Artigo de método

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

DOI:

10.3791/55011

⸱

4 de fevereiro de 2017

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1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve um método para estudar o metabolismo celular em comunidades complexas de vários tipos de células, usando uma combinação de rastreamento de isótopos estáveis, classificação de células para isolar tipos específicos de células e espectrometria de massa.

Resumo

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Os tipos de células de mamíferos exibem metabolismo especializado, e há ampla evidência de que vários tipos de células coexistentes se envolvem em cooperação metabólica. Além disso, mesmo culturas de um único tipo de célula podem conter células em estados metabólicos distintos, como células em repouso ou em ciclo. Métodos para medir as atividades metabólicas de tais subpopulações são ferramentas valiosas para entender o metabolismo celular. Populações de células complexas são mais comumente separadas usando um classificador de células, e subpopulações isoladas por este método podem ser analisadas por métodos metabolômicos. No entanto, um problema com essa abordagem é que o procedimento de classificação de células sujeita as células a estresses que podem distorcer seu metabolismo.

Para superar esses problemas, raciocinamos que as distribuições de massa de isotômeros (MIDs) de metabólitos de células cultivadas com nutrientes marcados com isótopos estáveis provavelmente são mais estáveis do que as concentrações absolutas de metabólitos, porque os MIDs são formados em escalas de tempo mais longas e devem ser menos afetados pela exposição de curto prazo a condições de classificação celular. Aqui, descrevemos um método baseado nesse princípio, combinando classificação de células com cromatografia líquida - espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS). O procedimento envolve a análise de três tipos de amostras: (1) extratos de metabólitos obtidos diretamente da população complexa; (2) extratos de células "simuladas" passaram pelo instrumento classificador de células sem bloquear nenhuma população específica; e (3) extratos das populações classificadas reais. As células classificadas simuladas são comparadas com a extração direta para verificar se os MIDs não são de fato alterados pelo próprio procedimento de classificação de células, antes de analisar as populações classificadas reais. Mostramos exemplos de resultados de células HeLa classificadas de acordo com a fase do ciclo celular, revelando mudanças no metabolismo de nucleotídeos.

Introdução

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organismos superiores contêm comunidades complexas de tipos de células distintas que colaboram para funções mais complexas. Por exemplo, tumores contêm não só as células cancerosas, mas também fibroblastos, células que constituem os vasos sanguíneos, e muitas vezes de células imunes infiltrados 1; sangue contém uma mistura complexa de dezenas de subtipos de células imunológicas 2; e ainda linhas de células cultivadas pode ser constituída por várias subpopulações, tal como o lúmen e subtipos de células basais do cancro da mama 3. Além disso, os tipos de células distintas que coexistem podem exibir "colaboração" metabólica. Por exemplo, no cérebro, astrócitos são pensados para converter a glicose em lactato, o qual é, em seguida, "alimentado" para os neurónios que oxidam este substrato 4; Os linfócitos T são, em alguns contextos dependentes de células dendríticas adjacentes como uma fonte de cisteína 5; e as células cancerosas podem colaborar com assofibroblastos ciados em tumores 6. Para compreender o comportamento metabólico de tais sistemas, é essencial para separar e medir as actividades metabólicas dos vários tipos de células presentes.

De longe, o método mais amplamente utilizado para a separação de tipos de células é a classificação de células activadas por fluorescência. Este método é amplamente aplicável, desde que o tipo de célula ou do estado de interesse podem ser "etiquetados" utilizando anticorpos fluorescentes, a expressão de proteínas fluorescentes modificadas, ou outros corantes. Uma opção é tipos de células inicialmente separadas por meio de um classificador de células, re-cultura os tipos de células individuais obtidos, e em seguida, realizar estudos sobre o metabolismo destas culturas 7. No entanto, isto só é possível se o tipo de célula ou fenótipo é estável nas condições de cultura, e não pode captar o comportamento transiente tais como estados do ciclo celular, nem a cooperação metabólica em co-culturas. Para tais casos, o metabolismo deve ser medida directamente no assimcélulas rted. Este é um desafio desde a célula procedimento de triagem submete células a tensões que possam falsear o seu metabolismo 8, e estamos cientes de apenas alguns estudos que tomam esta abordagem 9, 10. Em particular, verificou-se que os principais metabolitos, tais como aminoácidos pode vazar a partir de células mantidas em tampão de separação de células, de modo que as medições de abundância metabolito absoluta não são fiáveis 11 (embora comparação relativa entre as fracções ordenadas podem ainda ser valiosos).

