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O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision

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DOI:

10.3791/55016

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23 de dezembro de 2016

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a resolução próxima do par de bases das interações proteína-DNA. Isso é obtido pelo tratamento com exonuclease de fragmentos de DNA seletivamente enriquecidos por imunoprecipitação de cromatina (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alto rendimento.

Resumo

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta indispensável nos campos da epigenética e regulação de genes que isola as interações proteína-ADN específicos. ChIP acoplado a sequenciação de alto rendimento (ChIP-SEQ) é normalmente usado para determinar a localização genómica de proteínas que interagem com a cromatina. No entanto, ChIP-seq é dificultada pela resolução relativamente baixa de mapeamento de várias centenas de pares de bases e alto sinal de fundo. O método ChIP-exo é uma versão refinada do ChIP-seq que melhora substancialmente com a ambas resolução e ruído. A distinção fundamental da metodologia de ChIP-exo é a incorporação de digestão com exonuclease lambda no fluxo de trabalho para a preparação da biblioteca pegada de forma eficaz a esquerda e para a direita 5 fronteiras de ADN do local de ligação cruzada do ADN-proteína. As bibliotecas Chip-exo são então sujeitas a sequenciação de alto rendimento. Os dados resultantes podem ser aproveitados para proporcionar uma visão única e ultra-alta resolução para a organização funcional of do genoma. Aqui, descrevemos o método ChIP-exo que temos otimizado e simplificado para os sistemas de mamíferos e uma plataforma de sequenciamento-by-síntese da próxima geração.

Introdução

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é um método poderoso para estudar os mecanismos de regulação de genes por enriquecer selectivamente para fragmentos de ADN que interagem com uma dada proteína em células vivas. Métodos de detecção de fragmentos de DNA enriquecido-chip evoluíram como a tecnologia melhora, desde a detecção de um único locus (standard ChIP-qPCR) para hibridação em microarranjos de oligonucleotídeos (Chip-chip) para sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) 1. Embora ChIP-seq tem visto aplicação generalizada, a heterogeneidade da cromatina e interações de DNA não específicos têm dificultado a qualidade dos dados levando a falsos positivos e mapeamento impreciso. Para contornar essas limitações, o Dr. Frank Pugh desenvolveu o método ChIP-exo 2. A característica saliente do chip de exo-é que incorpora uma 5 'a 3' exonuclease de forma eficaz footprinting factor de transcrição locais de ligação. Como resultado, a metodologia ChIP-exo atinge mais de alta resolução, uma gama dinâmica maior de detection, e menor ruído de fundo.

Embora ChIP-exo é tecnicamente mais difícil de dominar do que ChIP-seq, ele está sendo amplamente adotado como estudos como objectivo obter uma visão única de altíssima resolução usando diversos sistemas biológicos 3-8. Na verdade, Chip-exo foi aplicado com sucesso em bactérias, leveduras, rato, rato, e sistemas de células humanas. Como prova de princípio, Chip-exo foi originalmente usado para identificar o motivo de ligação preciso para um punhado de transcrição de levedura fatores 2. A técnica também foi usada em levedura para o estudo da organização do complexo de pré-iniciação da transcrição, e para decifrar a estrutura de vários subnucleosomal histonas 9,10. Mais recentemente, temos alavancado ChIP-exo para resolver TFIIB adjacente e Pol II eventos em promotores humanos vinculativo, e mostrou que a transcrição divergente generalizada surge de iniciação distintos complexos 11.

