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Artigo de método

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em

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DOI:

10.3791/55024

⸱

17 de março de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Zoology, Albertus-Magnus University of Cologne, 2Department of Veterinary Biomedical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Neste artigo

Resumo

O ensaio CApillary FEeder (CAFE) é um método simples, econômico e altamente confiável para investigar os mecanismos subjacentes à ingestão de alimentos. Usado com o organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, ele fornece um meio poderoso de obter novos insights sobre os mecanismos regulatórios da ingestão de alimentos.

Resumo

Para a maioria dos animais, a alimentação é um comportamento essencial para garantir a sobrevivência e influencia o desenvolvimento, a locomoção, a saúde e a reprodução. A ingestão do tipo e quantidade certos de alimentos, portanto, tem uma grande influência na qualidade de vida. A pesquisa sobre o comportamento alimentar concentra-se nos processos subjacentes que garantem a alimentação real e desvenda o papel dos fatores que regulam a homeostase energética interna e as bases neuronais da tomada de decisão. O organismo modelo Drosophila melanogaster, com sua grande variedade de ferramentas geneticamente rastreáveis para rotular e manipular neurônios individuais, permite o mapeamento de redes neuronais e a identificação de cascatas de sinalização molecular envolvidas na regulação da ingestão alimentar. Este relatório demonstra o ensaio CApillary FEeder (CAFE) e mostra como medir a ingestão de alimentos em um grupo de moscas por períodos de tempo que variam de horas a dias. Este ensaio fácil de usar consiste em capilares de vidro cheios de alimentos líquidos que as moscas podem acessar e se alimentar livremente. O consumo de alimentos no ensaio é determinado com precisão usando ferramentas de medição simples. Aqui, descrevemos passo a passo o método desde a configuração até a execução bem-sucedida do ensaio CAFE e fornecemos exemplos práticos para analisar a ingestão alimentar de um grupo de moscas sob condições controladas. O leitor é guiado através de possíveis limitações do ensaio, e as vantagens e desvantagens do método em comparação com outros ensaios de alimentação em D. melanogaster são avaliadas.

Introdução

Comer é essencial; no entanto, a desregulamentação da ingestão de alimentos, resultando em transtornos alimentares como bulimia, anorexia ou a tendência geral para comer demais implica custos para os indivíduos ea sociedade 1, 2, 3. O objetivo da presente pesquisa é descobrir mecanismos de regulação da ingestão de alimentos e para fornecer uma estratégia de evasão à formação de desordem. Numerosos estudos utilizando modelos de organismos de mamíferos têm proporcionado novas perspectivas de o circuito eo papel dos sistemas de sinalização em distúrbios 4, 5, 6 comer. No entanto, o nosso conhecimento das bases neuronais e moleculares subjacentes a estes transtornos permanece longe de ser completa. Nos últimos anos, a mosca da fruta Drosophila melanogaster tornou-se um sistema valioso modelo para desvendar idéias mecanicistas básicas para a regulamentação da metabolism 7, 8, 9. O ensaio capilar alimentador (CAFE) Drosophila melanogaster foi criado no laboratório de Seymour Benzer, em 2007, inspirado por um trabalho anterior de Dethier no blowfly 10, 11. O ensaio CAFE tornou possível medir diretamente a ingestão de alimentos em Drosophila melanogaster. Neste sistema de teste comportamental, moscas se alimentam de alimento líquido fornecido em capilares de vidro graduada colocada dentro de um frasco. O declínio do menisco capilar indica perda de solução alimentar através de evaporação e consumo de alimentos. Determinar a velocidade de evaporação por frascos sem moscas permite a quantificação precisa do consumo de alimentos.

O ensaio CAFE é um dos vários paradigmas comportamentais usados para medir a alimentação em Drosophila melanogaster e os investigadores têm de escolher o mais adequado para a sua específicaquestão. A decisão de usar um determinado ensaio deve considerar os seguintes pontos: a natureza do alimento fornecido; a condição de alimentação; a medição da ingestão ou absorção de nutrientes e investigação consumo de alimentos ou a resposta aos alimentos.