Para contornar esses problemas, nós rotulamos células com isótopos estáveis ​​antes de triagem, e focar os MIDs em metabólitos celulares, em vez de abundâncias de metabólitos. Desde MIDs são formados em escalas de tempo mais longos, devem ser menos afetados pela exposição a curto prazo às condições de classificação. Nós quantificar MIDs usando espectrometria de massa de alta resolução-scan completo, que é sensível o suficiente para fornecer data em centenas de metabólitos a partir de cerca de 500.000 células classificadas, necessitando de cerca de 30-60 minutos de tempo de separação de células. Uma comparação entre um "simulada" classificados de controlo (células passados ​​através do instrumento de separação de células, sem qualquer gating população específica) e extracção metabolito directamente a partir da placa de cultura é feita para garantir que os médios observados são representativos daqueles na cultura original. Dependendo da escolha dos marcadores de isótopos estáveis, várias vias metabólicas podem ser estudada com este método.

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Protocolo

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1. metabolito Extração

  1. Extração de prato
    1. células de cultura em uma placa de 6 poços em triplicado em isótopos marcados meios de cultura estáveis ​​+ suplementos dialisados ​​(soro ou outros suplementos de crescimento) até que as células se tornam 75% confluentes.
      NOTA: Aqui cultura de células HeLa, durante 48 h em RPMI contendo 40% U- 13 C-glicose e 70% U- 13 C, 15 N2-glutamina e 5% de FBS dialisado (Soro Bovino Fetal). FBS dialisado é usado para se livrar dos pequenos metabólitos peso molecular que possam contaminar os meios de comunicação rotulados. células em suplemento dialisada antes da experiência real, a cultura é recomendada para garantir as células estão a crescer normalmente no meio. Suplementos são dialisados ​​em solução 0,15 M NaCl durante a noite usando tubo de diálise pele de cobra.
    2. No dia de meios de cultura de extração de descarte, lavar os poços duas vezes com HBSS 500 mL fria e depois descartá-lo.
      NOTA: Aqui utilizar HBSS contendo 40% de U-13 C-glucose uma vez que também é no meio de cultura.
    3. Adicionar 600 uL de metanol a 100% pré-arrefecido em gelo seco.
    4. Colocar a cápsula para secar gelo e remover o material celular com um raspador de células.
    5. Cuidadosamente pipetar os extractos de células para um tubo de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até a análise por espectrometria de massa.
  2. Extracção de células classificadas simulados
    1. células de cultura em um prato de 100 mm de triplicado em isótopos marcados meios de cultura + suplementos dialisados ​​estáveis.
      NOTA: Aqui cultura de células HeLa, durante 48 horas em placa de 100 mm, porque um grande número de células (~ 4 x 10 6) são necessários para obter 500.000 células separadas. Este número de células HeLa extracto foi necessária para obter uma boa medição de metabolitos. O meio de cultura utilizado foi o meio RPMI contendo 40% U- 13 C-glucose e 70% U- 13 C, 15 N2-glutamina e 5% de FBS dialisada.
    2. No dia de extracção, meios de cultura de descarte, lavar os poços wom 1,5 mL quente HBSS e depois descartá-lo.
    3. Separe as células por adição de 1,5 ml de tripsina / EDTA durante 4 min a 37 ° C. Execute as seguintes etapas em 4 ° C ou em gelo.
    4. Desactivar tripsina, adicionando 3 mL de gelo HBSS frio (Solução Salina Equilibrada de Hank) + suplemento de diálise.
    5. Recolher as células num tubo de 15 ml e centrifugar a 750 xg durante 3 min.
    6. Ressuspender o sedimento em suplemento + EDTA 1 mM + HBSS dialisado a uma concentração de 1-2 x 10 6 células / ml, passar através de 40 uM coadores de células para a obtenção de células individuais, e transferir para um tubo de 5 ml.
    7. Ordenação de células através de separação de células de propagação única para singletos, e células de centrífuga classificados a 750 xg durante 3 min a 4 ° C.
      NOTA: Aqui classificar células HeLa a uma taxa de 1.000 eventos / s, com pressão instrumento de 27 psi, e usando um bico de 100 mm. As células HeLa são grandes para que eles devem ser classificadas em uma taxa de eventos lento e grande bico para obter pellet tão intacto quanto possível. Manter as células em blocos frios throughout triagem para diminuir o metabolismo. Uma descrição completa do processo de classificação é descrito anteriormente 12.
    8. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 mL de gelo frio de dH 2 O para se obter um pelete homogénea antes da adição de metanol. A adição de metanol frio directamente para sedimentar forma um sedimento sólido que é difícil para ressuspender.
    9. Extrair metabolitos por adição de 540 uL de metanol mantido em gelo seco e manter extractos a -80 ° C até a cromatograf ia líquida - espectroscopia de massa de alta resolução (LC-HRMS) análise.
  3. Extracção do ciclo celular de células classificadas
    1. células de cultura em um prato de 100 mm de triplicado em meio de cultura + suplementos dialisados.
      NOTA: Aqui cultura células HeLa contendo geminin Fucci verde (-MAG1 hGem) da sonda 13, que permite a triagem de G1 (negativo) e células SG2M (positivas). As células podem ser cultivadas em meios rastreio de isótopos estáveis ​​para umaé tempo considerado necessário. Aqui temos cultivados-los por 46 h em meio não marcado, então nós mudaram para RPMI contendo 40% de U- 13 C-glicose e 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamina 2 h antes de iniciar a triagem. Isto foi feito a fim de ser capaz de estudar as fases do ciclo celular que requer um pulso curto rotulagem.
    2. No dia da extracção, meios de cultura de descarte, lavar os poços com 1,5 mL HBSS quente e, em seguida, descartá-lo.
    3. Separe as células por adição de 1,5 ml de tripsina / EDTA durante 4 min a 37 ° C. Execute as seguintes etapas em 4 ° C ou em gelo.
    4. Desactivar tripsina, adicionando 3 mL gelada HBSS + suplemento de dialisado.
    5. Recolher as células num tubo de 15 ml e centrifugar a 750 xg durante 3 min.
    6. Ressuspender o sedimento em suplemento + EDTA 1 mM + HBSS dialisado a uma concentração de 1-2 x 10 6 células / ml, passar através de 40 uM coadores de células para a obtenção de células individuais, e transferir para um tubo de 5 ml.
    7. Classificar células através do classificador de células gAting a entrada de detritos e dupletos, em seguida, gating para o marcador de células de interesse, e células de centrífuga classificados em 750 xg durante 3 min a 4 ° C.
      NOTA: Aqui classificar células HeLa a uma taxa de 1.000 eventos / s, com pressão instrumento de 27 psi, e usando um bico de 100 mm. Manter as células em blocos de frio ao longo de triagem para diminuir a taxa de metabolismo.
    8. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 mL de gelo frio de dH 2 O para se obter um pelete homogénea antes da adição de metanol. A adição de metanol frio directamente para sedimentar forma um sedimento sólido que é difícil para ressuspender.
    9. Extrair os metabolitos por adição de 540 uL de metanol mantido em gelo seco e manter extractos a -80 ° C até a análise por LC-HRMS.

