Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Resumo

Aqui, descrevemos métodos que comumente empregamos em laboratório para determinar como a natureza da interação entre o receptor de células T e os antígenos tumorais, apresentada por antígenos leucocitários humanos, governa a funcionalidade das células T; esses métodos incluem produção de proteínas, cristalografia de raios-X, biofísica e experimentos funcionais de células T.

Resumo

Os linfócitos T citotóxicos CD8+ humanos (CTLs) são conhecidos por desempenhar um papel importante no controle do tumor. Para realizar essa função, o receptor de células T (TCR) expresso na superfície celular deve reconhecer funcionalmente os peptídeos derivados de tumor (pHLA) restritos ao antígeno leucocitário humano (HLA). No entanto, nós e outros mostramos que a maioria dos TCRs se liga de forma subótima aos antígenos tumorais. Descobrir os mecanismos moleculares que definem esse reconhecimento deficiente pode ajudar no desenvolvimento de novas terapias direcionadas que circunavegam essas deficiências. De fato, as terapias atuais que carecem dessa compreensão molecular não foram universalmente eficazes. Aqui, descrevemos métodos que comumente empregamos em laboratório para determinar como a natureza da interação entre TCRs e pHLA governa a funcionalidade das células T. Esses métodos incluem a geração de TCRs solúveis e pHLA e o uso desses reagentes para cristalografia de raios-X, análise biofísica e coloração de células T específicas do antígeno com multímeros de pHLA. Usando essas abordagens e guiadas por análises estruturais, é possível modificar a interação entre TCRs e pHLA e, em seguida, testar como essas modificações afetam o reconhecimento do antígeno de células T. Essas descobertas já ajudaram a esclarecer o mecanismo de reconhecimento de células T de vários antígenos de câncer e podem direcionar o desenvolvimento de peptídeos alterados e TCRs modificados para novas terapias contra o câncer.

Introdução

A cristalografia de raios-X tem sido, e continuam a ser, uma técnica extremamente poderosa para compreender a natureza das interacções ligando-receptor. Ao visualizar essas interações, nos mínimos detalhes, não só é possível divulgar os mecanismos moleculares que regulam muitos processos biológicos, mas também é possível alterar diretamente as interfaces de contacto relativos benefício terapêutico. Juntamente com técnicas tais como ressonância plasmónica de superfície e calorimetria de titulação isotérmica (para citar apenas alguns), tais modificações podem então ser analisados ​​para avaliar o biofísico impacto directo sobre a afinidade de ligação, de interacção cinética e termodinâmica. Finalmente, através da realização de experiências funcionais em tipos de células relevantes, uma imagem detalhada do impacto molecular e funcional de modificações para interacções receptor-ligando pode ser adquirida, fornecendo informações mecanicista muito específico. Em geral, estes tipos de métodos de proporcionar uma imagem de resolução atómica permitindo a dissuadir minação de como os sistemas biológicos funcionam, com implicações concomitantes na avanços diagnósticos e terapêuticos.

O nosso laboratório rotineiramente utiliza estas técnicas para estudar os receptores que medeiam a imunidade de células T humanas a agentes patogénicos e cancro, na auto-imunidade, e durante o transplante. Aqui, concentrar-se na resposta de células T humanas CD8 ⁺ para o cancro, mediada por uma interacção entre o receptor de células T (TCR) e o antigénio de leucócitos humanos (HLA) péptidos derivados de tumores -restricted (pHLA). Isto é importante porque, embora as células T CD8 ⁺ são capazes de direccionar células do cancro, nós e outros mostraram previamente que os TCRs anti-cancro subótimamente ligar ao seu cognato pHLA ^{1, 2.} Assim, muitos laboratórios têm procurado para alterar tanto o TCR ^{3, 4, 5} ou ⁶ do ligando ^peptídico,classe = "refex"> ^{7, 8,} a fim de aumentar a imunogenicidade e a melhores células cancerosas alvo. No entanto, estas abordagens nem sempre são eficazes e podem ter efeitos secundários graves, incluindo fora do alvo toxicidades ^{4, 9, 10.} Mais pesquisas explorar os mecanismos moleculares que governam o reconhecimento de células T de antígenos de câncer será vital para superar essas deficiências.

