Artigo de método

Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele

DOI:

10.3791/55036

⸱

24 de março de 2017

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1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Surgery, Division of Pediatric Surgery, Children's Research Institute, 4Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 5Deptarment of Anesthesiology, Clement J Zblocki Veteran Affairs Medical Center, 6Department of Medicine, Division of Cardiology, Medical College of Wisconsin

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos o isolamento da matriz extracelular cardíaca de camundongos controle C57Bl/6J, camundongos de pele apertada e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5. Também descrevemos os estudos de vasodilatação nos vasos isolados de C57Bl / 6J, camundongos de pele firme e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5.

Resumo

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O fator regulador do interferon 5 (IRF5) é crucial para as células determinarem se respondem de forma pró-inflamatória ou anti-inflamatória. A capacidade do IRF5 de mudar as células de um caminho para outro é altamente atraente como alvo terapêutico. Projetamos um peptídeo chamariz IRF5D com um software de modelagem molecular para projetar pequenas moléculas e peptídeos.

IRF5D inibiu IRF5, reduziu alterações na matriz extracelular e melhorou a vasodilatação endotelial no camundongo de pele apertada (Tsk/+). O Kd de IRF5D para IRF5 recombinante é 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, conforme determinado por experimentos de ligação usando experimentos de interferometria de biocamada. A proliferação e apoptose de células endoteliais (CE) permaneceram inalteradas usando concentrações crescentes de IRF5D (0 a 100 μg / mL, 24 h). Camundongos Tsk/+ foram tratados com IRF5D (1 mg/kg/d por via subcutânea, 21 d). As expressões de IRF5 e ICAM diminuíram após o tratamento com IRF5D. A função endotelial foi melhorada conforme avaliado pela vasodilatação das artérias faciais de camundongos Tsk / + tratados com IRF5D em comparação com camundongos Tsk / + sem tratamento com IRF5D. Como fator de transcrição, o IRF5 trafega do citosol para o núcleo. A translocação foi avaliada por imuno-histoquímica em miócitos cardíacos cultivados nas diferentes matrizes extracelulares cardíacas. O tratamento com IRF5D do camundongo Tsk/+ resultou em um número reduzido de núcleos positivos para IRF5 em comparação com os animais sem tratamento com IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Essas descobertas demonstram o importante papel que o IRF5 desempenha na inflamação e fibrose em camundongos Tsk / +.

Introdução

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Regulação do crescimento celular e as respostas imunitárias de morte celular é central para o papel da famia do factor de transcrição de factores de regulação de interferão. IRF5 é destacada como sendo crucial para a regulação de respostas imunes entre o tipo 1, uma resposta promover inflamatória e tipo 2, uma reparação tecidual resposta imune alvo. IRF5 é chave no cancro 1, autoimunidade e 2, 3, 4, 5.

O mouse apertado-pele (Tsk / +) é um modelo para a fibrose do tecido e esclerodermia devido a uma mutação de duplicação no gene fibrilina-1. Esta mutação resulta em uma apertada-pele e um aumento do tecido conjuntivo. Estes ratinhos desenvolvem inflamação do miocárdio, fibrose e insuficiência cardíaca, finalmente, 5, 6, 7,> 8, 9. A esclerodermia é uma doença fibrótica autoimune que afecta cerca de 150.000 pacientes nos Estados Unidos 6. As principais características desta doença são a fibrose dos órgãos internos, incluindo o coração 7, 8, 9, 10, 11.

A natureza do estudo exigiram a concepção de um peptídeo inibidor. A abordagem software foi escolhido em detrimento de uma abordagem tradicional usando uma exibição de fagos. A abordagem de software é mais fácil e menos demorado. O banco de dados RCSB é usado para identificar os sítios de ligação apropriados 12. Para estudar a interação do peptídeo recém-projetado com a proteína recombinante e concentrar-se nos parâmetros de ligação, foi usada uma técnica chamada interferometria biolayer. Biolayer interferometria é um biossensor baseado technique que determina a afinidade de ligação, de associação e dissociação usando um biossensor e uma amostra de ligação. O biossensor pode ser fluorescente, luminescently, radiometricamente e colorimetricamente marcado. A medição baseia-se na adição de massa ou assemelha-se a depleção de associação e de dissociação 13, 14. O objetivo deste estudo foi compreender o papel da IRF5 na inflamação do miocárdio e fibrose. O objetivo era ter uma visão sobre o papel da IRF5 no desenvolvimento de fibrose tecidual e esclerodermia.

