Artigo de método

Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (

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⸱

DOI:

10.3791/55007

⸱

3 de novembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

Neste artigo

Resumo

Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.

Resumo

A invasão vascular e o extravasamento de células cancerígenas são uma marca registrada da progressão metastática. Os modelos tradicionais in vitro de invasão de endotélio por células cancerígenas normalmente não possuem a dinâmica de fluidos à qual as células invasoras são expostas in vivo. No entanto, sistemas in vivo, como modelos de camundongos, embora mais fisiologicamente relevantes, requerem prazos experimentais mais longos e apresentam desafios únicos associados ao monitoramento e análise de dados. Aqui descrevemos um ensaio de peixe-zebra que busca preencher essa lacuna técnica, permitindo a avaliação rápida da invasão vascular e extravasamento de células cancerígenas. A abordagem envolve a injeção de células cancerígenas fluorescentes no seio pré-cardíaco de embriões transparentes de peixe-zebra de 2 dias, cuja vasculatura é marcada por um repórter fluorescente contrastante. Após a injeção, as células cancerígenas devem sobreviver em circulação e, posteriormente, extravasar dos vasos para os tecidos na região caudal do embrião. As células cancerígenas extravasadas são eficientemente identificadas e pontuadas em embriões vivos por meio de imagens de fluorescência em um ponto de tempo fixo. Esta técnica pode ser modificada para estudar o intravasamento e / ou competição entre uma mistura heterogênea de células cancerígenas, alterando o local da injeção para o saco vitelino. Juntos, esses métodos podem avaliar um comportamento característico das células cancerígenas e ajudar a descobrir mecanismos indicativos de progressão maligna para o fenótipo metastático.

Introdução

A doença metastática é uma das principais causas de mortalidade por cancro e diversos mecanismos que permitem a difusão de células de cancro continuam a ser descobertos 1. Para que uma célula cancerosa para metastizar com sucesso, ele deve primeiro invadir através do estroma que rodeia um tumor primário, introduzir (intravasate) para o sistema circulatório, sobreviver em trânsito, saída (extravasamento) a partir da circulação, e, por último, estabelecer uma colónia viáveis no local do órgão distante 2. Intravasation e extravasamento são, assim, passos cruciais na cascata metastática, mas cada célula cancerosa não é inerentemente adepto de interromper e migrando através de junções endoteliais 3. De facto, há uma série de pressões de selecção únicas que circundam invasão vascular de células de cancro e o processo pode ser ainda influenciada por uma variedade de factores endógenos e exógenos 4. Por estas razões, as técnicas que sondam o comportamento agressivo de câncer em estágio avançado, muitas vezes se concentrar em vascular capacidade invasiva como um meio para prever a propagação metastática.

Existem vários sistemas de modelo para facilitar o estudo de invasão vascular de células de cancro in vitro. Os mais utilizados em ensaios in vitro envolvem ou sistemas Transwell para avaliar a migração de células de cancro por meio de uma barreira endotelial ou 5 tecnologia celular Eléctrica-Substrato Impedância de detecção (ECIS) para monitorar a interrupção em tempo real de uma monocamada endotelial intacta por células cancerosas 6. Estes ensaios normalmente não têm a dinâmica dos fluidos e fatores estromais que de outra forma afetar a fixação de células de câncer para uma parede endotelial. Este problema é um pouco iludida por redes vasculares perfusable que surgem a partir da cultura 3D do endotélio com o apoio de células do estroma, e estes sistemas microfluídicos 3D agora representam a vanguarda das atuais in vitro opções de 7,8. Ainda, estas abordagens omitir o microambiente robusta de um sistema circulatório funcionale, portanto, apenas em substituto parcial para os modelos in vivo.