O fluxo de trabalho aqui apresentado é otimizado e streamlined para Chip-exo de mamífero (Figura 1). Em primeiro lugar, que vivem células de cultura primárias ou tecidos são tratados com formol para preservar em interações proteína-ADN in vivo através de uma ligação cruzada covalente. As células são lisadas e cromatina tosquiada de ~ 100 - 500 fragmentos de tamanho de pares de bases. ChIP então enriquece selectivamente fragmentos de ADN para reticulados para a proteína de interesse. Neste ponto, as bibliotecas de chip SEQ são tipicamente preparados, o que limita inerentemente a resolução de detecção para o fragmento de tamanho médio de algumas centenas de pares de bases. No entanto, Chip-exo supera esta limitação aparando o direito 5 fronteiras de ADN do local de ligações cruzadas proteína-DNA com exonuclease lambda e esquerdo. bibliotecas de sequenciação são então construído a partir de ADN digerido com exonuclease como detalhado abaixo. As fronteiras aninhados 5 'resultantes representam uma pegada in vivo da interacção ADN-proteína (Figura 1, o passo 14), e são detectados por sequenciação de elevado rendimento. AltHough a metodologia ChIP-exo é mais envolvido do que ChIP-seq, transições entre a maioria das etapas requer lavagem cordão simples, que minimiza a perda de amostra e da variabilidade experimental. Importante, uma vez que ChIP-exo é uma versão refinada do ChIP-seq, qualquer amostra que seja bem sucedido com o chip-seq também deve ser bem sucedido com o chip-exo.

O footprinting in vivo de interacções proteína-ADN com resultados ChIP-exo numa estrutura de dados fundamentalmente distinto ChIP-seq. Embora chamadores comuns Chip-seq pode ser aplicada a dados do chip-exo, para obter as chamadas pico mais precisos recomendamos ferramentas de bioinformática projetados especificamente com a estrutura única de dados do chip-exo em mente. Estes incluem Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla e ExoProfiler 12-15.

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Protocolo

Nota: Duplo H2O destilada ou equivalente grau molecular é recomendado para todos os buffers e reações misturas.

Dia 0: Preparação Material e celular Colheita

1. Preparação Tampão

  1. Prepare lise Buffers 1 - 3 (Tabelas 1 - 3) e adicionar 100 ul de estoque inibidor de protease completo (IPC) para 50 ml de cada tampão, imediatamente antes de usar. Prepare estoque CPI dissolvendo um comprimido em 1 ml de grau molecular H 2 O.
  2. Prepare ChIP buffers (Tabelas 4 - 7). Adicione o caldo de CPI 100 ul a 50 ml de Bloqueio e buffers RIPA. Não adicione CPI para tampões Tris e chip de eluição.

2. Annealing de adaptador de oligonucleotídeos

Nota: sequências de oligonucleótidos específicos podem ser encontrados na Seção de Informações adicionais.

  1. Prepare misturas Adaptador de recozimento (Tabelas 8 - 9). Vortex para misturar e brevementegirar tubos de recolha de conteúdos. Alíquota de 100 ul de cada mistura para tubos de 0,5 ml.
  2. Hibridizam os oligonucleotídeos executando o programa (Tabela 10), no termociclador.
    Loja oligonucleótidos recozidos a -80 ° C.

3. In Vivo da cromatina A reticulação com formaldeído

NOTA: Para um experimento de chips típicos, material de partida deve conter aproximadamente 50 milhões de células.

  1. Adicionar solução fresca de 37% livre de metanol estoque formaldeído para salino tamponado com fosfato (PBS), lavou-se a cultura de células até uma concentração final de 1% (v / v), homogeneiza-se, e deixe repousar à temperatura ambiente durante 10 min.
    NOTA: Por exemplo, nós normalmente adicionar 1,4 ml de 37% metanol isento de formaldeído para as células em 50 ml de PBS temperatura ambiente. Além disso, evitar o formaldeído reticulação na mídia desde proteínas na mídia vai saciar algum do formaldeído.
  2. Extingue-se reacção de reticulação por adição de 2,5 M glicinaE para uma concentração final de 125 mM. Homogeneizar.
  3. Transferir células de tubo de 50 ml em gelo. Girar as células durante 5 min a 1000 xg, a 4 ° C. Decantar o sobrenadante.
  4. Adicionar 1 ml de gelo-frio 1x PBS para ressuspender o sedimento celular e por pipetagem. Transferência para 1,5 tubo ml.
  5. Girar as células durante 3 minutos a 2000 xg, a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante.
  6. Imediatamente piscar congelar sedimentos de células em tubos de 1,5 ml com azoto líquido. Armazenar a -80 ° C. células reticuladas são estáveis ​​indefinidamente à temperatura de -80 ° C.