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Protocolo

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Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee (Protocolo: AUA # 1517). Toda pesquisa envolvendo ratos foi realizado em conformidade com a política PHS.

1. Projeto de Decoy Peptide

  1. Encontrar estrutura 3D do IRF5 e basear o projeto nele. Design um 17 mer, denominado IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), onde aspartato (D) é substituído por serina (S) para mimetizar a fosforilação em IRF5 em 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Análise de grupos sulfidrilo e 3D conhecimento de mecanismo de activação do IRF5, ou seja, a fosforilação da serina, sugeriu que uma estratégia de direccionamento foi IRF5 para gerar um péptido de engodo. Veja a Figura 1. Para identificar a melhor região na estrutura 3D, use um software de modelagem molecular para a concepção de pequenas moleculES e 15 péptidos.
    NOTA: O passo crítico neste processo é a disponibilidade da estrutura 3D da proteína alvo e as suas possíveis locais de ligação. A estrutura 3D de IRF5 representa com precisão dimeriza como IRF5 após fosforilação. A substituição de aspartato de serina ou treonina é terceirizada. O péptido é sintetizado separadamente, sem estar ligado a IRF5.
  2. Replicar a fosfo-domínio simplesmente substituindo D por S. Com base na sequência original (ELSWSADSIRLQISNPD, faça uma nova IRF5S péptido com a sequência de aminoácidos de Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D).

2. Biolayer interferometria (BLI)

NOTA: A purificação para IRF5 recombinante foi terceirizada. 16

  1. marcador de biotina IRF5 numa razão molar de 1: 1 de biotina para ligando com um reagente de biotinilação incorporando um ligante de cadeia longa. A longa cadeia de ligação irá garantir uma liga mais ativa e homogêneasuperfície nd.
    1. Adicionar 1 ml de 2 mg / mL IRF5 a 13 uL de reagente de biotina a 20 mM ou aumentar os volumes se necessário. Incubar em gelo durante 2 h. Após a marcação, utilizar uma coluna de dessalinização de centrifugação para remover a mistura de reacção a partir da proteína marcada.
  2. Incubar o ligando marcado com biotina com os biossensores durante 15 min. Evitar o excesso de rotulagem e ajustar a razão molar 1: 1. Após a marcação, utilizar uma coluna de dessalinização de centrifugação para remover a mistura de reacção a partir da proteína marcada.
  3. Incubar os marcados com biotina biossensores IRF5 durante 10 min, em diferentes concentrações do péptido IRF5 chamariz. As taxas de associação e dissociação foram determinadas como descrito 10, 17, 18.