O mais amplamente usado no modelo in vivo de invasão vascular é o rato, em que os ensaios experimentais de metástases são normalmente executada porque eles ocorrem em escalas de tempo relativamente curtos e são geralmente indicativas da capacidade metastática 9. Estes ensaios envolvem injeção direta de células cancerígenas em circulação e, portanto, modelar os estágios finais de metástase, ou seja, extravasamento e célula cancerosa colonização de órgãos. Os ensaios experimentais de metástase diferem de acordo com o local da injecção de células de cancro e em última análise, os órgãos analisados. No primeiro tipo de ensaio, as células cancerosas são injectados na veia da cauda de ratos e sementeira de células de cancro nos pulmões é monitorizada 10,11. O segundo ensaio envolve a execução de injecções intracardíaca para dirigir a sementeira metastática para o microambiente do osso 12-14, mas também no cérebro 15. No terceiro ensaio, cancro cells são injectados no baço, a fim de permitir a colonização do fígado 16, enquanto que a quarta via de administração para dentro da artéria carótida transporta as células cancerosas do cérebro 17,18. Independentemente do método de entrega de células de cancro, a colonização de órgãos é o ponto de extremidade experimental aceite e é geralmente determinada através da luminescência, histologia, ou técnicas baseadas em PCR. Apesar das vantagens fisiológicas de condução de ensaios experimentais de metástases dentro de um hospedeiro murino, estas experiências continuam a exigir semanas a meses para completar e analisar.

O modelo de peixe-zebra (Danio rerio) surgiu recentemente como um novo sistema para estudar a progressão do câncer 19,20, e permite a avaliação de invasão vascular de células cancerígenas dentro de um sistema circulatório funcional através de uma escala de tempo muito mais curto, quando comparado com camundongos 21-24. O método utiliza uma cepa zebrafish transparente que tem a sua endotélio marcado com um fluo recife de coral verderepórter proteína rescent dirigido pelo promotor kdrl, o receptor de peixes-zebra para o factor de crescimento endotelial vascular 25. No ensaio, as células cancerosas são marcadas com um marcador fluorescente vermelha e injectada no seio de 2-precardiac embriões dia de idade. Em qualquer lugar entre 48 a 96 horas após a injecção, as células cancerosas que invadiram fora da vasculatura e para dentro da região caudal de embriões podem ser marcados de forma eficiente num microscópio de fluorescência. Aqui nós aplicamos a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama humano comumente utilizados para demonstrar grandes diferenças em sua capacidade invasiva vascular. Além disso, nós demonstramos que a mudança do local de injecção ao saco vitelino de embriões permite o estudo de interacções de células heterogéneas, como as populações de células de cancro podem ser diferencialmente marcadas com corantes fluorescentes e injectado em embriões de peixe-zebra que faltam vasculatura fluorescente. Neste último ensaio, as células cancerosas que invadiram a gema e intravasated no vasculature são marcados na região caudal de 24 a 48 horas após a injeção. Devido à eficácia e conveniência de este modelo, peixe-zebra são cada vez mais utilizados para testar rapidamente a capacidade invasiva vascular das células cancerosas sob um ambiente fisiológico.

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Protocolo

Declaração de Ética: Zebrafish embriões foram gerados de acordo com um protocolo aprovado IACUC. Estes experimentos foram realizados em conformidade com as recomendações do Comité Animal Care e Use da Universidade Georgetown.