Dia 1: Lise celular, ultra-sons, e chip

4. Lise Celular

NOTA: Durante todas as seções de lise celular, as amostras devem ser mantidas em gelo ou a 4 ° C para minimizar a reversão de ligações cruzadas.

  1. Resumidamente descongelar sedimento celular reticulada. Completamente ressuspender cada sedimento em 0,5 ml de tampão de lise 1 e combinam-se com 4,5 ml de Tampão de Lise 1 num tubo de poliestireno de 15 ml.
  2. Rocha tubos durante 10 min a 4 ° Cpara sobre uma plataforma oscilante. Rotação durante 4 min a 2000 xg, a 4 ° C. Decantar o sobrenadante.
  3. Completamente ressuspender cada pellet em 0,5 ml de Tampão de Lise 2 e adicionar 4,5 ml de Tampão de Lise 2 uma vez em suspensão.
  4. Rocha por 5 min a 4 ° C numa plataforma oscilante. Rotação durante 5 minutos a 2000 xg, a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e bata suavemente o excesso em papel toalha.
  5. Completamente ressuspender cada pellet em 0,5 ml de Tampão de Lise 3 e adicionar 1 ml de Tampão de Lise 3 uma vez em suspensão. Mantenha lisados ​​nucleares no gelo e proceder imediatamente a sonicação.

5. sonicação de lisados ​​Nuclear

NOTA: Durante todas as seções ultra-sons, as amostras devem ser mantidas em gelo para minimizar a reversão de ligações cruzadas. O modelo específico de sonicador utilizado em associação com o protocolo abaixo pode ser encontrada na tabela de materiais. Detalhes sobre o uso e as orientações para outros instrumentos sonicator específica pode ser encontrada na seção de informações adicionais.

  1. Pladaptadores de ressonância da ECA em 15 ml de tubos de poliestireno contendo extractos nucleares (a barra metálica não deve tocar a parede do tubo).
  2. lisados ​​nucleares sonicate em um banho de água gelada durante 2 x 15 min sessões com 30 seg ON / OFF 30 segundos na potência média. sonicar apenas dois tubos de 15 ml de cada vez. Estas definições trabalhar sobre uma ampla gama de linhas de células e tipos de células primária, mas uma maior optimização pode ser necessária se cisalhamento cromatina é incompleta.
  3. Para verificar os resultados ultra-sons, a transferência de 2 x 10 amostras ul de lisado em tubos de 1,5 ml.
    1. Para reverter ligações cruzadas, combinar a primeira alíquota de 10 ul com 10 ul de TE-RNase A e 0,2 ul de proteinase K. Incubar a 37 ° C durante 30 min. Adicionar 4 de ADN corante 6x xileno ul.
    2. Para preservar ligações cruzadas, combinar a segunda alíquota de 10 ul com 2 corante DNA xileno ul 6x.
    3. Executar ambas as amostras sobre um gel de agarose a 1,5% a 140 V durante cerca de 30 - 45 min, até que o corante bromofenol na escada is ¾ do caminho para baixo do gel.
  4. Se sonicação foi bem sucedida (a maioria dos fragmentos de ADN cortados a 100 - 500 pb), transferência sonicada lisados ​​para tubos de 2 ml contendo 150 ul de 10% de Triton X-100. Vortex para misturar.
  5. Para peletizar cromatina insolúvel e detritos, rotação lisado sonicado nucleares durante 10 min a 20000 xg, a 4 ° C.
  6. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL. Dirija imediatamente para amostras de chip ou armazenar a -80 ° C por tempo indeterminado. extractos sonicados não deve ser congelada e descongelada mais do que uma vez.

6. Acoplamento de anticorpo a contas

NOTA: Nunca vortex ou congelamento / descongelamento esferas magnéticas, uma vez que vai quebrar e aumentar sinal de fundo.