No presente estudo, nós focada nas respostas contra células de melanoma autólogas de células T CD8 ⁺ específicos para um fragmento do antigénio de diferenciação de melanócitos glicoproteicas 100 (gp100), gp100 _280-288, apresentados por HLA-A * 0201 (o mais comumente -expressed pHLA humana classe I). Este antigénio tem sido um alvo para a imunoterapia amplamente estudado o melanoma e foi desenvolvido como um assim chamado péptido "heteróclita" em que uma alanina substitui a valinana posição de âncora 9 para melhorar a estabilidade pHLA ^11. Esta abordagem foi utilizada para aumentar a indução de CTL de melanoma-reactivo in vitro e tem sido utilizado com sucesso em estudos clínicos ^12. No entanto, as alterações aos resíduos peptídicos podem ter efeitos imprevisíveis sobre a especificidade das células T, demonstrada pela baixa eficácia da maior parte dos péptidos heterolitic na clínica ^{6, 13.} Na verdade, uma outra forma heteróclita de gp100 _280-288, em que resíduo de peptídeo Glu3 foi substituído por Ala, revogou o reconhecimento por uma população policlonal de gp100 _280-288 células T espec�icos ^{14, 15.} Foi anteriormente demonstrado que mesmo pequenas alterações nos resíduos de âncora péptido pode alterar substancialmente o reconhecimento de células T de maneiras imprevisíveis ^{6, 16.} Assim, o estudo centrou-se na construçãoing uma imagem mais detalhada de como as células T CD8 ⁺ reconhecem gp100 e como modificações da interação entre TCRs e pHLA poderia impactar esta função.

Aqui, nós geramos formas de elevada pureza, solúveis de dois TCR específicos para gp100 _280-288 apresentado por HLA-A * 0201 (A2-YLE), bem como as formas naturais e alterados de pHLA. Estes reagentes foram utilizados para gerar cristais de proteína para resolver a estrutura atómica ternário de um TCR humano em complexo com a forma heteróclita de A2-YLE, bem como dois dos mutantes pHLAs em forma não ligada. Em seguida, usamos uma abordagem de varredura peptídeo para demonstrar o impacto de substituições de peptídeos em TCRs realizando em profundidade experimentos biofísicos. Finalmente, foi gerada uma linha de células T CD8 + geneticamente modificados, re-programadas para expressar um dos TCRs-A2-YLE específica, a fim de proceder a experiências funcionais para testar o impacto biológico das várias modificações peptídicas. Estes dados demonstram que, mesmo modições ao péptido resíduos que estão fora do motivo de ligação de TCR pode ter repercussões sobre resíduos peptídicos adjacentes que anulam de ligação de TCR e reconhecimento de células T imprevisível. Os nossos resultados representam o primeiro exemplo de os mecanismos estruturais subjacentes reconhecimento de células T do presente importante alvo terapêutico para o melanoma.

Protocolo

Expressão 1. Proteína

1. Adicione construções de genes para a produção de TCRs solúveis e pHLAs, como descrito em detalhe previamente ^{17, 18.} Conceber cada construção com um 5 'BamH1 e uma 3' local EcoR1 de restrição para inserção no vector pGMT7.
2. Transformar coli Rosetta pLysS de E. (DE3) com um vector pGMT7 plasmídeo derivado que contém a sequência que codifica a proteína de interesse por incubação de 1 mL de 50-200 ng / uL do plasmídeo com 5 mL de E. coli durante 5 min a 4 ° C , 2 min a 42 ° C e 5 min a 4 ° C, e a placa durante a noite a 37 ° C numa placa de agar LB suplementado com 50 mg / l de carbenicilina.
3. Escolha colónias individuais e crescer a 37 ° C e 220 rpm, em 30 mL de meio TYP (16 g / L de triptona, 16 g / L de extracto de levedura, e 5 g / L HK ₂ O _4), suplementado com 100 carbenicilina uM até a suspensão atinge um de ópticonsity _(DO600) de entre 0,4 e 0,6.
4. Induzir a produção de proteína numa alíquota de 5 mL através da introdução de 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), durante 3 h. Manter 20 ul de suspensão com e sem indução por electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel de análise (SDS-PAGE) e coloração do gel.
5. Adicionar culturas iniciadoras para 1 L de TYP suplementado com carbenicilina 100 uM e crescer as células como descrito acima na etapa 1.3 até que a suspensão atinja uma OD ₆₀₀ entre 0,4 e 0,6.
6. Induzir a expressão de proteína durante 3 h com IPTG 0,5 mM. Centrifugar as células durante 20 min a 3000 xg e deitar fora o sobrenadante cuidadosamente.
7. Dissolve-se o sedimento em 40 mL de tampão de lise (Tris 10 mM, pH 8,1; cloreto de magnésio 10 mM, _MgCl2; 150 mM NaCl; e 10% de glicerol), sonicado em gelo durante potência 30 min a 60%, utilizando um 2 s intervalo , e incubar à temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos com 0,1 g / l de ADNase.
8. Tratar a suspensão que contém as proteínas, sob a forma de corpos de inclusão (IB), com 100 mL de tampão de lavagem (0,5% de Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,1; NaCl 100 mM; e EDTA 10 mM).
9. Centrifugar a amostra durante 20 min a 4 ° C e 8000 x g e deitar fora o sobrenadante cuidadosamente. Re-suspender o sedimento em 100 ml de tampão de ressuspensão (Tris 50 mM, pH 8,1; NaCl 100 mM; e 10 mM de EDTA, pH 8,1), centrifugar como anteriormente à 8000 xg, e decantar cuidadosamente o sobrenadante.
10. Finalmente, dissolve-se o sedimento em 10 mL de tampão de guanidina (guanidina 6 M, Tris 50 mM, pH 8,1; EDTA 2 mM, pH 8,1; e 100 mM NaCl) e medir a concentração de proteína a 280 nm utilizando um espectrofotómetro.

