Este artigo descreve o protocolo para a cultura de baixa densidade neurónios do hipocampo primárias que crescem em lamelas de vidro invertida sobre uma monocamada de células gliais. As camadas neuronais e gliais são separados por contas de cera de parafina. Os neurónios cultivados por este método são adequados para imagiologia óptica de alta resolução e ensaios funcionais.
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Artigo de método
Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade para sondar a estrutura e fisiologia das células nervosas individuais na cultura é crucial para o estudo da neurobiologia, e permite flexibilidade na manipulação genética e química de células individuais ou redes definidos. Tal facilidade de manipulação mais simples no sistema de cultura reduzida quando comparada com o tecido cerebral intacto. Enquanto existem muitos métodos para o isolamento e o crescimento destes neurónios primárias, cada uma tem as suas próprias limitações. Este protocolo descreve um método para a cultura de baixa densidade e de alta pureza de roedores neurónios do hipocampo embrionárias em lamelas de vidro, que depois são suspensas sobre uma monocamada de culas gliais. Esta 'cultura sanduíche' permite o crescimento exclusivo de longo prazo de uma população de neurônios, permitindo simultaneamente para suporte trófico da monocamada glial subjacente. Quando são neurónios de idade suficiente ou nível de maturidade, as lamelas de neurónios pode ser virado para fora-do prato da glia e utilizado em imagiologia ou ensaios funcionais. g neuróniosrown por este método normalmente sobreviver por várias semanas e desenvolver mandris extensos, as conexões sinápticas, e propriedades de rede.
Introdução
O cérebro está organizado em redes complexas de neurônios. A contribuição de neurónios individuais para a actividade de rede e função do cérebro pode ser estudada por alteração selectiva da sua composição molecular e perturbação das suas propriedades fisiológicas. A manipulação genética e química de neurónios individuais é sem dúvida mais fácil em neurónios cultivados do que em tecido cerebral intacto, livre de heterogeneidade celular deste último e complexidade. Os neurónios em cultura desenvolver axonal bem definida e mandris dendríticas e formar muitas ligações sinápticas uns com os outros.
Enquanto neurónio cultura de animais adultos ....
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Protocolo
Todos os experimentos e protocolos que utilizam animais de laboratório foram aprovados pela Universidade de Manitoba comitê de ética animal e estavam em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.
1. Preparação de Instrumentos, Tampões e Soluções
- Esterilizar por autoclavagem de todos os equipamentos de dissecção, pipetas de Pasteur de vidro, pontas de pipetas, aparelho de filtro, e água desionizada.
- Prepara-se uma a 20% (w / v; 1,1 M) uma solução de glucose estoque em água desionizada e filtra-se a esterilizar. Armazenar a 4 ° C.
- Prepara-se uma solução de piruvato de sódio 100 mM em ág....
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Resultados
Neste método de "sanduíche" de cultura de células nervosas primárias, neurónios do hipocampo (Figura 3) crescem sobre uma camada de células da glia (Figura 1), separados por grânulos de parafina (Figura 2). Isto assegura que os neurónios selectivamente crescer em lamelas de vidro com a contaminação de células da glia mínima, mas receber suporte trófico adequada a partir de células da glia que crescem no prato de cultura de teci.......
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Discussão
Enquanto o método "sanduíche" de neurônios a cultura de foi bem descrita em outra parte 2, 11, há várias etapas ao longo do protocolo que são bastante difícil de descrever em texto sozinho, que pode levar à frustração para os investigadores que desejam adotá-lo.
O método pode ser dividido em três grandes fluxos de trabalho: cultura da glia, preparação de lamela e de cultura de neurónios e de manutenção. Cada uma das três pr.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo CIHR MOP-142209 para TJS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumentos de dissecação | |||
| Micro Tesoura de Dissecação | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Tesoura de Mola de Dissecação | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Tesoura de Mola de Dissecação | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Fórceps | 7Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Fórceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Preparação do tecido | |||
| Tripsina (2,5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Usado como filtro de células. Monte primeiro com filtro e autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| Hemocitômetro | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grau 105 Tecido de Limpeza de Lentes | GE Healthcare | 2105-841 | Usado como filtro de células. Monte primeiro no porta-filtro e na autoclave |
| Pipetas Glass Pasteur com filtro de algodão | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution sem cálcio, magnésio, fenol vermelho (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Pipetas Glass Pasteur | VWR | 14672-380 | |
| Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butano bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Centrífuga Modelo 65 | |
| Eppendorf | 5810R | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Cultura de tecidos | |||
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Placa de Petri (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| (60 mm) | Soro | de Cavalo FB0875713A | |
| Gibco | 16050-122 | Pode ser usado no lugar do BGS, mas cada lote deve ser testado devido à variação entre lotes. Recomenda-se a inativação do soro pelo calor. | |
| Hidróxido de Sódio | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Piruvato de Sódio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Meio Essencial Mínimo (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Meio Neurobasal | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| Suplemento GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Pode ser usado no lugar da L-Glutamina no meio NBG |
| Prato de Cultura (60 mm) | Corning, Inc | Frascos de Cultura 353002 | |
| (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Citarabina (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glicose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Soro de Crescimento Bovino (BGS) | HyClone | SH3054103 | Recomenda-se a inativação por calor antes do uso. |
| Suplemento B27 (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| VWR | 89094-806 | ||
| Ácido DL-2-amino-5-fosfonopentonóico (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Preparação de lamínula | |||
| Tetraborato de sódio decahidratado (bórax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Bromidrato de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Cera de parafina | Fisher | 22-900-700 | |
| Forno de convecção por gravidade | VWR | 89511-404 | Usado para método alternativo de limpeza de lamínula discutido no protocolo |
| Banho ultrassônico (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Anachemia | ácido nítrico | 62786-460 | |
| Racks de coloração de cerâmica | Thomas Scientific | 8542E40 | Usado para método alternativo de limpeza de lamínula discutido no protocolo |
| Lamínulas | Glaswarenfabrik Karl Hecht O fabricante GmbH | 1001/18 | é muito importante, pois os neurônios não aderem bem ao vidro de qualidade inferior |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Diversos | |||
| Filtros de seringa estéreis | VWR | 28145-477 | Usado com seringa BD para seringa de esterilização por filtro |
| BD | 302832 | Usado com filtros de seringa estéril VWR para esterilização por fliter-esterilização | |
| Fisher Scientific | 15-460-16Q | ||
| Olympus | CKX41 | ||
| Tubos de centrífuga estéril cônicos de 15 mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Tubos de centrífuga estéril cônicos de 50 mL | ThermoScientific | 339652 |
Referências
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al.
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Reimpressões e permissões