  1. Depois de misturar completamente estoque, alíquota Y ul suspensão do grânulo em 1,5 ml tubo, onde Y = 1,1 x 2,5 x ul (número de amostras chip). capacidade de ligação para 2,5 ul pasta talão é de até 13 ug IgG. Lavar 3x grânulos combinados com 1 ml de bloqueioAmortecedor.
  2. Para aliquotting mais consistente de contas após lavagens, contas ressuspender em 10 x o volume pasta original (25 ul / CHIP) com tampão de bloqueio. Alíquota de 25 ul por amostra chip no tubos de 1,5 ml.
  3. Adicionar 5 - 10 ug de anticorpo a alíquota de pérolas ressuspender correspondente. Traga volume final até 250 ul com tampão de bloqueio. Incubar as amostras durante 4 horas (em alternativa, durante a noite, durante 16 horas) numa plataforma rotativa, a 4 ° C.
  4. Aspirar o sobrenadante. Para remover o anticorpo não ligado ou em excesso, lave contas de uma vez com 1 ml tampão de bloqueio.
  5. Após a aspiração última lavagem, imediatamente adicionar 50 milhões de equivalentes de células de extratos sonicados (~ 1,6 ml) ao anticorpo: conjugados talão. Se extratos sonicados não estão prontos, contas ressuspender em 100 ul tampão de bloqueio até que estejam prontos. É crítico para nunca deixar as contas seco.

7. imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

  1. Para cada amostra de chip, combinar 1,5 ml de sonicated extractos com anticorpos conjugados: grânulo em 1,5 mL ou tubos de 2 ml.
  2. Incubar os tubos em um rotator mini-tubo durante a noite (aproximadamente 16 horas) a definição da velocidade de 9 a 4 ° C. Verifique depois de alguns minutos para garantir amostras não estão vazando e está misturando corretamente.

Dia 2: Chip de lavagens e sobre resina reacções enzimáticas

8. Lava ChIP

NOTA: Para minimizar a contaminação cruzada, brevemente girar tubos entre cada lavagem. Para a primeira aspiração, alterar dicas entre cada amostra. Durante lavagens subsequentes, a mesma ponta pode ser usado, desde que não toque as contas. Veja Seção Informações adicionais para obter instruções sobre lavagem de cavacos adequada.

  1. Muito girar rapidamente tubos utilizando uma microcentrífuga (~ 3 seg a 500 xg) para recolher o líquido em tampas e coloque na prateleira magnético durante 1 min. Enquanto ainda no rack magnético, extrato de aspirar.
  2. Adicionar 0,75 ml de tampão RIPA a cada tubo. Retirar os tubos de cremalheira magnéticae inverter várias vezes para misturar. Substituir os tubos na cremalheira magnética e aspirar o sobrenadante. Repita 7x.
  3. Adicionar 0,75 ml de 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) a cada tubo. Retirar os tubos de cremalheira magnética e inverter várias vezes para misturar. Substituir os tubos na cremalheira magnética e aspirar o sobrenadante. Repetir 2x.
  4. Após a aspiração última lavagem, proceda ao polimento.
    Nota: Após cada reacção de incubação nas secções 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3, e 15.3, tubos de centrifugação breve e o local contra cremalheira magnética durante 1 min e o sobrenadante aspirado. Lavar 2x com 0,75 ml de tampão RIPA e 2x com 0,75 ml de Tris HCl (pH 7,5).

Reação 9. Polimento

  1. Preencha Polimento cálculos master mix (Tabela 11). Faça Polimento mistura em 1,5 ml tubo em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Imediatamente após a última lavagem de aparas é aspirado, adicionar 50 ul de mistura de polimento para cada amostra de resina ao mesmo tempo que na cremalheira magnética. Incubar as amostras durante 30 min a 3 XGa 30 ° C num Thermomixer.
  3. Após a aspiração última lavagem conforme descrito na nota depois da Seção 8.4, avance para o A-tailing.

Reacção 10. A-tailing

  1. Preencha cálculos master mix-tailing A (Tabela 12). Faça A-tailing mistura em um tubo de 1,5 ml em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Imediatamente após o polimento secção, adicionar 50 ul de uma mistura de rejeitos-resina a cada amostra, enquanto ainda na cremalheira magnética. Incubar as amostras durante 30 min a 3 x g a 37 ° C num Thermomixer.
  3. Após a aspiração última lavagem conforme descrito na nota depois da Seção 8.4, avance para o P7 Adapter ligadura.