1. Organize embriões para injeção e criar soluções de Stock

  1. Gerar larvas do peixe requisito para avaliar a invasão vascular célula cancerosa.
    1. Configurar por pares ou grupo em-cross acasalamento com Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 peixe.
      NOTA: Geramos Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 peixe-zebra, cruzando Tg (kdrl: grcfp) Zn1 25, que expressam recife verde proteína fluorescente coral nas células endoteliais, com uma linha que não tem células de pigmento, mitfa b692; ednrb1 b140, desenvolvido no Centro de Recursos internacionais Zebrafish.
    2. coovos llect, limpo, e remover embriões não fertilizados ou deformados no dia seguinte 22.
    3. Incubar em embriões de 28,5 ° C até estar pronto para a injecção com células cancerosas, para ocorrer quando os embriões de peixe-zebra são 2-dias pós-fertilização (2 dpf).
  2. Faça placas de injeção.
    1. Derreter 25 ml de agarose a 1,5% em dH2O para cada placa.
    2. Pour 12 ml da agarose em 100 mm x 15 mm de placa de petri e deixa endurecer.
    3. Re-derreter, em seguida, despeje o agarose restantes na placa.
    4. posição imediatamente um molde de corte de vidro (3 mm x 7,2 cm de largura x 7,5 cm de comprimento) de modo a que forme um ângulo de 30 graus com a agarose e posicionada no centro da placa.
      NOTA: Isto irá criar uma íngreme 60 ° parede e uma rampa inclinada de 30 °.
    5. Tape o molde de vidro no lugar e deixe endurecer agarose.
    6. Remova cuidadosamente o molde de vidro e ter cuidado para não rasgar o agarose.
      NOTA: Os moldes podem ser armazenados em dH 2 O a 4 ° C.
  3. Equilibrar placa de injeção com água de peixe (0,3 g / L de sal do mar).
    1. placa de enxaguamento duas vezes com água destilada.
    2. Equilibrar placa por adição de 10 ml de água de peixe e para a placa lugar num agitador durante 10 min.
    3. Equilibrar placa uma segunda vez com água peixe.
  4. Dividir pós-fertilização (DPF) embriões de 2 dias em grupos de injeção, transferindo-os em pratos que contenham água de peixe 22.
  5. Preparar pratos de recuperação para cada grupo a utilizar após a injecção. Certifique-se de que o prato de recuperação contém 10 ml de água de peixe, mais penicilina (25 ug / ml) e estreptomicina (50 ug / ml).
  6. Preparar a solução tricaina 2x por adição de 4 ml de estoque tricaina tamponada (4 mg / ml, Tris 10 mM, pH 7) a 50 ml de água de peixe mais penicilina e estreptomicina.
  7. Dissolve-se 15 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 10 ml de solução 2x tricaina para gerar um meio de montagem que anestésico irá imobilizar embriões vivos para Imaging.
    NOTA: Meio de montagem é composto de 1,5% de agarose.
  8. Puxar agulhas microinjeção.
    1. Coloque tubos capilares de vidro em um extrator pipeta vertical. Puxe pipetas longa cônico utilizando 20 mAmp atual e um elemento de aquecimento 2-coil.

2. Células cancerosas marcação com corante fluorescente lipofílico

  1. Manter as células cancerosas em suas condições de cultivo recomendadas.
    NOTA: Estas linhas foram mantidas em DMEM + FBS a 10%: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 e SK-BR-3. Estas linhas foram mantidas em meio RPMI + 10% de FBS: HCC 1806 e T-47D. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a incubação.
  2. Gerar uma suspensão de uma única célula, dissociando-se uma cultura aderente de células cancerosas.
    1. Lave as células primeiro com PBS e, em seguida, trata-se com uma solução de tripsina-EDTA a 0,05%.
      NOTA: tempo de exposição Tripsina dependerá da linha celular.
    2. Neutraliza-se a solução de tripsina com SEmeios de cultura celular após as células desanexar contendo rum.
  3. Centrifugar a suspensão de células de tripsina neutralizada por 5 min a 200 x g, seguida ressuspender o sedimento de células em meio de cultura fresco para contagem das células.
  4. Contagem de suspensão de células utilizando um contador automático e preparar a 1 milhão de células em 200 ul de meio de cultura celular.
    1. Verificar a viabilidade celular com trypan exclusão do corante azul antes da injeção em embriões de peixe-zebra.
      NOTA: Apenas populações de células viáveis ​​deve ser injetado em embriões de peixe-zebra, como a injeção de células mortas não refletem verdadeira invasão vascular.
  5. Adicionar 2 ul de corante lipofílico vermelho para a suspensão de células de cancro para uma diluição de 1: 100, misturar bem, e, em seguida, incuba-se a mistura a 37 ° C durante 20 min.
    NOTA: A concentração do corante e tempo de rotulagem pode precisar de ser optimizada para cada linha de células.
  6. Após a incubação, adicionar 1 ml de meio fresco para o tubo e, em seguida, centrifuga-se durante 5 min a200 x g.
  7. Lavar corante fluorescente residual das células cancerosas.
    1. Aspirar o sobrenadante do sedimento de células, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de cultura fresco, e centrifuga-se durante 5 min a 200 x g.
    2. Repetir o passo de lavagem uma segunda vez: aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio fresco e em seguida centrifugar novamente durante 5 min a 200 x g.
    3. Repetir o passo de lavagem terceira vez: aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio fresco e em seguida centrifugar novamente durante 5 min a 200 x g.
  8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células contendo 1 milhão de células cancerosas marcadas em 500 uL de meio fresco.
    NOTA: 0,5 mM de EDTA pode ser adicionado ao meio para evitar a aglutinação de células.