O ensaio CAFE, conforme descrito neste relatório é ideal para seguir a ingestão de alimentos de uma fonte de alimento líquido sob uma condição de alimentação vertical. Alternativamente, a ingestão de alimento pode ser medida por um grupo de mosca em uma fonte de alimento colorido num frasco ou numa placa. As moscas são normalmente mortos ou anestesiados após a alimentação e a quantidade de corante ingerida é determinada por espectrometria ou inspeção visual do abdômen manchada. Moscas iniciar a excretar o alimento ingerido apenas 30 minutos após a ingestão, por conseguinte, esta abordagem é difícil de usar, para a análise de mais comportamentos alimentação contínua 12, 13.

Em contraste moscas são mantidas intactas quando corante absorvívels com traçadores radioativos são usados e seu consumo de radioisótopo é marcado num contador de cintilação 14, 15. Absorção do marcador radioactivo pelo sistema digestivo mosca torna a longo prazo de medição possível a absorção de alimentos, mas pode levar a uma subestimação do consumo devido a moléculas não absorvido e excretado marcadoras. Outra abordagem para medir a resposta ao alimento em Drosophila melanogaster, é a resposta extensão tromba (PER), o que normalmente ocorre durante a ingestão de alimentos 16. Este método elegante mede a resposta inicial a um estímulo comida, mas não grava a quantidade de ingestão. A ingestão de alimentos é ajustado dinamicamente durante a alimentação usando vários sinais de retorno pós-digestivos que são fundamentais para a regulação da alimentação 17, 18. Várias tentativas têm sido feitas nos últimos anos para a recolha de dados semi-Automate no ensaio PER 19, 20. O PER é detectado por uma almofada eléctrica ou uma combinação de eléctrodos e contados através do computador. Combinando o ensaio PER com captação do radioisótopo revelou que este ensaio é limitada pela baixa sensibilidade para a detecção de diferenças de alimentação quantidade 18. O ensaio manual de alimentação (MAFE) 21, em que uma mosca é alimentada manualmente com um capilar de vidro, foi recentemente desenvolvido para medir a absorção de alimentos num único mosca imobilizada. O ensaio MAFE elimina as interferências de A alimentar e de alimentação de iniciação e tem uma resolução de tempo de segundos, e iniciação de PER e consumo de alimentos pode ser controlada de forma independente no ensaio. No entanto, a maneira em que a imobilização da mosca afecta determinados aspectos do comportamento alimentar (por exemplo, locomoção, motivação) tem ainda de ser investigada. Para excelentes críticas comparativas de ensaios diferentes para medir o consumo de alimentos em Drosophila melanogaster e ajudar os investigadores encontrar o caminho mais adequado, ver os relatórios por Deshpande e Marx 13, 22.

O ensaio CAFÉ evita algumas das desvantagens de outros ensaios descritos acima e combina a simplicidade de utilização com medição fiável da ingestão de alimentos. Aqui, uma descrição detalhada do ensaio CAFE é fornecido e nós mostrar uma modificação configuração simples para reduzir a evaporação. Os resultados representativos, incluindo um ensaio de dois alimentos escolha (curto e longo prazo) e a absorção de sacarose de moscas é demonstrada. Na discussão, comparamos nosso método descrito com formas alternativas de realizar o ensaio CAFE, e destacar potenciais limitações.

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Protocolo

1. O ensaio CAFÉ

NOTA: O ensaio é composto por três componentes: um frasco experimental, uma tampa específica e capilares micro. Uma caixa de plástico com tampa é utilizado para transportar os frascos preparados e para controlar a humidade de forma mais eficiente.