2. pHLA e TCR redobramento

1. Para os redobra pHLA, misturar 30 mg de HLA-A2 (ou HLA-A2 com uma etiqueta de biotina) IBS, 30 mg de p2m IBS, e 4 mg de péptido durante 30 minutos a 37 ° C num banho de água num volume final de 6 ml de tampão de guanidina suplementadas com ditiotreitol 10 mM(DTT).
2. Iniciar o reenrolamento da proteína por diluição da mistura anterior em 1 L de um tampão de HLA redobrado pré-arrefecido (Tris 50 mM, pH 8,1; 400 mM de L-arginina; EDTA a 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; e cistamina 4 mM).
3. Deixar a HLA refold agitação a 4 ° C durante 3 h e, em seguida, transferi-la para um kDa MWCO 12,4 (peso molecular cut-off) de tubo de diálise e diálise duas vezes durante 24 horas contra 20 litros de Tris 10 mM, pH 8,1.
4. Para os redobra TCR, misturar 30 mg de TCR de cadeia α IBS e 30 mg de TCR de cadeia β BIs durante 30 min a 37 ° C num banho de água em 6 mL de tampão de guanidina suplementado com 10 mM de DTT.
5. Iniciar o reenrolamento da proteína por diluição da mistura desnaturada de TCR em 1 L de um tampão de TCR redobrado pré-arrefecido (Tris 50 mM, pH 8,1; 2,5 M de ureia; EDTA a 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; e cistamina 4 mM) durante 3 h.
6. Transferir a redobragem para um tubo de diálise de 12,4 kDa MWCO e diálise duas vezes durante 24 horas contra 20 litros de Tris 10 mM, pH 8,1.
7. Filtrar tanto a TCR ou pHLA Refidade, utilizando um filtro de membrana de 0,45 mm para os passos de purificação.

3. A purificação por Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida (FPLC)

1. Carregar a preparação redobrado filtrado (quer pHLA ou TCR) para uma média de 7,9 mL, 50 uM coluna de resina permutadora de aniões pré-equilibrada com 20 ml de Tris 10 mM, pH 8,1, em um sistema de cromatografia flexível e intuitiva.
2. Elui-se a proteína a 5 ml / min com um gradiente de sal (NaCl 0-500 mM em Tris a 10 mM, pH 8,1, ao longo de 8 volumes de coluna) e recolher fracções de 1 mL.
3. Analisar as fracções correspondentes à proteína de interesse por SDS-PAGE, reunir as fracções contendo a proteína de interesse juntamente, e concentrá-las para baixo para 500 ul com 10 kDa MWCO de 20 ou 10 kDa MWCO 4 por centrifugação durante 20 min a 4000 xg , descartando-se o fluxo de passagem.
4. Carregar as preparações de proteína concentradas em ansa de injecção de 2 ml para uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho 24 mL pré-equilibrada com o aplicativotampão ropriate eluição: solução salina tamponada com fosfato (PBS), de HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 3,4 mM; e 0,005% de tensioactivo), ou tampão de cristal (Tris 10 mM, pH 8,1, e NaCl 10 mM ).
5. Elui-se as proteínas a um caudal de 0,5 mL / min ao longo de um volume de coluna; recolher fracções de 1 mL contendo a proteína de interesse verificada por SDS-PAGE.
   NOTA: Estes métodos foram utilizados para gerar os TCRs solúveis PMEL17 TCR e gp100, bem como todos os pHLAs utilizados neste estudo: HLA-A * 0201 com YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), ou YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. Superfície Plasmon Resonance (SPR) Análise