3. Células cancerosas injetar na Sinus Pré-cardíaca de embriões Zebrafish

  1. Anexar sistema de distribuição de microinjeção a uma fonte de ar pressurizado e ligue the microinjecção fonte de alimentação do sistema de distribuição.
    1. pressão de teste pressionando o pedal. Um breve pulso de ar deve emitir a partir de suporte da agulha.
  2. Equilibrar as placas de injecção duas vezes com a solução 2x tricaina.
    1. Para cada passo de equilibração, adicionar 20 ml de solução 2x tricaina à placa de injecção e lugar num agitador durante 10 min.
  3. Usar uma pipeta de plástico para transferir um grupo de embriões para um pequeno prato contendo a solução 2x tricaina.
  4. Aterrar a agulha de injeção microinjeção com células cancerosas utilizando uma ponta de pipeta gel-loading.
    1. Coloque a agulha em um recipiente de armazenamento de eletrodo com a ponta virada para baixo assim que as células se estabelecer perto da ponta.
  5. Transferir 20 - 30 embriões anestesiados para uma placa de injeção, recolhendo os embriões com abundância de 2x tricaina em uma pipeta de plástico.
    1. Permitir que embriões para se instalar na ponta da pipeta.
    2. cavalheiroLY expulsar embriões na calha da placa de injecção, espalhando-se os embriões ao longo do comprimento da calha.
    3. Alinhar embriões com cabeças voltadas para cima e barrigas de frente para a parede íngreme da calha.
      NOTA: solução tricaina deve abranger tanto o comprimento da calha ea superfície agarose plana, com embriões única residente no cocho. Embriões está agora pronto para a injecção.
  6. Injectar 50 - 100 células cancerosas (2-5 nl) no seio precardiac dos embriões de peixe-zebra utilizando o sistema de micro-injecção de distribuição.
    1. Coloque a agulha ao suporte de agulha de um micromanipulador.
    2. Posicione a placa de injecção sob a estereoscópio com a parede de 60 graus para a esquerda e se concentrar no topo embrião no 25x.
    3. Posicionar o micromanipulador de modo que, quando estendida, a agulha vai perfurar o embrião.
    4. Estender a agulha de olho até que seja quase tocando o embrião.
    5. Olhando sob o microscópio, alinhe a agulha de modo tchapéu que vai perfurar o embrião após nova extensão.
    6. Pierce o embrião através do saco vitelino colocando a ponta apenas em, mas não no, o seio pré-cardíaca.
    7. Injectar células de pressionar o pedal de pé. A força da injecção expele as células para dentro do seio cardíaca. Retrair a agulha.
    8. Usando a mão direita, estender e retrair a agulha de injeção. Com a mão esquerda, fazer ajustes finos para a posição seguinte embrião.
    9. Voltar a agulha para o frasco de armazenamento eletrodo durante a configuração para injetar outra placa.
  7. Transferir os embriões para o prato de recuperação uma vez que toda a placa é injectado.
    1. Incline a placa de injecção para reunir os embriões na parte inferior, lavando quaisquer embriões restantes para fora da calha, e recolhendo-os com a pipeta de plástico.
    2. Permitir que os embriões para se instalar na parte inferior da pipeta.
    3. Transferir os embriões para o prato de recuperação num volume mínimo de tricaina.
  8. Incubate prato recuperação a 28 ° C durante 1 h.
    1. Separados embriões de peixe-zebra viáveis ​​a partir de embriões mortos e outros detritos.
  9. Incubar prato a 33 ° C até que esteja pronto para a pontuação, normalmente 24-96 horas.
    NOTA: Este valor é determinado como um compromisso entre 37 ° C, a temperatura ideal para as células cancerígenas, e 28,5 ° C, a temperatura ideal para o peixe-zebra.