  1. Usar um Drosophila melanogaster frasco de cultura de plástico (opcional 8 centímetros de altura, 3,3 cm de diâmetro) na forma de um tubo para o ensaio.
  2. Fecha-se o frasco com uma tampa de Plexiglas fabricadas contendo um O-ring (Figuras 1A, 1B). Carga voa tocando ou com um maçarico através da abertura da tampa central (0,9 cm de diâmetro), que também permite a circulação de ar e de água, e fechar o buraco com uma rolha de esponja. Seis aberturas cónicas menores (0,4 cm de diâmetro superior, diâmetro interno de 0,3 cm) cercam o furo central e encaixar as pontas de pipeta de 2-20 volume de mL para manter os vasos capilares no lugar. (Ver figuras suplementares para detalhes técnicos do tampa.)
    NOTA: O usode uma rolha de esponja com aberturas para os capilares em vez da tampa feito por encomenda utilizado no nosso manuscrito é possível. Nossa tampa personalizado permite o manuseio seguro dos frascos preparados minimizando o risco de capilares caindo.
  3. Para apresentar o alimento líquido, usar 5 microcapilares ul com 1 marcas mL. Posicionar os capilares cónicos nas aberturas na tampa, cortando o topo de um 2 - ponta de pipeta 20 ul e a inserção da ponta para o buraco (Figura 1B, marcado com borda vermelha). Para evitar moscas de escapar, inserir um sem cortes 2-20 mL ponta da pipeta na mesma abertura.
  4. Para lidar com segurança com vários frascos preparados, colocá-los em uma caixa de plástico com uma incrustação em grade (Figura 2A).

2. Preparação de Moscas

  1. Manter moscas em alimentos padrão a 25 ° C, 60% de humidade relativa e um / 12 h ciclo de luz-escuro de 12 h.
  2. Para controlar condições de criação, introduzir 35 fêmeas virgens umD 15 machos para cada grupo experimental para um frasco de cultura de plástico (9,8 centímetros de altura, 4,8 cm de diâmetro) contendo 50 mL fly alimentos. Permitir moscas colocar ovos para os primeiros 3 dias, em seguida, transferir adulto voa para frascos de alimentos frescos e deixá-los põem ovos por mais dois dias. Após este repetir a transferência de novo. adulto descarte voa depois de mais 2 dias.
  3. Como a ingestão de alimentos depende do tamanho da mosca, determinar o peso de um grupo de 100 moscas por anestesiar 2- a mediana de 3 dias de idade, utilizando uma almofada moscas mosca CO 2 e juntá-las num tubo de plástico de 1,5 ml e com um padrão de medição escala de laboratório. Determinar o peso líquido de pelo menos quatro grupos de moscas independentes classificadas por sexo (Tabela 1); usar o peso para calcular mL consumo de alimentos per mg mosca. Utilizar o valor para determinar a quantidade de comida que alimenta uma única mosca por experiência e ajustar o número de capilares cheios de alimentos de acordo com a evitar o esvaziamento dos capilares através da alimentação.
    1. Para um ensaio de 3 h, a utilização20 moscas e duas capilares cheios. Para uma experiência a longo prazo (> 3 h e até 9 dias), utilizar um grupo de oito moscas com um fornecimento de quatro capilares cheios (resultados fiáveis ​​não pode ser obtida com menos do que oito moscas nas condições descritas).
  4. Moscas separados em grupos (8 ou 20 moscas) após a medição de peso sob exposição ao CO 2. Transferir o grupo para um novo frasco de comida (contendo 15 mL de alimentos padrão) para permitir a recuperação a partir de CO 2 sedação durante 48 h antes da experiência. Use moscas de 4 a 6 dias de idade para o ensaio CAFÉ.
  5. Como moscas não sedentos de tipo selvagem alimentar apenas marginalmente 19, 21, pré-starve voa para 3 h experiências de alimentação. Sem o jejum é necessário quando o consumo de alimentos é monitorado ao longo de vários dias. Para jejum, moscas transferência de 16 a 20 horas antes do teste batendo suavemente-los para um frasco contendo apenas um diâmetro dobrado de papel de filtro de 45 mm humedecido com ~ 0,5 mL DDH2 O (bidestilada água), e fechar com uma tampa ensaio CAFE conectado.