1. Realizar análise de ligação de equilíbrio ou análise termodinâmica usando um sistema de análise de interação molecular equipado com um chip sensor CM5 ^19.
2. Ativar o chip CM5 por fcia de um mistura 1: 1 de N-hidroxi-succinimida 100 mM (NHS) e mM de 1-etil-3- (3-dimetilpropil) -carboiimide 400 (EDC) durante 10 min a um caudal de 10 mL / min e a 25 ° C.
3. Carga de aproximadamente 5.000 unidades de resposta (RU) de estreptavidina (110 mL de 200 ug / ml em acetato 10 mM, pH 4,5) por ligação covalente à superfície do chip em todos os quatro fluxos de células e usar 100 ul de cloridrato de etanolamina 1 M para desactivar quaisquer grupos reactivos remanescentes.
4. Pares aproximadamente 500-600 RU de pHLA, a ~ 1 uM em tampão comercial (fornecido pelo fabricante), para o chip sensor CM5 com uma taxa de fluxo lento de 10 mL / min para assegurar uma distribuição uniforme sobre a superfície do chip.
5. Saturar a superfície do chip com biotina 1 mM em tampão comercial (fornecido pelo fabricante) durante 60 s.
6. Injectar dez diluições em série de TCRs solúveis sobre as células de fluxo relevantes a uma alta velocidade de fluxo de 30 mL / min a 25 ° C.
7. Calcule a constante de ligação de equilíbrio(K _D (E)), usando valores de um ajuste não linear da curva (Y = (P1X) / (P2 + x)) ^20.
   NOTA: As unidades de y = resposta, x = concentração analista, P1 = r _max, P2 = K _D.
8. Realizar análise cinética assumindo um 1: 1 de ligação Langmuir e ajustar os dados usando um algoritmo global de ajuste no pacote de software ^2.
9. Realizar termodinâmica experiências, repetindo este método com as seguintes temperaturas: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, e 30 ° C ^19.
10. Use os valores de _KD determinado por SPR a diferentes temperaturas para calcular ΔG ° termodinâmico utilizando a equação padrão (ΔG ° = -RTlnK _D) ^19.
    NOTA: R = constante de gás, T = temperatura em K, ln = log natural.
11. Calcular os parâmetros termodinâmicos de acordo com a equação de Gibbs-Helmholtz (ΔG ° = AH - TΔS °) ^19.
12. Traçar as energias de ligação livre, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D), contra a temperatura (K), utilizando uma regressão não-linear para ajustar a equação de três parâmetros (y = AH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (X / 298)) ^19.
    NOTA: Y = temperatura em K, X = ΔG °.

5. Calorimetria isotérmica de titulação (ITC)

1. Realizar experimentos ITC, utilizando um calorímetro de titulação isotérmica. Injectar 30 uM pHLA para dentro da célula de carga de calorímetro e 210 uM de TCR solúveis para dentro da seringa. Use as seguintes condições tampão: 20 mM de HEPES (pH 7,4) contendo NaCl 150 mM.
2. Realizar 20 injecções de TCR, cada uma um volume de 2 mL. Calcule AH e K _D utilizando o software de análise.

6. A cristalização, Coleta de dados de difração, e Modelo Refinamento

1. Realizar ensaios de cristalização utilizando um robot de cristalização.
2. Crescer cristais por vapou de difusão a 18 ° C por meio da técnica da gota sentado numa placa de 96 poços com um reservatório contendo 60 ul de tampão de cristalização (licor mãe) ^21.
3. Concentra-se a pHLA solúvel a aproximadamente 10 mg / ml (0,2 mM) em tampão de cristal por centrifugação a 3000 xg num peso molecular de 10 kDa concentrador centrífugo de corte.
4. Para as estruturas de co-complexo, misturar o TCR e pHLA a uma proporção de 1: 1 molar até se obter uma solução de proteína a cerca de 10 mg / ml (0,1 mM).
5. Adicionou-se 200 nL de pHLA sozinho, ou a 1: 1 razão molar de mistura de TCR e pHLA, a 200 nL de cada solução de reservatório a partir do ecrã de cristalização utilizando um robot de cristalização e marcar para cristais ao microscópio após 24 h, 48 h, 72 h, e, em seguida, uma vez por semana.
6. monocristais colheita por montá-los manualmente no crio laços sob um microscópio e crio-resfriá-los, submergindo e armazená-los em nitrogênio líquido (100 K).
   NOTA: Carregando cristais leva um pouco de pracTice, e decidir que os cristais são bons o suficiente para coleta de dados vem com a experiência. Como regra geral, o maior e mais regular do cristal, o melhor.
7. Recolha de dados numa corrente de gás de azoto a 100 K.
   NOTA: Esta informação foi adquirida na Fonte de Luz Diamond (DLS) instalação nacional de ciência síncrotron no Reino Unido.
8. Analisar os dados por estimar as intensidades de reflexão com xia2 usando tanto MOSFLM ²² e XDS pacotes ^23, e, em seguida, escalar os dados com SCALA ou sem rumo ²⁴ eo pacote CCP4 ^25.
9. Resolver as estruturas com substituição molecular utilizando PHASER ^26.
10. Ajustar o modelo com GALEIRÃO ²⁷ e refinar o modelo com REFMAC5 ^28.
11. Prepare representações gráficas com PyMOL ^29.
12. Calcular os contatos usando o "contato"programa do pacote CCP4. Use a 4 um cut-off de van der Waals contatos e 3,4 Å de corte para ligações de hidrogênio e pontes de sal.
13. Calcular complementaridade superfície utilizando o programa de "SC" no pacote CCP4.
14. Calcular o ângulo de cruzamento do complexo TCR-pHLA, tal como descrito ^30.
    NOTA: Para este estudo, os dados de reflexão e coordenadas finais modelo foram depositados com o banco de dados PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 e A2 PDB -YLE-5A: 5EU5).