11. P7 Adapter Ligadura Reaction

  1. Preencha cálculos mestre Ligadura mix (Tabela 13). Faça Ligadura misturar em 1,5 ml de tubo no gelo. Pipeta para misturar.
  2. Imediatamente após a secção A-tailing, adicione 48 ul P7 Ligadura mestre mix e 2 ul de um Índice de adaptador diferente to cada resina amostra enquanto ainda na cremalheira magnética. Incubar as amostras durante 2 horas a 3 x g a 25 ° C num Thermomixer.
    Nota: O uso de diferentes índices para cada amostra permitirá que mais amostras a ser sequenciado em uma célula de fluxo único.
  3. Após a aspiração última lavagem conforme descrito na nota depois da Seção 8.4, avance para Φ-29 Nick Repair.

12. Phi-29 Nick Reaction Repair

  1. Preencha Φ-29 cálculos master mix (Tabela 14). Faça Φ-29 mix em 1,5 ml tubo em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Imediatamente após a secção P7 Ligadura, adicionar 50 ul de Φ-29 de mistura para cada amostra de resina ao mesmo tempo que na cremalheira magnética. Incubar as amostras durante 20 min a 3 x g a 30 ° C num Thermomixer.
  3. Após a aspiração última lavagem conforme descrito na nota depois da Seção 8.4, avance para Reacção da quinase.

13. Kinase Reaction

  1. Preencha Quinase cálculos master mix ( Tabela 15). Faça Kinase misturar em 1,5 ml tubo em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Imediatamente após a secção Φ-29, adicionar 50 ul de quinase misturar a resina de cada amostra, enquanto ainda na cremalheira magnética. Incubar as amostras durante 20 min a 3 x g a 37 ° C num Thermomixer.
  3. Após a aspiração última lavagem conforme descrito na nota depois da Seção 8.4, proceda à reação Lambda Exonuclease.

14. exonuclease lambda Reacção

  1. Preencha Lambda exonuclease cálculos master mix (Tabela 16). Faça Lambda Exonuclease misturar em 1,5 ml tubo em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Imediatamente após a secção de quinase, adicionar 50 ul de exonuclease lambda misturar a resina de cada amostra, enquanto ainda na cremalheira magnética. Incubar as amostras durante 30 min a 3 x g a 37 ° C num Thermomixer.
  3. Após a aspiração última lavagem conforme descrito na nota depois da Seção 8.4, proceder a uma reacção f RecJ.

15. RecJ fReação nuclease

  1. Preencha cálculos RecJ f master mix (Tabela 17). Adicione RecJ mistura F em 1,5 ml de tubo em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Imediatamente após a secção exonuclease lambda, adicionar 50 ul de f RecJ mistura para cada amostra de resina ao mesmo tempo que na cremalheira magnética. Incubar as amostras durante 30 min a 3 x g a 37 ° C num Thermomixer.
  3. Após a aspiração última lavagem conforme descrito na nota depois da Seção 8.4, avance para ChIP eluição.

16. A eluição e Crosslink Reversão

  1. Prepare a mistura principal: número de amostras x (1,1 x 200 ul de tampão de eluição ChIP + 1 uL de 20 mg / ml de Proteinase K) em 1,5 ml de tubo. Adicionar 200 ul de tampão de eluição ChIP + proteinase K master mix para cada amostra de resina.
  2. Incubar as amostras durante a noite (aproximadamente 16 horas) em 3 x g a 65 ° C num Thermomixer com uma tampa aquecida para evitar a condensação.

Dia 3: Extrair DNAion e adaptador Ligadura

17. eluição e Crosslink Reversão (continuação)

  1. Após incubação durante a noite a 65 ° C, girar rapidamente amostras a recolher condensado. Colocar as amostras na cremalheira magnética durante 1 min.
  2. Transferir 200 ul de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml contendo 200 ul de tampão TE (pH 7,5).