3. Preparação de alimentos líquidos

  1. Prepara-se uma (10%, w / v) de 3 M de solução de estoque de sacarose, preenchendo 102,6 g de sacarose (C 12 H 22 O 11) a 100 mL de ddH 2 O. Pipeta 3 ul, 33 ul, 333 ul, 3,3 mL e 6,6 mL da solução de reserva para um tubo de plástico de 15 mL; Adicionar 2 ml de corante alimentar (para o vermelho: Cochonilha [E124]; para o azul: carmim índigo [E132]) e preencher a 10 mL com DDH 2 O. As concentrações resultantes são 0,001, 0,01, 0,1, 1 e 2 M de sacarose .
    NOTA: O corante alimentar permite visualizar o menisco mais facilmente. No entanto, o corante pode ter um impacto sobre a ingestão de alimentos. Para evitar uma tendência devida ao corante dispensar o corante alimentar ou ao acaso, a utilização de corantes para as amostras de alimentos durante a experiência e os grupos.
  2. Para testar para o álcool preferência pipeta 333 uL da solução de stock 3 M de sacarose num tubo de plástico de 15 mL.Adicionar 1,5 mL (2,3 ml) de 100% de EtOH (etanol) e adiciona-se ddH2O até 10 mL para resultar em 15% (0,25 mM) e um 23% (0,39 mM) soluções de trabalho.
  3. Mantenha soluções estoque a -20 ° C e soluções de trabalho a 4 ° C; utilizar no prazo de 1 semana.
  4. Encha até 10 capilares, ao mesmo tempo com uma solução alimentar colorido, por força de capilaridade. Inserir as extremidades dos capilares para a solução de sacarose (segurando os capilares com um ângulo de 45 ° em relação à solução). Pare se o líquido atinge o topo (5 mL) marca do capilar e remover o excesso de solução no exterior e no interior com papel de seda.