4. Pontuação extravasamento

  1. Anestesiar o lote de embriões a ser marcado, colocando-os em um prato com uma solução tricaina.
  2. Coloque um larvas anestesiados em uma lâmina de microscopia de depressão em uma gota de tricaina.
    1. larvas Orient lateralmente para imagiologia óptima da região caudal.
  3. Contar o número de células cancerosas que invadiram com sucesso fora da vasculatura, concentrando-se para cima e para baixo através da região da cauda de discernir claramente células intactas.
    NOTA: É melhor ter pelo menos dois indivíduos envolvidos em tseu processo, em que o indivíduo marcando o peixe é cego para a condição experimental que está sendo avaliada.
    1. Pontuação larvas num microscópio de fluorescência composto com a lente objectiva de 10x. Use o objetivo de 20x para todas as chamadas difíceis.

5. Embriões de montagem em lâminas e imagens de fluorescência subsequente

  1. Derreter solução de agarose / tricaina 1,5% e levar a 37 ° C.
  2. Anestesiar o embrião a ser trabalhada, colocando-o em solução tricaina.
  3. Transferir o embrião de uma gota de solução tricaina à superfície da imagem. Opcionalmente, use um prato ou lâmina de microscópio com fundo de vidro.
  4. Usar uma pipeta de vidro para remover o excesso de solução tricaina, retendo o embrião sobre a superfície da imagem.
  5. Sobrepor uma gota da solução de agarose fundida sobre o embrião.
  6. Rapidamente, antes da agarose polimeriza, use uma ferramenta delicada, como uma escova de cílios, para orientar o embrião lateralmente para geração de imagens, dando um cuidado extrapara garantir que o embrião é achatada ao longo da superfície da imagem.
  7. Mergulhe a queda de agarose agora polimerizado sob solução tricaina.
  8. Sujeitar o embrião de peixe-zebra ao vivo para imagens microscópicas.

6. Modificação: A injecção de células de câncer na gema Sac de embriões Zebrafish

  1. Preparar o sistema de injecção e placas de micro-injecção do dispensador como descrito anteriormente na secção (3) do presente protocolo.
  2. Rotular duas populações de células contrastando com corantes fluorescentes, como descrito anteriormente na secção (2) do presente protocolo.
  3. Injectar 5 - 10 nl de 2 x 10 ^ 7 células / ml para o saco vitelino. Manter constante o volume de injecção para injectar os números de células idênticas (100 - 200 células cancerígenas) a partir de cada população de células
    Nota: Pode utilizar-se embriões de peixe-zebra que faltam transparentes vasculatura fluorescente para este ensaio. entrada passiva de partículas na vasculatura pode ser controlada por, injectando partículas fluorescentes (<10 um) ou, alternativamente, uma linha de células que não intravsate.
  4. Recuperar os embriões injectados como descrito anteriormente na secção (3) do presente protocolo e, em seguida, a tela para injectáveis ​​bem sucedidas.
    1. Use um estereoscópio para triagem e transferência de embriões viáveis ​​que foram injetados com sucesso a um novo prato.
      NOTA: Todos os embriões devem ter uma massa dimensionados de forma consistente de células localizadas na gema. Os embriões são descartados se o tamanho de massa diferente ou se quaisquer células estão localizados fora da gema.
    2. Transferir os embriões viáveis ​​a um novo prato se as células cancerosas são claramente vistos no saco vitelino.
  5. Incubar prato a 33 ° C até que esteja pronto para marcar, tipicamente 24 - 48 h.
    NOTA: Este valor é determinado como um compromisso entre 37 ° C, a temperatura ideal para as células cancerígenas, e 28,5 ° C, a temperatura ideal para o peixe-zebra.
  6. Para marcar intravasation, siga as orientações descritas na secção (4) deste protocolo, mas em vez disso contar o número de ccélulas Ancer que invadiram com sucesso na vasculatura da região caudal.