3. apoptose e proliferação Ensaios

  1. Ensaio de proliferação através de bio-redução do tetrazólio
    1. Administrar IRF5D diluída em PBS (1 mg /kg / d, injectar um volume de 20 ul num ratinho de 20 g) subcutaneamente com uma agulha de calibre 27 através de uma técnica scruffing padrão ou por PBS sozinho para Tsk / + C57BL 6J / durante 21 dias.
    2. Anestesiar os ratos com isoflurano (5%) e efectuar um deslocamento cervical. Extirpar os corações, cortando abrir o tórax ao longo do esterno. Levante o coração com uma pinça e retire o coração.
    3. Lisar as corações com um tampão de lise contendo proteína mM de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, 0,5% de concentração de proteína de NP-40, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50 10 e determinar por Ensaio de Bradford 19.
    4. Revestir placas de 96 poços com C57Bl 6J matriz / cardíacos isolados como descrito na secção 7. Diluir o PBS suspenso C57Bl 6J matriz / cardíaca a uma concentração de 20 ug / mL e adicionar 30 uL da C57BL / 6J cardíaca a cada poço. Deixar repousar durante a noite a 37 ° C na incubadora.
    5. Cultura de células da veia umbilical humana, utilizando 500 ml de endotelial basal mEDIA com 0,4% de extracto de cérebro de bovino, 0,1% de ácido ascórbico, 0,1% de hidrocortisona, factor de crescimento epidérmico humano a 0,1%, soro fetal bovino a 2% e 0,1% de gentamicina / anfotericina B adicionado a ele. Cultura das células em placas de 96 poços a 5% de CO 2 e 95% de ar ambiente, com uma densidade de 25.000 células por poço. Estimular com concentrações crescentes de IRF5D entre 0 - 100 ^ g / mL no meio (volumes eram entre 0 e 50 ul / ml).
    6. Determinar a proliferação de células após três dias e avaliar as diferenças de absorvância em um leitor de microplacas. A reacção é um bio-redução do composto de tetrazólio MTS. NADPH ou NADH é produzido por enzimas desidrogenase em células metabolicamente activas.
    7. Como o composto de tetrazólio MTS é armazenado congelado a -20 ° C, descongelar o composto lentamente ao longo de aproximadamente 90 minutos à temperatura ambiente. Pipetar 20 mL em cada poço de uma placa de 96 poços, e adiciona-se 100 uL de meio de cultura a ele. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 a 4 h num humidified, 5% de CO 2 de câmara.
    8. Leia a absorvância a um comprimento de onda de 490 nm.
  2. Ensaio de apoptose através da actividade da caspase
    NOTA: O conjunto experimental é o mesmo que acima 3.1.1 a 3.1.5.
    1. Estimular as células com concentrações crescentes de IRF5D entre 0 - 100 ug / ml para o meio.
    2. Adicionar verde de detecção para o substrato de caspase 3/7 para o CEs e incubar durante 30 min a 37 ° C. Avaliar a fluorescência no leitor de microplacas, simultaneamente, com um comprimento de onda de absorção / emissão de 502/530 nm. Executar os experimentos em triplicado.
      NOTA: O agente fluorescente verde é um péptido de quatro aminoácidos ligados a um corante de ligação de ácido nucleico. Este reagente torna-se fluorescente quando clivada após a caspase 3 e 7 de ativação. Esta fluorescência é medida. A vantagem é a redução nos passos de lavagem.

4. Avaliação da IRF5 e ICAM-1 na audiçãot

  1. Administrar IRF5D diluída em PBS (1 mg / kg / d, injectar um volume de 20 ul num ratinho de 20 g) subcutaneamente com uma agulha de calibre 27 através de uma técnica scruffing padrão ou por PBS sozinho para TSK / + C57BL 6J / uma vez por dia durante 21 dias.
  2. Anestesiar os ratos com isoflurano (5%) e efectuar um deslocamento cervical. Extirpar os corações, cortando abrir o tórax ao longo do esterno. Levante o coração com uma pinça e retire o coração.
  3. Lisar as corações com um tampão de lise contendo proteína mM de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, 0,5% de concentração de proteína de NP-40, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50 10 e determinar por Ensaio de Bradford 19.
    1. Executar um western blot em lisados ​​de corações. Diluir as amostras de 25 ug de proteína total e um volume de 40 ul com tampão de amostra de Laemmli contendo 5% de mercaptoetanol. Executar as amostras sobre uma 4 - TGX gel de 15% a 50 mV durante 5 min. Aumentar a tensão de 100 mV durante 1 h até a frente de corante se esgote.
    2. Colocar o gel em 1x tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 190 mM, metanol a 20%, pH ajustado a 8,3, se necessário) e incubar durante 10 - 15 min.
    3. Montar o sanduíche de transferência (esponja, filtro, de gel, de membrana de celulose, filtro, esponja). Certifique-se de não haja bolhas no meio. A membrana deve ser no cátodo e o gel sobre o ânodo. Transferir para 1 h na câmara fria a 100 mA.
    4. No dia seguinte, lavar a mancha e em seguida bloquear a fundo em 5% de leite em pó desnatado durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lavar o blot com soro fisiológico tamponado com Tris contendo 5% de Tween três vezes durante 5 min cada.
    5. Incubar durante a noite com os anticorpos primários, utilizando anticorpos policlonais primários para IRF5 ou ICAM-1. Dilui-se os anticorpos em solução salina tamponada com Tris numa diluição de 1: 1000.
    6. Dilui-se a anticorpos secundários em solução salina tamponada com Tris e incubar o borrão durante 1 h à temperatura ambiente. burro para anticorpos secundários, o uso de rábano conjugado com peroxidase anti-rato IgL (1: 10.000) e peroxidase de rábano IgG de burro anti-cabra (1: 10.000), respectivamente.
    7. Aplicar quimioluminescência para a mancha após os componentes de mistura de acordo com o protocolo do fabricante e incubar durante 3 min a luminescência das bandas de interesse. Expor a mancha a um filme de raios-X. Use ImageJ para medir a densidade. Normalizar os valores de densidade das bandas de controlo 10.