4. Montagem e realização do ensaio capilar alimentador

  1. Se o jejum não é necessário, transferir as moscas experimentais para o ensaio tocando ou blow-pipe. Certifique-se de incluir três frascos de controlo sem moscas para quantificar evaporação.
  2. Remova cuidadosamente uma ponteira (2-20 volume de mL), que está fechando uma das abertu exteriorgs, e inserir um capilar de vidro, na base da pirâmide preenchido em primeiro lugar. Fixar o capilar, colocando a ponta da pipeta de volta ao lado do capilar. Se várias soluções alimentares estão sendo testados, repita esse procedimento em conformidade.
  3. Coloque o capilar termina dentro de todos os frascos com o mesmo nível de prevenção de erros que poderiam ocorrer se as fontes de alimento foram localizados em diferentes alturas (3 - 4 cm da tampa); manter uma distância para o papel de filtro para impedir que o capilar de vazamento por acidentalmente tocar o papel de filtro ou diferentes viscosidades de fontes de alimento.
  4. Rotular a extremidade superior do líquido colorido usando uma caneta marcador (ponto de início). Para garantir que os diferentes capilares podem ser identificados, classificá-los individualmente através de um código de cor ou de distribuição.
  5. Coloque vários ensaios de CAFÉ preparados dentro de uma caixa de plástico com incrustações em grade e transferir a caixa (Figura 2A) para uma posição segura em condições de laboratório ou em uma com temperatura, clim luz e humidade controladasComeram câmara (parâmetros: 25 ° C, 60% de humidade relativa, 12 h / 12 h ciclo de luz-escuridão) durante o período experimental (por exemplo, 3 horas ou dias).
  6. Como papel de filtro inferior resseca, se o ensaio for realizado ao longo de vários dias, aplique água fresca a cada 24 h através do bung esponja (100 mL) para manter constante umidade no interior do ensaio. Use quatro frascos separados (8 centímetros de altura, 3,3 cm de diâmetro) preenchidos com 30 mL DDH 2 O como dispositivos de umidade e colocá-los ao lado dos ensaios de café em caixa de plástico. Use uma tampa da caixa de plástico para criar um ambiente de humidade controlada durante o experimento (Figura 2A).
    NOTA: variabilidade Broader ocorre sob condições de laboratório; no entanto, é viável para realizar o ensaio do café na temperatura ambiente (por ex., numa sala de aula). O uso de um dispositivo de humidificação (papel de filtro, com ou sem um tampão de esponja molhada, frascos cheios de água e tampa da caixa de plástico) é altamente recomendável para diminuir a evaporação ( Figura 2B).
  7. Substitua os capilares com os recém-cheias para experimentos de longa duração a cada 24 h. Anote moscas mortas antes de cada intervalo de 24 h e usar o número de moscas vivas para calcular o consumo per fly para o período seguinte. Descartar as velhas capilares depois de medir o declínio do menisco (ver 5.1).
    NOTA: Durante a 3 h experimento que quase não ver qualquer moscas mortas. Durante um estudo 4 dias que geralmente encontrar 1 - 3 moscas mortas.
  8. No final do ensaio, antes de substituir o capilar, marcar o menisco inferior do tubo capilar (marca final), com uma caneta de marcador, enquanto o ensaio CAFÉ ainda está na posição vertical. Descarte os dados se end marca não está abaixo da marca inicial (ponto de início). Não retire a tampa, pois isso pode alterar o menisco.
  9. Remova cuidadosamente os capilares a partir do ensaio e armazená-los para coleta de dados. Verificar se o líquido no interior do capilar alcançada a extremidade inferior se não discard os dados, como comida não era acessível para as moscas. Recolha todos os capilares por frasco como um grupo. Insira as pontas de pipeta sem cortes em todas as aberturas para evitar moscas de escapar. Desmantelar a instalação e lavar os frascos, tampas e tampões de esponja em um banho de sabão e secar durante a noite à temperatura ambiente para uso posterior.
    NOTA: As moscas podem ser ainda analisados ​​após o ensaio. Confirmar a absorção de alimentos pelo olho ou sob um microscópio de dissecação.
  10. experiências repetidas com os mesmos genótipos em pelo menos três dias diferentes.

5. Recolha e Análise de Dados

  1. Meça a distância entre o início eo fim marca marca no capilar usando uma pinça ou uma régua. Para transferir dados diretamente para uma planilha, use um cabo USB (Universal Serial Bus) ligado paquímetro digital (Figura 1E). Descartar os capilares após a medição.
  2. Conta de tamanho capilar para calcular a absorção de alimentos ou evaporação. Por exemplo, considere uma tampaIllary que é de 73 mm de comprimento e contém 5 uL de solução de alimentação. Uma diminuição 14,6 milímetros no menisco reflecte a absorção de uma solução uL. Calcular a absorção de alimentos com a seguinte fórmula:
    a absorção de alimentos (L) = distância medida (mm) / 14,6 mm
  3. Para excluir o efeito de evaporação na ingestão de alimentos, calcular média de evaporação nos frascos de controlo de três (no mínimo) sem moscas. Subtrair este valor médio a partir do valor obtido para o consumo de alimentos pelas moscas.
  4. Use a seguinte fórmula para determinar o consumo total por mosca:
    consumo de alimentos (L) = (Food captação [mL] - perda por evaporação [mL]) / número total de moscas no frasco. Para longo prazo experiências utilizar o número de moscas vivas antes do início do intervalo de 24 h.
  5. Para explicar as diferenças no tamanho do corpo, como entre moscas macho e fêmea, normalizar o consumo de alimentos com o peso corporal (mL alimentos / mg fly).
  6. Use um software estatístico para análise de dados. por normaDados aliado distribuídos, -Testes T uso do aluno para determinar as diferenças entre dois grupos de moscas, e usar ANOVA (análise de variância) com testes post hoc Tukey Cramer por mais de dois grupos. Em uma situação de escolha, analisar as diferenças de escolha aleatória usando um teste não paramétrico sinal de uma amostragem.