Resultados

Utilizando os métodos descritos acima, que gerado TCR solúvel (Tabela 1) e moléculas pHLA para conduzir em profundidade análises moleculares de gp100 _280-288 reconhecimento por células T CD8 ^+. Um sistema de expressão de E. coli modificado foi usado para gerar insolúvel IBS para cada cadeia separada de ambos os TCRs (cadeias a e p) e pHLAs (cadeia α e p2m). Este método tem a vantagem de ser relativamente barato e fácil de montar e gera grandes rendimentos de proteína (100-500 mg / L de cultura). Além disso, as proteínas insolúveis são altamente estável se armazenada a -80 ° C. Em seguida, usamos uma técnica de redobramento e purificação bem estabelecida para gerar proteínas funcionais, homogéneos, solúveis. Este método é útil para gerar proteínas para experiências biofísicas, estruturais, e celular, assim como reagentes que podem ser utilizados para diagnóstico ou terapêutica.

(Tabela 2). Este ensaio demonstrou que os resíduos no péptido foram mais importantes para a ligação TCR. High-resolution análises de afinidades de ligação com esta técnica são extremamente úteis para determinar os mecanismos biológicos que controlam as interacções proteína-proteína, bem como para a análise da afinidade de ligação de moléculas terapêuticas.

Em seguida, cristalizou um TCR solúvel específicos de melanoma (PMEL17 TCR) em complexo com um pHLA modificado tumor-derivada (A2-YLE-9V) para investigar o modo de ligao em resolução atómica (Figuras 1 e 2 e Tabela 3). Estes experimentos fornecem a visualização direta da interface de ligação entre duas moléculas, providing informações chave sobre os princípios que regem a interação. Foi realizada ainda uma análise termodinâmica da interação usando tanto SPR e ITC, revelando as contribuições energéticas que permitiram ligação (Figuras 3). Estas análises foram ainda apoiada por uma descrição de alta resolução da pegada de contato entre as duas proteínas (Figura 4 e Tabela 4).

Nós, então, resolvido a estrutura das moléculas pHLA sem ligadura, apresentando formas mutantes do peptídeo, revelando que um interruptor molecular poderia explicar por que certas mutações revogados TCR de ligação (Figuras 5).

Em geral, estas técnicas proporcionados novos dados que demonstram o mecanismo que explica como as células T reconhecem um antigénio derivado de melanoma que é um importante alvo para terapias anti-cancerosas. Mais amplamente, essas técnicaspode ser usado para investigar virtualmente qualquer interacção receptor-ligando, descobrir novos mecanismos biológicos que podem ser visados ​​para novos avanços terapêuticos.