5. Avaliação do número de células inflamatórias após IRF5 Inibição

  1. Administrar IRF5D diluída em PBS (1 mg / kg / d) subcutaneamente com uma agulha de calibre 27 através de uma técnica scruffing padrão ou por PBS sozinho para Tsk / + C57BL 6J / durante 21 dias.
  2. Anestesiar os ratos com isoflurano (5%) e efectuar um deslocamento cervical. Extirpar os corações, cortando abrir o tórax ao longo do esterno. Levante o coração com uma pinça e retire o coração. Pressão congelar e armazenar os corações excisados ​​até à análise.
  3. Monte os corações congelados na TISStitulares ue apropriadas para o criostato em uso. Corte de 10 mm de espessura cortes congelados em um criostato para imuno-histoquímica.
  4. Fixar as secções congeladas com 1% de paraformaldeído em tampão fosfato salino, durante 20 min à temperatura ambiente. Permeabilizar as secções com 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 5 min.
    Atenção: O paraformaldeído é um agente cancerígeno regulamentada e precisa ser tratada com cuidado.
  5. Diluir anti-CD64 de coelho, um monócito / macrófago marcador de 1: 200 em PBS. Aplicar as secções fixas e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  6. Lavagem das lâminas em PBS durante 5 minutos três vezes à temperatura ambiente.
  7. Diluir anti-rato NIMP, um marcador de neutrófilos primários 1: 200 em PBS. Aplicar as secções fixas e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  8. Lavam-se as lâminas durante 5 minutos três vezes com PBS à temperatura ambiente.
  9. Diluir os anticorpos secundários anti-coelho Alexa 488 e conjugado anti-rato conjugado Alexa 488 1: 200 em PBS.
  10. Aplicar anti-coelho Alexa 488 e conjugado anti-rato Alexa 488 anticorpos secundários conjugados com as secções durante 30 min a 37 ° C em conformidade. O volume de anticorpo varia de acordo com o tamanho da secção. O valor deve cobrir a secção generosamente. Na maioria dos casos, o volume é entre 100 e 200 uL.
  11. Use 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) como um corante nuclear em uma diluição de 1: 1000 em PBS. Adicionar 1 mL em 1 mL de PBS e usar o DAPI no último passo de lavagem. Adicionar media montagem aquoso para uma lamela e colocá-lo para o slide.
  12. Analisar as seções marcados com fluorescência por microscopia confocal utilizando uma objectiva de óleo de 40X. Use excitação comprimentos de onda 488 e emissões de comprimentos de onda superiores a 530 nm para CD64 e NIMP. DAPI estava animado com 360 nm e emitida a 460 nm em azul. Distinguir monócitos / macrófagos e neutrófilos (n = 10 imagens por anticorpo, a partir de três ratinhos em cada grupo diferente) por sua rotulagem diferente e contá-las. Expressar dados como o número de células contadas.

