Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Resumo

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Resumo

O transplante de ilhotas foi clinicamente comprovado para ser eficaz no tratamento da diabetes tipo 1. No entanto, a atual estratégia de transplante intra-hepático pode sofrer reações agudas de sangue total e resultar em enxerto de isleta pobre. Aqui, relatamos um protocolo robusto para o transplante de ilhotas no local de transplante extra-hepático - a almofada de gordura epidídima (EFP) - em um modelo de mouse diabético. É descrito um protocolo para isolar e purificar ilhotas com rendimentos elevados de ratinhos C57BL / 6J, bem como um método de transplante realizado pela criação de ilhéus em um andaime decelularizado (DCS) e implantá-los no local de EFP em camundongos C57BL / 6J singênicos rendidos diabéticos Por estreptozotocina. O enxerto DCS contendo 500 ilhotas reverteu a condição hiperglicêmica dentro de 10 dias, enquanto as ilhotas livres sem DCS exigiam pelo menos 30 dias. A normoglicemia foi mantida por até 3 meses até o enxerto foi explantado. Em conclusão, a DCS aumentou o enxerto de ilhotas em tO site extra-hepático do EFP, que poderia ser facilmente recuperado e poderia fornecer uma plataforma reprodutível e útil para investigar os materiais de andaime, bem como outros parâmetros de transplante necessários para um enxerto de ilhotas bem sucedido.

Introdução

O diabetes mellitus tipo 1 (T1D) é uma doença endócrina autoimune em que as células de ilhotas são abladas pelo sistema imunológico, tornando os pacientes dependentes da injeção de insulina exógena durante toda a vida. O protocolo de Edmonton representa um marco nos estudos clínicos do transplante de ilhotas; As ilhotas foram infundidas através da veia porta e transplantadas no local intra-hepático ¹ . No entanto, dois principais obstáculos - fontes inadequadas de ilhotas de doadores e enxertos de ilhotas pobres - evitam o grande sucesso do transplante de ilhotas ² . Normalmente, as ilhotas precisam ser coletadas de trê....

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pequim (IACUC, IACUC nº COE-LuoY-1).

1. Isau Isolamento

1. Preparação de reagentes e equipamentos.
   1. Reconstitua o pó de colagenase P (2 U / mg) no HBSS para fazer uma solução de 5 mg / mL e filtre-o através de um filtro de 0,22 μm para remover as bactérias. Preparar soluções alíquotas de 0,6 ml de colagenase P em tubos cônicos de 15 mL e armazenar a -20 ° C.
      NOTA: Durante o uso, cada alíquota é diluída com HBSS para dar soluções de trabalho de 6 mL com concentrações finais de 0,5 mg / mL, ou....

Resultados

Nosso método de aperto, realizado usando grampo hemostático microscópico, é direto e economiza tempo em comparação com a técnica de ligadura de sutura. Levaram cerca de 4 h para isolar e purificar cerca de 1.200 ilhotas de 6 camundongos. As ilhotas recentemente isoladas tipicamente tinham uma periferia áspera sob um microscópio óptico ( Figura 3A ). Uma vez que as ilhotas se recuperaram do processo de isolamento, elas pareciam brilhantes e apertadas e adquir.......

Discussão

A perfusão e o tempo de digestão do pâncreas são dois parâmetros fundamentais que afetam o rendimento e a qualidade das ilhotas. Moskalewski relatou pela primeira vez o uso de uma mistura de colagenase em bruto para digerir pâncreas ^de cobaias picadas ¹¹ . Lacy et al. Relatou a injeção de enzimas no sistema de duto para perfundir o pâncreas, o que aumentou muito o rendimento de ilhotas ¹² . A perfusão ductal da enzima permite a exposição má.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tesoura de dissecação	Ningbo Medical
Forceps	Ningbo Medical
0,5 mm de diâmetro malha de arame	Ningbo Medical
70 μ filtro de células m	Falcon	352350
Grampo hemostático de artéria	Ningbo Medical
Grampo hemostático microscópico	Ningbo Medical
	Ningbo Medical
	JINHUAN		Com clipe de ferida de agulha
	Ningbo Medical
Cotonete	Gaze Médica
Cortinas Estéreis
de 10mL	JINGHUAN
Seringa de 1 mL	JINGHUAN
Agulha intravenosa 27G	JINGHUAN	0.45x15 RWSB
1.5 mL Eppendorf tubo	Axygen
15mL tubo cônico	Corning	430791
50mL tubo cônico	Corning	430829
35mm Não tratado  Peri-pratos	Corning	430588
Transwell	Corning	3422
0.22 μ m filter	Pall	PN4612
10 mL pipeta sorológica	Corning	4488
Enchimento de pipeta S1	Thermo Scientific	9501
Pipeta (2-20μ L)	Axygen	AP-20	AXYPETTM
Microscópio de dissecação	Olympus	SZ61
Centrífuga	Eppendorf	5810R
Hank' s solução salina balanceada	Gibco	C14175500CP
Colagenase P	Roche	COLLP-RO
Histopaque 1077	Sigma	10771
RPMI 1640	Gibco	11879-20
FBS	Gibco	16000-044
D-glicose	Gibco	A24940-01
Medidor de glicose	Roche		ACCU-CHEK
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122
Estreptozotocina	Sigma	V900890	VetecTM
Hidrato de cloral	J& K	C0073
Citrato de sódio	Sigma	71497
Ácido cítrico	Sigma	C2404
Iodóforos	Ningbo Medical
C57BL / 6J, 10-12 semanas de idade	VitalRiver		Pequim, China
Andaime descelularizado	Guanhao Biotec	131102	Guangzhou, China

Pinça hemostática Suturas PGLA Absorvíveis 6-0 da Ningbo Médicas Ningbo Seringa Médica