Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

Resumo

Conseguimos estabelecer um método para isolamento de RNA de sementes de plantas contendo grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis, que têm efeitos inibitórios no isolamento de RNA de alta pureza. Nosso método é adequado para monitorar a expressão de genes com transcritos de baixo nível em sementes.

Resumo

As sementes das plantas acumulam grandes quantidades de reservas de armazenamento contendo matéria orgânica biodegradável. Os humanos dependem de reservas de armazenamento de sementes para alimentos e materiais industriais. Os perfis de expressão gênica são ferramentas poderosas para investigar a regulação metabólica em células vegetais. Portanto, perfis de expressão gênica detalhados e precisos durante o desenvolvimento da semente são necessários para o melhoramento de culturas. A aquisição de RNA altamente purificado é essencial para a produção desses perfis. Métodos eficientes são necessários para isolar o RNA altamente purificado das sementes. Aqui, descrevemos um método para isolar RNA de sementes contendo grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis, que têm efeitos inibitórios no isolamento de RNA de alta pureza. Nosso método permite que RNA altamente purificado seja obtido de sementes sem o uso de fenol, clorofórmio ou processos adicionais para purificação de RNA. Este método é aplicável a sementes de Arabidopsis, colza e soja. Nosso método será útil para monitorar os padrões de expressão de transcritos de baixo nível em sementes em desenvolvimento e maduras.

Introdução

As plantas produzem sementes, que dão origem à próxima geração. Sementes acumular grandes quantidades de reservas de armazenagem, tais como óleos, hidratos de carbono e proteínas, para o crescimento pós-germinativo. Os seres humanos utilizar as reservas de armazenamento de sementes como fontes de alimentos e ração animal, e, portanto, sementes de plantas são um dos principais fornecedores de matéria orgânica comestível em todo o mundo. Aumentar a produção de sementes é um desafio importante na ciência das plantas.

Desde reservas de conservação das sementes são fontes de valor comercial de alimentos e materiais industriais, os mecanismos moleculares subjacentes à regulação do metabolismo destas reservas têm sido amplamente investigadas ^1-6. Além disso elucidação desses mecanismos será útil para aumentar a produção de sementes de culturas. Sementes se desenvolvem nos ovários de plantas após a fertilização, e eles amadurecem através de uma série de estágios de desenvolvimento ^1,6,7. Para compreender melhor o desenvolvimento mecanismo molecular subjacente de sementes requer detalhada, Perfis de expressão de gene precisas de uma série de desenvolvimento de sementes a ser produzido. No entanto, as elevadas quantidades de óleos, proteínas, hidratos de carbono, e polifenóis em sementes de plantas tornar-se difícil de isolar ARN altamente purificada, o que se opõe perfil preciso da expressão do gene.

Aqui, nós apresentamos um método eficiente para o isolamento de ARN a partir de sementes oleaginosas que contenham grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis. Usando este método, os pesquisadores serão capazes de preparar RNA altamente purificada. Tal RNA será útil para monitorar mudanças de transcrição dos genes-chave que controlam a regulação metabólica das reservas de armazenagem de sementes no desenvolvimento e oleaginosas maduras.