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Resultados

Aqui nós testamos a capacidade invasiva vascular de linhas celulares de cancro da mama habitualmente utilizada num modelo de embrião do peixe-zebra (Figura 1). rigorosos critérios foram empregados em extravasamento de pontuação para estas linhas celulares diferentes, onde os eventos positivos só foram contados se as células cancerosas tinha claramente extravasada, este ser feito principalmente a limitar os falsos positivos que podem surgir com marcando restos celulares. ...

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Discussão

Esta técnica utiliza o modelo de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular (ver Figura 1). Aqui nós aplicada a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama a fim de fornecer uma linha de base sobre a qual outros investigadores pode então construir os seus próprios estudos (ver Tabela 1 e Figuras 2 - 3). A observação de que as células MDA-MB-231 facilmente invadidas na região caudal de embriões de peixe-z...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Peter Johnson, do Núcleo de Microscopia da Universidade de Georgetown, pela assistência na imagem dos embriões de peixe-zebra. O Recurso Compartilhado de Microscopia e Imagem e o Recurso Compartilhado de Peixe-Zebra são parcialmente apoiados pela concessão P30-CA051008 do NIH / NCI. Este trabalho também foi apoiado pelo NIH / NCI CA71508 (AW) e CA177466 (AW).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina-EDTALife Technologies25300-054
Pratos de 100 mmCorning Incorporated3160-100
Pipetas de pastur descartáveis de 5 3/4", vidro de borossilicato MarcaFisher13-678-20B
Prato de 60 mmCorning Incorporated3160-60
Agarose, Baixo DerretimentoFisherBP165-25
Agarose, Vidro CapilarBiolineBIO-41026
Molecular, Padrão, 1.2 mm x 0.68 mm, 4"A-M Systems, Inc627000
David Kopf 700C Extrator de Pipeta VerticalHofstra Group3600
DMEMLife Technologies11995-065
Jarra de Armazenamento de Eletrodos, 1.0 mmWorld Precision Instruments, IncE210
Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Tricaína, MS-222)FlukaA5040
Ted Pella, Inc113
Soro Bovino Fetal, Inativado por CalorOmega ScientificFB-12
Pipetas de Transferência FisherbrandThermoFisher Scientific13-711-7M
Pontas de Pipeta de Carregamento de GelPratosFisher Brand 02-707-181
(12.0 mm)ThermoFisher Scientific150680
Lâmina de Depressão de VidroVWR470005-634
Sal Oceanográfico Instantâneo, Sal MarinhoPentairIS50
, 2 ml, Pacote de 72Heathrow ScientificHS20622B
SP8Leica
MicromanipuladorNarishige
Eclipse E600Nikon
PBSLife Technologies10010-023
Penicilina-G PotássioFisher BiotechBP914-100
100 mm x 15 mmMarca Fisher 
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640 Médio Life Technologies11875-093
Sulfato de EstreptomicinaFisher BiotechBP910-50
Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiOThermoFisher ScientificV22886
Zebrafish compartilhados do peixe-zebra de Georgetown
foram mantidas em DMEM + 10% FBS, com a expectativa de células BT-474 e HCC18-6, que foram mantidas em RPMI + 10% FBS.
de GrauEscova de cílios de Fundo de Vidro Lâmpadas de Borracha de Látex Microscópio Confocal Placas de Petri , FB0875713As linhagens celulares de recursos

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