6. celular vasodilatação dependente após IRF5 Inibição

  1. Anestesiar / 6J de controlo e C57Bl / + TSK ratos com e sem tratamento de péptido com uma mistura de cetamina (80-100 mg / kg) / xilazina (10 - 12,5 mg / kg) mistura. Injectar a mistura de cetamina / xilazina intraperitoneal. Contenha o mouse manualmente.
    1. Utilizar um calibre 25 ou agulha menor. Inserir a agulha no quadrante inferior direito do abdome. Retirar o êmbolo antes da injecção para assegurar que a agulha não penetra num vaso sanguíneo ou do intestino.
  2. Uma vez que um nível suficiente de anestesia foi alcançado, garantir o mouse na posição supina, limpe a pele com álcool embebido gaze, e usando um par de tesouras abrir a cavidade torácica e remover o coração.
    NOTA: Exsanguination vai sacrificar o mouse e fazer dissecção mais fácil, aliviando a pressão na vasculatura minimizando, assim, o sangramento durante o corte vasos sanguíneos.
    1. Abra o usin pelega par de tesouras, cortando-se a partir da lateral do peito para a queixada com cuidado para não perturbar os tecidos subjacentes para a frente da mandíbula.
    2. Dissecar a artéria facialis por remoção do tecido macio em torno dele.
    3. Cuidado: não ferir o navio ou puxão na facialis artéria, mantendo o tecido exposto banhado em tampão MOPS (CaCl 2,0 mM 2 · 2H 2 O, EDTA 0,02 mM, glucose 5,0 mM, KCl 4,7 mM, MgSO4 1,17 mM · 7H 2 O, MOPS 3,0 mM, NaCl 145 mM, 1,2 mM de NaH 2 PO 4? H 2 O, ácido pirúvico 2,0 mM), para evitar a dessecação. Executar sob um zoom dissecando microscópio binocular estéreo (ampliação de 3,5X a 45X) e uma fonte de luz de fibra óptica.
  3. Isolar a artéria facialis.
    1. Agarrar a facialis proximal à primeira bifurcação e distal de onde a artéria vai ser cortado. Cortar a artéria da artéria original, a artéria carótida externa. Remover o arterie facialiss a partir de ratinhos de controlo, TSK / + ratinhos com e sem tratamento IRF5D.
    2. Enquanto ainda mantém a artéria nas pinças, corte os dois ramos saindo da facialis, permitindo que o navio a ser gentilmente levantou enquanto qualquer tecido circundante sem cortes podem ser identificados e cortada.
    3. Continuar desta maneira até a bifurcação é atingido corte ambas as artérias filha para libertar o navio. Não há necessidade de prender os recipientes antes do corte, devido à pressão aliviada na vasculatura de remover o coração. Colocar o recipiente em tampão de MOPS, enquanto a outra artéria facialis é dissecado e isolado.
    4. Canular os vasos, amarrando-os para pipetas de vidro com um diâmetro de terminal de 125-175 mm. Pré-carregar as pipetas de vidro e reservatórios de amortecimento com tampão MOPS.
      Atenção: Impedir que as bolhas de ar formando nas pipetas.
    5. Ate os vasos para as pipetas utilizando suturas oftálmicas.
  4. Montar as câmaras navio numa micr triocular invertidooscope com um anexo de câmera de vídeo. Executar o vídeo através de um sistema de medição de vídeo de pinça para medições na tela dos vasos. 20
    1. Pressurizar-os num processo de dois passos. Em primeiro lugar, com os reservatórios de MOPS-cheias a uma altura acima do recipiente igual a 20 mm Hg de pressão, abrir manualmente as válvulas nas linhas de stopcock reservatório para o vaso. Inspeccionar o navio para sinais de vazamento em torno dos laços e para baixo do comprimento do navio. Em segundo lugar, aumentar os reservatórios a 60 mmHg e inspecione novamente a embarcação.
    2. Uma vez pressurizada a 60 mmHg, permitir que os vasos para equilibrar durante 30 min.
  5. A fim de avaliar a vasodilatação em resposta a acetilcolina (10 -7 M a 10 -4), preconstrict o navio para um diâmetro de 50-75% do seu diâmetro máximo utilizando 1-3,0 x 10 -8 a 10 -7 M U46619. Depois de permitir que o navio estabilizar durante 6 min, adicionar ao banho de acetilcolina em passos de duração 2 min de modo a que oAs concentrações finais no banho são 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. Medir a vasodilatação em todos os três grupos.