Figura 1: Análise Plot Densidade. As mostras coluna esquerda omitem mapas em que o modelo foi refinado na ausência do péptido. densidade diferença é contornado em 3,0 sigma, contornos positivos são mostrados em verde, e os contornos negativos são vermelhos. A coluna da direita mostra o mapa observada em 1,0 sigma (mostrado como uma malha cinza em torno representações vara das cadeias de proteínas), após refinamento posterior usando restrições de simetria não cristalográficas automáticas aplicadas pela REFMAC5. (A) O modelo para PMEL17 TCR-A2-YLE-9V com a TCR CDR3 laços de cor azul (cadeia α) e laranja (cadeia β) eo peptídeo em verde. (B) O modelo para A2-YLE como peptídeo de cor verde escuro. (C) O modelo de A2-YLE-3A com a cor laranja péptido (para A2-YLE-3A, foram 2 moléculas na unidade assimétrica, mas estes eram praticamente idênticos em termos de mapas omitir e densidade, portanto, apenas copiar uma é mostrado aqui). (D) O modelo para A2-YLE-5A com a cor rosa peptídeo. Reproduzido com permissão de referência ^31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral da PMEL17 TCR em complexo com A2-YLE-9V. Representação (A) dos desenhos animados do complexo PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. O TCR é de cor preta; loops de TCR CDR são mostradas (vermelho, CDR1α; verde escuro, CDR2α; azul, CDR3α; amarelo, CDR1β; aqua, CDR2 ^6 ;; laranja, CDR3β); e HLA-A * 0201 é representado na cinza. O peptídeo YLE-9V é representado por varas verdes. (B) de superfície e vara representações de resíduos da PMEL17 TCR laços CDR (código de cores como em A) que entrar em contato com a superfície A2-YLE (A2, cinzento; YLE-9V, varas verdes). A linha diagonal preta indica o ângulo de cruzamento do TCR em relação ao eixo longitudinal do péptido YLEPGPVTV (46,15 °). (C) Contactar pegada da TCR PMEL17 na superfície da A2-YLE-9V (A2, cinza); roxo e verde (de superfície e varas) indicam a HLA-A * 0201 e de resíduos YLE, respectivamente, contactado pela TCR gp100. Cut-off de 3,4 Å para ligações de hidrogênio e 4 Å de van der Waals contatos. Reproduzido com permissão de Referência 31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: análise termodinâmica do PMEL17 Interacções de TCR-A2-YLE. (A) PMEL17 TCR respostas a A2-YLE aos 5, 12, 18, 25 de ligação de equilíbrio, e 37 ° C através de nove a dez diluições em série de TCR. SPR dados brutos e embutidos (assumindo 1: 1 de ligação de Langmuir) está representada na inserção de cada curva e foram usadas para calcular K e _{em Koff} valores utilizando um algoritmo global de ajuste (BIAevaluation 3.1). A tabela mostra-ligação de equilíbrio (K _D (E)) e as constantes cinéticas de ligação (K _D (k) = _Koff / _Kon) a cada temperatura. O equilíbrio de ligação constante (K _D, uM) Os valores foram calculados utilizando um ajuste não linear (y = (P1X) / (P2 + x)). (B) Os parâmetros termodinâmicos foram calculados de acordo com a equação de Gibbs-Helmholtz (ΔG ° = AH ° - TΔS °). As energias livres de ligação, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D), foram representados graficamente em função da temperatura (K), utilizando uma regressão não linear para ajustar a equação de três parâmetros (Y = AH + ΔCp ° ° * (X-298) -x -x * Ds ° * ° ΔCp * ln (X / 298)). Entalpia (AH °) e entropia (TΔS °) a 298 K (25 ° C) são apresentados em kcal / mol e foram calculados por regressão não linear de temperatura (K) representada graficamente contra a energia livre (ΔG °). (C) isotérmica de titulação calorimétrica (ITC) medições para o PMEL17 interacção TCR-A2-YLE. Entalpia (AH °) e entropia (TΔS °) a 298 K (25 ° C) são apresentados em kcal / mol. Reproduzido com permissão de referência ^31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ong> Figura 4: O PMEL17 CDR Loops Focus on Peptide Resíduos Pro4, Val7 e Thr8. (A) Representação esquemática dos contactos entre o péptido YLE-9V e os resíduos de ansa de CDR PMEL17 (colorido de acordo com a Figura 2A). Os números na parte inferior do painel mostram os totais contactos entre o TCR e o péptido. (B) Os contactos entre a PMEL17 TCR eo peptídeo YLE-9V (varas verdes) que mostra a van der contatos Waals (preto linhas tracejadas) e ligações de hidrogênio (vermelho linhas tracejadas) feitas pelo TCR CDR3α (azul), CDR1β (amarelo) , CDR2β (aqua), e CDR3β (laranja) ciclos. No painel inferior é uma visão mais próxima dos contactos entre YLE Pro4, Val7 e Thr8, respectivamente, e os resíduos de loop TCR CDR (varas codificados por cores como na Figura 1A). Cut-off de 3,4 Å para ligações de hidrogênio e 4 Å de van der Waals contatos. Reproduzido com permissão de referência ^31.rge.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Comparação conformacional de YLE, YLE-3A, e A2-YLE-5A péptidos apresentados por HLA-A * 0201. (A) YLE (varas verdes escuras) e YLE-3A (varas laranja) alinhamento peptídeo pela superposição de HLA-A * 0201 α1 hélice (desenhos animados cinza). resíduos dentro de caixas indicam a mutação de Glu3 para uma alanina. As inserções mostram como a substituição Glu3Ala provoca uma mudança de posição (seta preta) de Pro4 resíduo vizinho na estrutura A2-YLE-3A em comparação com a estrutura A2-YLE. (B) YLE (escuras varas verdes) e YLE-5A (paus-de-rosa) de alinhamento peptídeo pela superposição de HLA-A * 0201 α1 hélice (desenhos animados cinza). Os resíduos dentro de caixas indicam a mutação da glicina 5 para uma alanina. Reproduzido com permissão de referência ^{Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

Tabela 1: Alinhamento de TCR CDR3 Regiões de PMEL17, gp100, MPD, e 296 TCRs específicos de gp100. Reproduzido com permissão de referência ^31.

sequência peptídica	Peptide	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 AffiComunidade K D
YLEPGPVTA	YLE	7,6 ± 2 uM	26,5 ± 2,3 uM
YLEPGPVT V	YLE-9V	6,3 ± 1,2 ^ M	21,9 ± 2,4 uM
A LEPGPVTA	YLE-1A	15,9 ± 4,1 uM	60,6 ± 5,4 uM
YL A PGPVTA	YLE-3A	Sem ligação	Sem ligação
YLE Um GPVTA	YLE-4A	19,7 ± 1,3 uM	144,1 ± 7,8 uM
YLEP A PVTA	YLE-5A	> 1 mM	> 1 mM
YLEPG A VTA	YLE-6A	11,4 ± 2,7 mM	954.9 ± 97,8 mM
YLEPGP A TA	YLE-7A	31,1 ± 4 uM	102,0 ± 9,2 uM
YLEPGPV A A	YLE-8A	38,1 ± 7,4 mM	121,0 ± 7,5 uM

