Artigo de método
Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.
A invasão vascular e o extravasamento de células cancerígenas são uma marca registrada da progressão metastática. Os modelos tradicionais in vitro de invasão de endotélio por células cancerígenas normalmente não possuem a dinâmica de fluidos à qual as células invasoras são expostas in vivo. No entanto, sistemas in vivo, como modelos de camundongos, embora mais fisiologicamente relevantes, requerem prazos experimentais mais longos e apresentam desafios únicos associados ao monitoramento e análise de dados. Aqui descrevemos um ensaio de peixe-zebra que busca preencher essa lacuna técnica, permitindo a avaliação rápida da invasão vascular e extravasamento de células cancerígenas. A abordagem envolve a injeção de células cancerígenas fluorescentes no seio pré-cardíaco de embriões transparentes de peixe-zebra de 2 dias, cuja vasculatura é marcada por um repórter fluorescente contrastante. Após a injeção, as células cancerígenas devem sobreviver em circulação e, posteriormente, extravasar dos vasos para os tecidos na região caudal do embrião. As células cancerígenas extravasadas são eficientemente identificadas e pontuadas em embriões vivos por meio de imagens de fluorescência em um ponto de tempo fixo. Esta técnica pode ser modificada para estudar o intravasamento e / ou competição entre uma mistura heterogênea de células cancerígenas, alterando o local da injeção para o saco vitelino. Juntos, esses métodos podem avaliar um comportamento característico das células cancerígenas e ajudar a descobrir mecanismos indicativos de progressão maligna para o fenótipo metastático.
A doença metastática é uma das principais causas de mortalidade por cancro e diversos mecanismos que permitem a difusão de células de cancro continuam a ser descobertos 1. Para que uma célula cancerosa para metastizar com sucesso, ele deve primeiro invadir através do estroma que rodeia um tumor primário, introduzir (intravasate) para o sistema circulatório, sobreviver em trânsito, saída (extravasamento) a partir da circulação, e, por último, estabelecer uma colónia viáveis no local do órgão distante 2. Intravasation e extravasamento são, assim, passos cruciais na cascata metastática, mas cada célula cancerosa não é inerentemente adepto de interr....
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Declaração de Ética: Zebrafish embriões foram gerados de acordo com um protocolo aprovado IACUC. Estes experimentos foram realizados em conformidade com as recomendações do Comité Animal Care e Use da Universidade Georgetown.
1. Organize embriões para injeção e criar soluções de Stock
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Aqui nós testamos a capacidade invasiva vascular de linhas celulares de cancro da mama habitualmente utilizada num modelo de embrião do peixe-zebra (Figura 1). rigorosos critérios foram empregados em extravasamento de pontuação para estas linhas celulares diferentes, onde os eventos positivos só foram contados se as células cancerosas tinha claramente extravasada, este ser feito principalmente a limitar os falsos positivos que podem surgir com marcando restos celulares. .......
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Esta técnica utiliza o modelo de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular (ver Figura 1). Aqui nós aplicada a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama a fim de fornecer uma linha de base sobre a qual outros investigadores pode então construir os seus próprios estudos (ver Tabela 1 e Figuras 2 - 3). A observação de que as células MDA-MB-231 facilmente invadidas na região caudal de embriões de peixe-z.......
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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecemos a Peter Johnson, do Núcleo de Microscopia da Universidade de Georgetown, pela assistência na imagem dos embriões de peixe-zebra. O Recurso Compartilhado de Microscopia e Imagem e o Recurso Compartilhado de Peixe-Zebra são parcialmente apoiados pela concessão P30-CA051008 do NIH / NCI. Este trabalho também foi apoiado pelo NIH / NCI CA71508 (AW) e CA177466 (AW).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Pratos de 100 mm | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| Pipetas de pastur descartáveis de 5 3/4", vidro de borossilicato Marca | Fisher | 13-678-20B | |
| Prato de 60 mm | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Baixo Derretimento | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Vidro Capilar | Bioline | BIO-41026 | |
| Molecular, Padrão, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Extrator de Pipeta Vertical | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Jarra de Armazenamento de Eletrodos, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Tricaína, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Ted Pella, Inc | 113 | ||
| Soro Bovino Fetal, Inativado por Calor | Omega Scientific | FB-12 | |
| Pipetas de Transferência Fisherbrand | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Pontas de Pipeta de Carregamento de Gel | Pratos | Fisher Brand 02-707-181 | |
| (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Lâmina de Depressão de Vidro | VWR | 470005-634 | |
| Sal Oceanográfico Instantâneo, Sal Marinho | Pentair | IS50 | |
| , 2 ml, Pacote de 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 | Leica | ||
| Micromanipulador | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicilina-G Potássio | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| 100 mm x 15 mm | Marca Fisher | ||
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Médio | Life Technologies | 11875-093 | |
| Sulfato de Estreptomicina | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | compartilhados do peixe-zebra de Georgetown | ||
| foram mantidas em DMEM + 10% FBS, com a expectativa de células BT-474 e HCC18-6, que foram mantidas em RPMI + 10% FBS. |
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