2. Análise de Espectrometria de Massa

Nota: Aqui nós descrevemos o protocolo para a análise de extratos de células em um sistema LC-HRMS. Quaisquer métodos metabolômicos para análise de extractos celulares pode ser usado. verificação completaA análise pode ser útil na detecção de uma ampla variedade de metabolitos.

  1. Calibrar o instrumento utilizando uma mistura de calibração de referência espectrometria de massa.
  2. extractos celulares descongelamento em gelo durante 30 min e agitar com vortex durante 15 s.
  3. Transferir 100 uL de extracto celular para um filtro de centrifugação e centrifugar durante 10 min a 13000 xg, a 4 ° C.
  4. Injectar 12,5 uL do filtrado para o sistema de LC-HRMS.
  5. metabolitos separados utilizando cromatografia líquida zwitteriónico Interacção Hidrofílico (ZIC-HILIC) coluna (150 mm x 4,6 mm, 5 um de tamanho de partícula) equipado com uma coluna de guarda ZIC-HILIC (20 mm x 2,1 milímetros) usando um gradiente de eluição de 0,1% fórmico ácido em água (solvente a) e acetonitrilo (solvente B). Iniciar a eluição em gradiente a 20% de solvente A e aumentar até 80% em 17 min. Manter esta percentagem durante 4 min, com um fluxo de 400 mL min -1 e a temperatura da coluna e da bandeja da amostra a 23 ° C e 4 ° C, respectivamente.
  6. Use um iINSTRUMENTO acoplado à separação cromatográfica para a detecção de metabolitos, um electropulverização aquecida (H-ESI II) em ambos os modos positivos e negativos como fonte de ionização, e um modo de aquisição de varrimento total em um poder de resolução de massa de 70000 completa largura meia altura (FWHM) ( m / z 200).
  7. Use azoto (pureza> 99,995%) para o gás de revestimento e gás auxiliar a um caudal de 45 e 10 AU (unidades arbitrárias) e ajustar a temperatura do vaporizador a 350 ° C e a tensão de electrospray a 4 kV no modo positivo e -3,5 kV no modo negativo.