Tabela 2: Análise de afinidade (K _D) de PMEL17 TCR e TCR para gp100 gp100 _280-288 variantes peptídicas. Reproduzido com permissão de referência ^31.

parâmetros	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
Código PDB </ Strong>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
estatísticas do conjunto de dados
grupo espacial	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
parâmetros da célula unitária (A)	a = 45,52, b = 54,41, C = 112,12, a = 85,0 °, b = 81,6 °, 72,6 ° G =	a = 52,81, b = 80,37, C = 56,06, b = 112,8 °	a = 56,08, b = 57,63, C = 79,93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, 63,8 ° G =	a = 56,33, b = 79,64, C = 57,74, b = 116,2 °
fonte de radiação	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
Comprimento de onda (A)	0,9763	0,9999	0,9763	0,9763
measufaixa de resolução de vermelho (a)	51,87-2,02	45,25-1,97	43,39-2,12	43,42-1,54
Outer resolução Shell (A)	2,07-2,02	2,02-1,97	2,18-2,12	1,58-154
reflexão observado	128.191 (8.955)	99.442 (7.056)	99.386 (7.463)	244.577 (17.745)
reflexões únicas	64.983 (4.785)	30.103 (2.249)	49.667 (3.636)	67.308 (4.962)
Completude (%)	97,7 (96,7)	98,5 (99,3)	97,4 (96,7)	99,6 (99,9)
Multiplicidade	2,0 (1,9)	3,3 (3,1)	2,0 (2,1)	3,6 (3,6)
I / Sigma (I)	5,5 (1,9)	7,2 (1,9)	6,7 (2.3)	13 (2.3)
Rpim (%)	5,7 (39,8)	8,8 (44,7)	8,7 (41,6)	4,5 (35,4)
R merge (%)	7,8 (39,6)	9,8 (50,2)	8,7 (41,6)	5,0 (53,2)
estatísticas de refinamento
Resolução (A)	2.02	1,97	2.12	1,54
Não há reflexões usadas	61688	28557	47153	63875
No reflexo no conjunto Rfree	3294	1526	2514	3406
R cryst (sem corte) (%)	18.1	19,7	17.2	17,0
R livre	22.2	25,5	21.1	20.1
Desvio quadrático médio da geometria ideal
comprimentos de ligação (A)	0,018 (0,019) *	0,019 (0,019) *	0,021 (0,019) *	0,018 (0,019) *
ângulos de ligação (°)	1.964 (1.939) *	1.961 (1.926) *	2.067 (1.927) *	1.914 (1.936) *
No geral coordenada de erro (A)	0,122	0,153	0,147	0,055
Ramachandran Estatísticas
mais favorecida	791 (96%)	371 (98%)	749 (99%)	384 (98%)
Permitido	32 (4%)	6 (2%)	10 (1%)	5 (1%)
Outliers	2 (0%)	3 (1%)	1 (0%)	2 (0%)

Tabela 3: Redução de dados e aperfeiçoamento Estatística (substituição molecular). Reproduzido com permissão de referência ^31. Os valores entre parênteses são para o escudo mais alta resolução.

^OH

HLA / resíduo de peptídeo	resíduo TCR	No. vdw (≤4Å)	No. ligações de H (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 O	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	10	1
αGly97 O	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101 N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

Tyr1

Tabela 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V Contact Table. Reproduzido com permissão de referência ^31.

Discussão

Os protocolos descritos aqui fornecem um quadro para a dissecção molecular e celular de respostas de células T no contexto de qualquer doença humana. Embora o câncer foi o foco principal deste estudo, nós usamos abordagens muito semelhantes para investigar as respostas das células T a vírus ^{32, 33, 34, 35, 36, 37} e durante autoimunidade ^{38, 39, 40.} Além disso, temos usado essas técnicas de forma mais ampla para compreender os princípios moleculares que governam de células T reconhecimento do antígeno ^{2, 19, 41, 42.} Na verdade, a natureza imprevisível das modificações ao péptido resíduos, mesmo aquelesfora da dos resíduos de contacto de TCR, o reconhecimento de células T impactos tem implicações importantes para a concepção de péptidos heteróclita. Esses achados têm contribuído diretamente para o desenvolvimento de terapias romance de células T, incluindo vacinas peptídicas ^{6, 43} e TCRs de elevada afinidade artificiais ^{3, 4, 5, 20, 44,} bem como de diagnósticos aprimorados ^{45, 46, 47.}

As etapas críticas no âmbito do protocolo
A geração de uma proteína altamente puro, funcional é essencial para todos os métodos descritos no presente documento.

Modificações e solução de problemas
Dificuldades na geração de proteína altamente pura, muitas vezes relacionados com a expressão de altamente-pure, insolúvel BIs a partir do sistema de expressão de E. coli. Geralmente, a modificação do protocolo de expressão (por exemplo, induzindo a diferentes densidades ópticas, utilizando diferentes estirpes de E. coli, ou usando meios de comunicação diferentes formações) resolve estes problemas.