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Resultados

As moscas com o genótipo de W 1118 são usados para demonstrar a forma como o ensaio é realizado. Os mutantes W 1118 são comumente usados para gerar linhas transgénicas e para controlar o fundo genético de transgenes marcado com o gene branco. Normalmente, para experiências de comportamento, todos os linhas transgénicas são retrocruzados durante cinco gerações ao mesmo W 1,118 estoque, o qual é utilizado como controlo ex...

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Discussão

O relatório descreve o ensaio CAFE de forma passo-a-passo, com foco na configuração técnica e seu bom desempenho em laboratório. Devido à sua simplicidade, este ensaio também pode ser utilizado como um experimento educacional escola. Os exemplos mostram que o ensaio permite investigação de detecção de alimentos, preferência e consumo em Drosophila melanogaster durante períodos de tempo curtos e mais longos (horas ou dias). O ensaio CAFE tem sido amplamente utilizada no campo para investigar assuntos, incluindo ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros antigos e atuais do laboratório Scholz pela discussão e a Helga Döring pelo excelente suporte técnico. Agradecemos especialmente aos membros do workshop Biocenter da Universidade de Colônia por seu apoio e criatividade. O trabalho é apoiado pelo SFB 1340, SysMedAlc e DAAD-Siemens.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frascos (reprodução)Frascosde 960177www.greinerbioone.comGreiner Bio-One
(ensaio CAFE)Greiner Bio-One217101www.greinerbioone.com
Lid-Workshop de ensaio CAFE––
Caixa de plástico, parede baixaPlastime353
www.plastime.it Capa para a caixa de plásticoWorkshop––
CapilaresBLAUBRAND REF 7087 07www.brand.de
Ponteiras de pipetaGreiner Bio-One771290www.greinerbioone.com
Círculos de papel de filtroWhatman10 311 804www.sigmaaldrich.com
D(+)-SacaroseAppliChem57-50-1www.applichem.com
Etanol absolutoVWR Chemicals20.821.330www.vwr.com
Corante alimentar (vermelho, E124)Backfun10027www.backfun.de
Corante alimentar (azul, E133)Backfun10030Solução de
sabão www.backfun.de (CVK 8)CVH103220
Paquímetro digitalGARANT412,616Frascos de www.hoffmann-group.com
(reprodução)Altura 9,8 cm, diâmetro 4,8 cm 
Frascos (ensaio CAFE)Altura 8 cm, diâmetro 3,3 cm
Ensaio Lid-CAFEProduzido em oficina universitária, desenho técnico fornecido
Clique aqui para baixar este arquivo.
Caixa de plástico, paredeUm inlay de grade de plástico foi feito sob medida para 8 x 10 posições de frasco 
Tampa para a caixaDimensões (37 x 29 x 18 cm)
CapilaresDIN ISO 7550 norm,  Diretriz IVD 98/79 EG, extremidades polidas
PontasAs pipetas para o círculo externo são cortadas de acordo com a tampa
Círculosde 45 mm de diâmetro funcionam bem se dobrados para os frascos usados
D(+)-SacaroseNão prejudicial
AbsolutoLíquido e vapor altamente inflamável
Corante alimentar (vermelho, E124)Não declarado
Corante alimentar (azul, E133)Não declarado
Solução de sabão (CVK 8)Sabonete neutro de odor
Paquímetro
digital Alimento(para 20 L)
Ágar160 g
Levedura299,33 g
Fubá1.200 g
Melaço1,6 L
propiônico57,3 mL
Nipagina 30%160 mL
www.cvh.de baixa de plástico de pipeta de papel de filtro de etanol padrão para moscas de cerveja Ácido

Referências

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