Análise 3. Dados

  1. Selecione um número de metabolitos para os quais existam normas e que mostram picos de boa qualidade nas amostras. picos de boa qualidade tem alta relação sinal-ruído. É importante verificar a qualidade do pico e certifique-se de não incluir falsos isótopos. picos isotópicos, que diferem entre si em forma e / ou tempo de retenção são susceptíveis falsa.
  2. Para amostras marcados com isótopos calcular isotopomer de massa (MI) fracções, dividindo a área do pico de cada MI com áreas totais dos picos de todas as IMs.
  3. Calcular as fracções de carbono / azoto marcados, enriquecimento de 13 C e 15 N, respectivamente, conforme
    figure-protocol-1
    onde n é o número total de átomos de carbono (ou azotos, respectivamente) no metabolito, e misturar a fracção é MI de x.
    NOTA: Todos os cálculos podem ser realizados utilizando linguagens de programação.

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Resultados

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Como um exemplo, aqui descrevemos uma experiência investigar o metabolismo das células HeLa classificados de acordo com a fase do ciclo celular. Para identificar uma grande variedade de metabolitos centrais em ambos os átomos de carbono e átomos de azoto, que as células cultivadas durante 48 h, usando U- 13 C-glicose e U- 13 C, 15 N-glutamina como marcadores. Para obter MIDs ricos para a experiência de validação, que escolheu uma mistura de 40% U- 13...

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Discussão

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O nosso método é baseado no princípio de que em MIDs metabolitos celulares reflectir a "história" de actividades metabólicas de uma célula. Isto faz com que seja possível investigar actividades metabólicas na subpopulação de células, uma vez que ocorreram na comunidade complexo de células, antes do processo de separação de células. Em contraste, as áreas dos picos de metabólitos diferem acentuadamente entre os extratos de células classificadas e extração direta da placa de cultura 11. E...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Anas Kamleh pela ajuda valiosa na otimização dos métodos de espectrometria de massa e a Annika von Vollenhoven pela assistência na classificação de células. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Sueca para Pesquisa Estratégica (grant no. FFL12-0220) e o Programa Estratégico de Pesquisa sobre o Câncer (IR, RN); a Fundação Sueca Coração-Pulmão (CEW, HG); e Fundação Mary Kay (JW, MJ).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
HBSSSigmaH6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)BD Biosciences
Isótopos de Cambridge-13C-Glucose40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutaminaisótopos CambridgeCNLM-1275-H-0.1
Metanol (JT Baker), grau HPLCVWRBAKR8402.2500
Ultrafree - MC - Filtros centrífugos VV. Durapore PVDF 0.1 µ mMilliporeUFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLCThermo Espectrômetro de
Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant (150 mm x 4.6  mm, 5 µ m)Merck KGaA1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC Coluna de proteção HILIC (20 mm x 2,1 mm)Merck KGaA
Acetonitrila Optima LC-MS, vidro âmbarFisher ScientificA955-212
Milli-Q águaMilliporeProduzido com um sistema de gradiente Milli-Q
Myrsyra 99,5% Optima (ácido fórmico)Fisher Scientific11423423
Frasco de Parafuso X100 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, âmbar, 100 unidadesThermo Fisher scientific10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Tampas de rosca)Thermo Fisher scientific12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal MixSigma-AldrichMSCAL5Kit de calibração
SNAKESKIN 10K MWCO Thermo Fisher scientific88245
Mathematica v.10 Wolfram Research
U massa Q-Exactive Orbitrap da Fisher scientific Coluna ZIC HILIC

Referências

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