Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Resumo

Este artigo descreve um método para estudar o metabolismo celular em comunidades complexas de vários tipos de células, usando uma combinação de rastreamento de isótopos estáveis, classificação de células para isolar tipos específicos de células e espectrometria de massa.

Resumo

Os tipos de células de mamíferos exibem metabolismo especializado, e há ampla evidência de que vários tipos de células coexistentes se envolvem em cooperação metabólica. Além disso, mesmo culturas de um único tipo de célula podem conter células em estados metabólicos distintos, como células em repouso ou em ciclo. Métodos para medir as atividades metabólicas de tais subpopulações são ferramentas valiosas para entender o metabolismo celular. Populações de células complexas são mais comumente separadas usando um classificador de células, e subpopulações isoladas por este método podem ser analisadas por métodos metabolômicos. No entanto, um problema com essa abordagem é que o procedimento de classificação de células sujeita as células a estresses que podem distorcer seu metabolismo.

Para superar esses problemas, raciocinamos que as distribuições de massa de isotômeros (MIDs) de metabólitos de células cultivadas com nutrientes marcados com isótopos estáveis provavelmente são mais estáveis do que as concentrações absolutas de metabólitos, porque os MIDs são formados em escalas de tempo mais longas e devem ser menos afetados pela exposição de curto prazo a condições de classificação celular. Aqui, descrevemos um método baseado nesse princípio, combinando classificação de células com cromatografia líquida - espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS). O procedimento envolve a análise de três tipos de amostras: (1) extratos de metabólitos obtidos diretamente da população complexa; (2) extratos de células "simuladas" passaram pelo instrumento classificador de células sem bloquear nenhuma população específica; e (3) extratos das populações classificadas reais. As células classificadas simuladas são comparadas com a extração direta para verificar se os MIDs não são de fato alterados pelo próprio procedimento de classificação de células, antes de analisar as populações classificadas reais. Mostramos exemplos de resultados de células HeLa classificadas de acordo com a fase do ciclo celular, revelando mudanças no metabolismo de nucleotídeos.

Introdução

organismos superiores contêm comunidades complexas de tipos de células distintas que colaboram para funções mais complexas. Por exemplo, tumores contêm não só as células cancerosas, mas também fibroblastos, células que constituem os vasos sanguíneos, e muitas vezes de células imunes infiltrados ^1; sangue contém uma mistura complexa de dezenas de subtipos de células imunológicas ^2; e ainda linhas de células cultivadas pode ser constituída por várias subpopulações, tal como o lúmen e subtipos de células basais do cancro da mama ^3. Além disso, os tipos de células distintas que coexistem podem exibir....

Protocolo

1. metabolito Extração

1. Extração de prato
   1. células de cultura em uma placa de 6 poços em triplicado em isótopos marcados meios de cultura estáveis ​​+ suplementos dialisados ​​(soro ou outros suplementos de crescimento) até que as células se tornam 75% confluentes.
      NOTA: Aqui cultura de células HeLa, durante 48 h em RPMI contendo 40% U- ¹³ C-glicose e 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N2-glutamina e 5% de FBS dialisado (Soro Bovino Fetal). FBS dialisado é usado para se livrar dos pequenos metabólitos peso molecular que possam contaminar os meios de comunicação rotulados. células em suplemento dialisada antes da....

Resultados

Como um exemplo, aqui descrevemos uma experiência investigar o metabolismo das células HeLa classificados de acordo com a fase do ciclo celular. Para identificar uma grande variedade de metabolitos centrais em ambos os átomos de carbono e átomos de azoto, que as células cultivadas durante 48 h, usando U- ¹³ C-glicose e U- ¹³ C, ¹⁵ N-glutamina como marcadores. Para obter MIDs ricos para a experiência de validação, que escolheu uma mistura de 40% U- ^13.......

Discussão

O nosso método é baseado no princípio de que em MIDs metabolitos celulares reflectir a "história" de actividades metabólicas de uma célula. Isto faz com que seja possível investigar actividades metabólicas na subpopulação de células, uma vez que ocorreram na comunidade complexo de células, antes do processo de separação de células. Em contraste, as áreas dos picos de metabólitos diferem acentuadamente entre os extratos de células classificadas e extração direta da placa de cultura ^11. E.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)	BD Biosciences
Isótopos de Cambridge	-13C-Glucose	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutamina	isótopos Cambridge	CNLM-1275-H-0.1
Metanol (JT Baker), grau HPLC	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - Filtros centrífugos VV. Durapore PVDF 0.1 µ m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC	Thermo Espectrômetro de
	Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant (150 mm x 4.6  mm, 5 µ m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC Coluna de proteção HILIC (20 mm x 2,1 mm)	Merck KGaA
Acetonitrila Optima LC-MS, vidro âmbar	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q água	Millipore		Produzido com um sistema de gradiente Milli-Q
Myrsyra 99,5% Optima (ácido fórmico)	Fisher Scientific	11423423
Frasco de Parafuso X100 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, âmbar, 100 unidades	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Tampas de rosca)	Thermo Fisher scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Kit de calibração
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10	Wolfram Research

U massa Q-Exactive Orbitrap da Fisher scientific Coluna ZIC HILIC