18. O fenol clorofórmio álcool isoamílico (PCIAA) Extracção

  1. Adicionar 400 ul de fenol clorofórmio álcool isoamílico para cada amostra. Vortex para misturar por 20 s.
  2. Centrifugar durante 10 minutos a 20,000 xg à temperatura ambiente (TA). transferir cuidadosamente 325 ul da camada aquosa superior para um tubo fresco.
    Nota: Tome cuidado para não transferir qualquer um dos (camada inferior) orgânico para o novo tubo.
  3. Adicionar 1/10 volume de NaOAc 3 M (pH 5,5) e 1 ul de 20 mg / ml de glicogénio, a cada amostra. Para várias amostras, preparar uma mistura principal.
  4. Adicionar 3 volumes de etanol arrefecido em gelo a 100% a cada amostra. Vórticemisturar. Incubar durante 15 min a -80 ° C.
  5. Centrifugar durante 15 minutos a 20000 xg a 4 ° C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
  6. Delicadamente adicionar 500 mL de gelo frio a 70% de etanol feitos na hora, certificando-se de não perturbar o sedimento. Centrifugar durante 5 minutos a 20000 xg a 4 ° C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante.
  7. sedimento seco durante cerca de 20 minutos (ou até a seco) num vácuo de velocidade a 45 C.
    NOTA: Este é um ponto de pausa no protocolo. sedimentos de DNA secos podem ser armazenadas a -20 ° C.
  8. Ressuspender as pelotas em 10 ul de ddH 2 O. Pipetar repetidamente sobre a área onde o granulado de ADN, apesar de o sedimento seco não pode ser visto.
  9. Transferem-se 10 ul de cada amostra para um tubo de PCR de 0,3 ml fresco ou 8-cremalheira, dependendo do número de amostras.

Reação 19. P7 Primer Extension

  1. Preencha P7 Primer Extensão cálculos master mix (Tabela 18). Faça Extensão misturar em 1,5 ml tubo em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Adicionar 10 ml de mistura de Extensão (menos Φ-29 da polimerase) a cada amostra 10 ul. Pipeta para misturar.
  3. As amostras são executados no termociclador utilizando o programa (Tabela 19) a cartilha emparelham com o modelo até que o 30 C "hold" passo.
  4. Adicionar 1 ml Φ-29 polimerase durante a 30 ° C "hold" passo no programa. Pipeta para misturar. Retomar o restante do programa (Tabela 19).

Reacção 20. A-tailing

  1. Preencha cálculos master mix-tailing A (Tabela 20). Faça A-tailing mistura em um tubo de 1,5 ml em gelo. Pipeta para misturar.
  2. Adicionam-se 10 ul de uma mistura de rejeitos-se a cada amostra. Pipeta para misturar.
  3. No termociclador, incubar as amostras durante 30 min a 37 ° C, e, em seguida, inactivar pelo calor durante 20 min a 75 ° C.

21. P5 Adapter Ligadura Reaction

  1. Fill fora P5 Adapter Ligadura cálculos master mix (Tabela 21). Faça Ligadura misturar em 1,5 ml de tubo no gelo. Pipeta para misturar.
  2. Adicionar 20 l de P5 Ligadura misturar para cada amostra. Pipeta para misturar.
  3. No termociclador, incubar as amostras durante 2 horas a 25 ° C.

22. Bead Clean-up

Nota: Por favor, consulte a secção Materiais para mais detalhes fabricante de talão limpar.

  1. Transferir cada amostra 50 ul de um novo tubo de 1,5 mL.
  2. Ressuspender limpar grânulos num rotor de mini-tubo a uma velocidade fixada de 15 durante 15 min à TA. Não deixe grânulos resolver antes de pipetar.
  3. Adicionar 60 ul limpar contas para provar (1,2: 1 limpar contas para provar proporção é crítica para remover DNA que é menor do que 200 pares de bases). Pipeta-se misturar durante 20 seg.
  4. Ressuspender limpar contas em um rotor de mini-tubo na configuração de velocidade de 15 por 3 min a RT. Resumidamente girar tubos.
  5. Colocar os tubos na cremalheira magnética durante 1 min.Pipeta e descartar o sobrenadante.
    NOTA: NÃO use aspiração a vácuo nesta seção porque ele vai sugar até as contas de limpeza.
  6. Adicionar 400 mL de recém-feitos RT etanol a 70% a cada amostra, enquanto eles estão na cremalheira magnética. Não misture. Aspirar o sobrenadante. Repetir 2x.
  7. Secam-se os grânulos de limpeza durante 10 min à TA. A cor dos cordões vai virar escuridão para a luz rachaduras marrom e muito pequenas será visível no sedimento de resina quando os grânulos são secos.
  8. Para eluir o ADN, adicionar 40 ul de Tris 10 mM (pH 7,5). Completamente pipeta para misturar por 20 s.
  9. Coloque as amostras na cremalheira magnético durante 1 minuto. Lentamente pipetar e transferir 36 ul eluato directamente para tubos de 0,3 ml de PCR.
  10. Vá diretamente para a PCR reacção ou armazenar eluatos a -20 ° C.