Protocolo

1. Extracção do ARN total de sementes de plantas

1. Prepare conjuntos de buffer, colunas de spin, 1,5 e 2,0 tubos de polipropileno ml, e tubos de 1,5 mL de polipropileno livre de nuclease.
2. Adicionar 1% (w / v) de polivinilpirrolidona de grau de biologia molecular (daqui em diante referida como PVP) para a célula de tampão de lise para extracção de ARN e vortex vigorosamente. Incubar durante 20 min a 25 ° C para dissolver completamente. Após 20 min de incubação, misturam suavemente o tampão, rodando o tubo de cabeça para baixo para evitar a formação de bolhas. Armazenar à temperatura ambiente (15-25 ° C) antes do uso.
3. Frutos da colheita de plantas de Arabidopsis thaliana e coloque em 1,5 tubos de polipropileno ml em gelo. Coloque frutas em placas de alumínio mantida a 4 ° C e isolar a partir de sementes de frutos sob um microscópio estéreo.
   1. Coloque as sementes isoladas (aproximadamente 200 sementes) em tubos de polipropileno de 1,5 ml, que foram armazenados num bastidor de alumínio em gelo e imediatamente colocar os tubos em N líquidoitrogen.
4. Retire os tubos do azoto líquido e devolvê-las para a cremalheira de alumínio em gelo. Adicionar 100 ul da solução tampão contendo 1% de PVP e centrifugar durante 1 min a 1000 xg, a 4 ° C.
5. Homogeneizar a amostra com um pilão de aço inoxidável usando um motor-moedor durante 60 s ao mesmo tempo manter o tubo no suporte de alumínio em gelo.
6. Adicionar 550 ul da solução tampão contendo 1% de PVP, misturar suavemente o tampão, rodando o tubo de cabeça para baixo, e incubar durante 10 min a 25 ° C.
7. Centrifugar durante 5 minutos a 8000 xg a 25 ° C e transferência de 550 uL do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
8. Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg, a 25 ° C e transferência de 450 uL do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
9. Utilizar o sobrenadante como o lisado de células para extracção de ARN. Daqui por diante, seguir o processo descrito nas instruções do fabricante no kit disponível comercialmente.
10. Elui-se oRNA usando um volume mínimo de tampão de eluição para assegurar uma concentração suficientemente elevada de ARN para monitorizar os padrões de transcritos de baixo nível de expressão. Armazenar o ARN num congelador, até ser utilizado.

2. A verificação da RNA Qualidade

1. Descongelar o RNA total, misture agitando ligeiramente, e colocar o tubo em um rack de alumínio no gelo.
2. Medir a concentração de ARN, razão A260 / A280 e razão A260 / A230 usando um espectrofotómetro microvolume.
3. Dilui-se o ARN total em água isenta de ARNase para uma concentração final de 70 ng / mL.

3. transcrição reversa do ARN total a partir de sementes

1. Descongelar o RNA total e tampão conjuntos do kit comercial. Mantenha as enzimas do kit no gelo depois de toque suave. Prepare tubos de 0,2 mL de polipropileno livre de nuclease.
2. Adicionar 5 uL de ARN total, 1 ul de iniciador oligo dT (50 uM), e 1 uM de 6-meros aleatórios (50 uM) ao polypropy 0,2 mltubo de lene no gelo.
3. Incubar durante 15 min a 37 ° C e colocar em gelo.
4. Daqui por diante, seguir o processo descrito nas instruções do fabricante no kit de transcrição reversa-PCR.
5. Coloque os produtos de transcrição reversa em gelo antes do uso.

4. Análise Quantitativa-PCR em tempo real

1. Construção de plasmídeos que albergam as sequências de genes alvo utilizando o protocolo do fabricante.
2. Ajustar as concentrações de 100-500,000 cópias / mL para moldes de ADN para as curvas padrão.
3. Dilui-se as soluções de cDNA (1: 100) com água destilada.
4. Adicionar 2 mL das soluções diluídas de ADNc e os plasmídeos para as curvas padrão para a mistura principal a partir do kit em tempo real quantitativa de PCR.
5. Definir-se-PCR em tempo real usando as seguintes condições de ciclo: 95 ° C durante 30 s e depois 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 35 s.
6. Analisar os números de cópias de acordo com o homeminstruções do ufacturer para o sistema de PCR em tempo real.

Resultados

Em primeiro lugar, investigou a melhor concentração de PVP usando Arabidopsis sementes maduras. O ARN total foi isolado a partir de cerca de 1000 sementes de acordo com o protocolo descrito acima, utilizando tampão de lise celular contendo 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de PVP. Após homogeneização e centrifugação, o sobrenadante foi recolhido, evitando a camada de óleo e detritos de sementes (Figura 1A).

Discussão

perfis de expressão gênica contribuir para a nossa compreensão da fisiologia da planta; Assim, os métodos de isolamento de ARN específico foram desenvolvidas de cada amostra condição ^9-12. Foram investigados os processos que foram inibidas durante o isolamento de ARN a partir de sementes e descobriram que o RNA se ligar a membranas de sílica foi severamente inibido. Grandes quantidades de óleo, proteínas e polifenóis inibem isolamento do RNA. Nós modificámos o processo de extracção de ARN para remover estes c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polivinilpirrolidona	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGENEIZADOR S-303	COMO UM	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Kit de qPCR rápido	Kapa biosystems	KK4601