para executar automaticamente simulação em Febio e traçadas curvas de concentração-tempo (interface de Febio-MATLAB) ^{8, 9.}
   2. Alterar coeficientes de difusão e FCDS em zonas de cartilagem usando a interface Febio-MATLAB. Executar modelos em Febio e extrai-se curvas de concentração-tempo soluto ^{8, 9.}
   3. Comparar o soluto obtido curvas de concentrao-tempo com a experimentalde dados e obter conjuntos de coeficientes de difusão e FCDS em diferentes zonas de cartilagem à base de raiz do erro quadrado médio mínimo (RMSE) ^{8, 9.}

Figura 1: a instalação experimental. A) procedimento de extração de amostra usando uma broca feita sob medida. B) Procedimento de imagiologia Micro-CT para monitorar o processo de difusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representação esquemática.A) O delineamento experimental. B) modelo computacional multi-zona que consiste no banho finito, zonas superficiais, média e profunda da cartilagem e malha associada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Os resultados representativos fornecidas aqui são adotadas a partir de trabalhos de pesquisa anteriores ^{6, 8, 9, 16.}

Na OA, a cartilagem articular sofre alterações significativas mais importante perda de GAG, e colagénio de fibrilas de danos ^17,

Discussão

Nós apresentamos um protocolo experimental combinado com um procedimento de modelação de elemento finito para o estudo da difusão de solutos neutros e carregados em toda a cartilagem articular. De acordo com nossos estudos recentes, os modelos propostos poderia descrever com precisão o transporte de ambos neutro (bifásica-soluto) e carregadas negativamente solutos (multifásicos) em diferentes zonas de cartilagem articular ^{8, 9.} Acredita-se que a cartilagem artic...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	Agente de contraste de carga negativa
Visipaque	GE saúde	12570511	Agente de contraste Nuetral
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Tecnologias de vida	10010023
Micro-CT	Perkin Elmer		Monitoramento de difusão
Osmômetro de ponto de congelamento	Avançado instrumentos		Solução de medição de osmolalidade

médio