Dia 4: Análise de PCR e Gel

23. PCR

  1. Preencha cálculos PCR master mix (Tabela 22). Adicione mistura de PCR. Pipet muito suavemente para misturar a evitarbolhas.
  2. Adicionar 14 uL de mistura de PCR a cada amostra de ADN de 36 ul. Pipeta para misturar. Manter as amostras em gelo até estar pronto para colocar em termociclador.
  3. Para o controlo positivo de PCR, incluem uma biblioteca previamente preparada. Para o controle PCR negativo, incluem água. As amostras são executados no termociclador utilizando programa de PCR (Tabela 23).

24. Gel Preparação, DNA Excision, e Visualização

  1. Limpe e lave uma caixa de gel de tamanho adequado com água deionizada. Preparar um gel de agarose a 1,5% (contendo 0,5 mg / ml de brometo de etídio) com espessura pente, à escala bem que pode conter de 60 ul.
    NOTA: O brometo de etídio (EtBr) é um agente cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado.
  2. Spin down tubos de amostras de PCR rapidamente para recolher a condensação.
  3. Adicione 1/5 do volume de corante de ADN 6x xileno a amostra combinada. Não utilizar azul de bromofenol em corante de ADN, uma vez que migra na mesma localização que o ADN da amostra.
  4. Coloque todo int amostraO cada poço, de preferência com poços vazios em entre amostras.
    Nota: Bibliotecas com os mesmos índices não devem ser executados no mesmo gel.
  5. Carga 7 ul escada de 100 pb em ambos os lados das amostras. Executar gel a 140 V por aproximadamente 30-45 min até corante bromofenol em escada é ¾ caminho pelo gel.
  6. Imagem e visualizar gel num transiluminador com um ajuste baixo UV. Extirpar as seções de agarose contendo fragmentos de DNA 200-500 pb. Tenha muito cuidado para evitar cortar a banda de adaptador de dímero que roda a 125 pb.
  7. Coloque cada fatia de gel excisado para um tubo de 15 ml. peso líquido recorde de cada fatia de gel. Escrever este peso diretamente no tubo.
  8. Imagem, salvar e fazer anotações em gel excisada para confirmar gama tamanho correto selecionado.

25. Gel de purificação

  1. Purifica-se o ADN a partir de fatia de gel excisado de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes modificações.
  2. Dissolve-se a fatia de gel por balançoà temperatura ambiente agitando plataforma. Vai levar cerca de 20 min para dissolver.
  3. Para obter ADN altamente purificado, lavar as colunas com 0,5 ml de tampão QG gel após dissolvido passou através da coluna.
  4. Depois de lavagem de tampão PE, vamos colunas sentar-se à TA durante 2-5 min. Girar durante 1 min a 13.000 x g à temperatura ambiente.
  5. Para permitir espaço para reação de PCR master mix, amostras Eluir com 40 mL EB Tampão para um novo tubo de 1,5 ml.

26. DNA Quantificação

  1. Preparar as amostras de acordo com as instruções do fabricante (Tabela 24). medir amostras em instrumento específico com tubos ópticos.
  2. Uma vez que as bibliotecas ChIP-exo são quantificados, enviar para o sequenciamento em uma plataforma que utiliza seqüenciamento por síntese química 16, que é compatível com adaptadores de DNA neste protocolo.
    NOTA: Normalmente, 2 ul da amostra é suficiente para quantificação, mas mais podem ser necessários se a concentração de amostra é inferior. ADN rendimentos típicosgama ly entre 50 e 200 ng.
  3. Depois de quantificação, armazenar amostras a -20 ° C.