Limitações da técnica
Estas técnicas utilizam moléculas de proteínas solúveis (TCR) e pHLA que são normalmente expressas na superfície da célula. Assim, é importante para assegurar que o / resultados biofísicos estruturais são consistentes com abordagens celulares para confirmar significado biológico.

Significância da técnica em relação a métodos existentes / alternativas
Através da utilização de cristalografia de raios-X e biofísica comprovadas através de análise funcional, nós e outros demonstraram que a TCR específico para epitopos de cancro são geralmente caracterizadas por afinidades de ligação de baixo ^48. Esta baixa afinidade TCR pode ajudar a explicar por que as células T ARe não naturalmente eficaz em limpar o câncer. estruturas atômicas de alta resolução de complexos entre TCRs anti-câncer e antígenos tumorais cognatos estão começando a revelar a base molecular para esta afinidade fraca. Além disso, esses estudos são úteis para determinar os mecanismos subjacentes às intervenções terapêuticas destinadas a ultrapassar este problema, semear futuras melhorias ^16. Neste estudo, foi examinada a primeira estrutura de uma αβTCR de ocorrência natural em complexo com um gp100 HLA-A * 0201-restrito de melanoma epitopo. A estrutura, combinada com uma análise biofísica em profundidade, revelado o modo de ligação geral da interacção. Nós também descobriu um interruptor molecular inesperada, que ocorreu em uma forma mutante do peptídeo, que revogou TCR ligação (avaliada através de ressonância de plasma de superfície) e reconhecimento de células T CD8 ⁺ (experimentos funcionais). Só foi possível demonstrar esse novo mecanismo de presentati antígeno HLAsobre o uso dos métodos descritos de alta resolução.

As aplicações futuras ou direções Depois de dominar esta técnica
Em geral, os nossos resultados demonstram o poder de cristalografia de raios-X e métodos biofísicos quando combinado com análises funcionais robustos. Usando estes métodos, é possível para dissecar os mecanismos moleculares precisos que regulam o reconhecimento do antigénio das células T. De facto, é também possível utilizar esta abordagem para resolver a estrutura de TCR não ligada, demonstrando como as alterações conformacionais podem desempenhar um papel durante antigénio discriminação ^{49, 50, 51.} Uma melhor compreensão da natureza altamente complexo e dinâmico que sustenta interacções TCR-pHLA também tem implicações óbvias para o projeto terapia. Ser capaz de diretamente "ver" as moléculas que estão sendo terapeuticamente alvo, bem como o efeito que as modificações têm em recognitio antígenon, irá melhorar claramente o desenvolvimento destes medicamentos vai para a frente. Neste estudo, mostra-se que até mesmo alterações de um único resíduo de péptido que não está muito envolvida por um TCR pode transmitir de forma imprevisível alterações estruturais a outros resíduos no péptido ligado a HLA, que, por sua vez, altera drasticamente o reconhecimento de células T. Uma compreensão mais completa dos mecanismos moleculares utilizados durante o reconhecimento do antigénio das células T será extremamente benéfica na concepção de terapias futuras para uma ampla gama de doenças humanas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
S.O.C. media	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubadora	Sanyo
carbenicillin	Sigma
IPTG	Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain	Centrífuga Generon
Legend RT	Sorvall
Tris	Cloreto de magnésio Fisher
	Arcos
NaCl	Glicerol
	Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070	DNA de Bandelin
	Fisher
Triton	Sigma-Aldrich
EDTA	Fisher
guanidina	Fisher
NanoDrop ND1000	Thermo
Peptides	Peptide Protein Research
dithiothreitol	Sigma-Aldrich
L-arginina	SAFC
cisteamina	Cistamina Fisher
	Fisher
	Sigma-Aldrich
ureia	Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μ m filtro de membrana	Pall
POROS 10/100 HQ	Biossistemas
aplicadosÄ Sistema FPLC puro KTA	GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4	Coluna Sartorius
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences
	Oxoid
BIAcore buffer HBS	GE Healthcare Life Sciences
	Avidity
BIAcore T200	CM5 da GE Healthcare Life Sciences
Streptavidin	Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC	GE Healthcare Ciências da Vida
Hepes	Robô de cristalização Sigma-Aldrich
Gryphon	Art Robbins Instruments
Intelli-plate	Art Robbins Instruments
Telas e reagentes de cristalização	Dimensões
75 cm2 flask	Greiner Bio-One
0,22 μ m filters	Miller-GP, tubo
	Beckman Coulter
Optima L-100 XP com rotor SW28	Beckman Coulter
CD8	Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads	Invitrogen
	Meio Miltenyi Biotec
CK, PHA	Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb
dasatinibe	Axônio
MIP-1β e TNF&alfa; ELISA	R& D Systems
51Cr	Contador Microbeta PerkinElmer
1450	PerkinElmer