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Resultados

As figuras a seguir ilustram resultados representativos do protocolo ChIP-exo aqui apresentada. Em contraste com metodologias tradicionais Chip-seq com poucos passos enzimáticos, Chip-exo requer onze reações enzimáticas sequencialmente dependentes (Figura 1). Assim, deve ser tomado cuidado em cada passo para garantir que cada componente de reacção é adicionada a sua respectiva mistura principal de reacção. Recomendamos gerando uma planilha fórmulas com base nas tabelas d...

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Discussão

Nós apresentamos um protocolo de genômica funcional para determinar a localização de ligação preciso para cromatina proteínas que interagem de uma maneira imparcial, genome-wide em perto de resolução de pares de bases. O passo mais crítico para alcançar perto da base uma resolução de mapeamento par é o tratamento exonuclease do DNA enriquecido com chip, enquanto o immunoprecipitate permanece na resina magnética. Aparentemente, complexos de proteína poderia bloquear footprinting in vivo de qualquer subunid...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Venters Lab e aos membros do Departamento de Fisiologia Molecular e Biofísica pelas discussões úteis. Agradecimentos especiais a Frank Pugh por sua orientação, orientação e muitas discussões perspicazes sobre as nuances do ChIP-exo enquanto eu era pós-doutorando em seu laboratório.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
37% de formaldeído, sem metanol, 10 ampolas de 10 mlThermoFisher Scientific28908Seção 3
Coquetel completo de inibidor de protease (CPI)Roche Life Science11873580001Seções 4, 8
Bioruptor sonicatorDiagenodeUCD200Seção 5
Tubos de poliestireno de 15 mlBD Falcon352095Seção 5
Contas MagSepharose Protein G XtraGE Healthcare28-9670-66Seção 6
DynaMag-1.5 ml Rack Magnético LateralInvitrogen12321DSeções 6-17, 22
Mini-Tube RotatorFisher Scientific05-450-127Seções 7, 22
T4 DNA PolimeraseNew England BioLabsM0203Seção 9
DNA Polimerase I, KlenowNew England BioLabsM0210Seção 9
10x NEBuffer 2 (10x Tampão de Reação 2)New England BioLabsB7002Seções 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer CEppendorf5382Seções 9-16
ATPRoche Life Science010419979001Seções 9, 11, 13
dNTPsNew England BioLabsN0447Seções 9, 12, 19, 23
T4 Polinucleotídeo QuinaseNew England BioLabsM0201Seções 9, 13
dATPNew England BioLabsN0440Seções 10, 20
Klenow 3'-5' Exo MinusNew England BioLabsM0212Seções 10, 20
T4 DNA ligase New England BioLabsM0202Seções 11, 21
φ-29 DNA polimeraseNew England BioLabsM0269Seções 12, 19
10x φ-29 BufferNew England BioLabsB0269Seções 12, 19
Exonuclease LambdaNew England BioLabsM0262Seção 14
10x Lambda BufferNew England BioLabsB0262Seção 14
RecJf ExonucleaseNew England BioLabsM0264Seção 15
Proteinase KRoche Life Science03115828001Seção 16
GlicogênioRoche Life Science010901393001Seção 18
10x T4 Ligase BufferNew England BioLabsB0202Seção 21
AMPure XP (limpeza) contas Beckman CoulterA63881Seção 22
Q5 Hot Start DNA Polimerase New England BioLabsM0493Seção 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)New England BioLabsB9027Seção 23
QIAquick Kit de Extração de GelQiagen28704Seção 25
QubitFluorômetro InvitrogenQ33216Seção 26
Tubos Qubit Ópticos Transparentes InvitrogenQ32856Seção 26
Qubit dsDNA Kit de ensaio de alta sensibilidadeInvitrogenQ32851Seção 26

Referências

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  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
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  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
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  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035(2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
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  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
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  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

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