7. Isolamento de Cardiologia Matriz Extracelular

  1. Anestesiar / 6J de controlo e C57Bl / + TSK ratos com e sem tratamento com péptido com isoflurano (5%) e efectuar um deslocamento cervical. Extirpar os corações, cortando abrir o tórax ao longo do esterno. Levante o coração com uma pinça e retire o coração.
  2. Colocar os corações removidos para um copo e adicionar 15 mL hipertónica 1% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS). Agitar corações na solução de SDS a 1% durante 18 h à temperatura ambiente para quebrar as células por adição de uma barra de agitação à solução de SDS a 1% e colocando o recipiente sobre uma placa de agitação.
    Cuidado: Esteja ciente de que a matriz extracelular se desintegrará se deixado muito tempo na solução hipertônica. Por outro lado, se os corações não são agitados tempo suficiente em solução hipertónica, em seguida, as células não irão adequadamentedissolver e haverá detritos celulares deixada no copo.
  3. Lavar durante 30 min em 15 mL de 0,5% de Triton X-100. Em seguida, lave durante 15 min com 15 mL de PBS. Decellularize cada coração individualmente.
  4. Snap-congelar a matriz extracelular em azoto líquido e powderize a matriz extracelular cardíaca congelado com um almofariz pré-arrefecido e um pilão.
  5. Adicione uma suspensão da matriz pulverizada em PBS contendo 1% de antibiótico. O volume adicionado na maioria dos casos é de 300 uL. Sonicate a suspensão por 30 - 60 s no gelo no ajuste alto.
    NOTA: É muito importante que a amostra mantém fria. Esteja ciente de que a suspensão é muito viscoso devido ao teor de glicanos de alta proteína.
  6. Determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de Bradford.
    NOTA: Certifique-se de que há anti-bióticos e anti-fúngicos na suspensão. Penicilina / estreptomicina são as mais vulgarmente utilizadas e recomendadas.

8. Avaliação da translocação nuclear por Immunohistochemistry

  1. Para pratos de revestimento e as lâminas usar uma concentração final de 20 ug / mL da matriz extracelular cardíaca em PBS. Pipetar 500 ul da solução de matriz extracelular cardíaca em uma placa de 100 mm, para revestimento e 150 ul da solução de matriz extracelular definitiva sobre uma lâmina.
  2. Inibir IRF5 adicionando IRF5D numa concentração de 50 ug / mL durante 24 h a miócitos cardíacos de rato neonatal em cultura. Deixar culturas de controlo não tratado de miócitos.
  3. Avaliar o tráfico de IRF5 a partir do citosol para o núcleo através de imunofluorescência e analisar por microscopia confocal. Identificar a rotulagem verde para IRF5, identificar a mancha DAPI azul para o núcleo
  4. Aplicar o anticorpo anti-IRF5 primária. O anticorpo primário foi utilizado numa diluição de 1: 200 em PBS. Incubar as lâminas durante 30 minutos a 37 ° C e seguir com três passos de lavagem de 5 minutos. O anticorpo secundário era anticorpo de IgG anti-ratinho de cabra Alexa-488 marcado.
  5. Dilui-se o anticorpo secundário de 1: 1000 dilução em PBS. Incubar o anticorpo secundário durante 30 min a 37 ° C. Alcançar mancha nuclear com DAPI. Diluir DAPI 1: 1000 em PBS. Lavam-se as lâminas com um total de 3 vezes, durante 5 min e adicionar DAPI para o terceiro e último passo de lavagem.
  6. Tráfico de captura por meio de microscopia confocal e intensidade de fluorescência medida nos núcleos e citosol como previamente descrito 10. Identificar a rotulagem verde para IRF5, identificar a mancha DAPI azul para o núcleo. As células que exibem núcleos azuis com a rotulagem em verde os contêm IRF5 activado, que de tráfico a partir do citosol para o núcleo. rotulagem verde Quando IRF5 não é activado encontra-se no citosol.
  7. Analisar as células marcadas com fluorescência por microscopia confocal utilizando uma objectiva de óleo de 40X. Use um comprimento de onda de excitação de 488 nm e emissão comprimentos de onda superiores a 530 nm para IRF5. Use um comprimento de onda de excitação de 360 ​​nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm para a visualização de DAPI.

9. Estatisticas

  1. Realizar a análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas dentro e entre os grupos. Siga ANOVA com a modificação de t de Student-teste de Bonferroni. Expresso de dados como o erro padrão da média.

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Resultados

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Os resultados demonstrados na Figura 1 mostra como criar um peptídeo. A Figura 1, superior esquerdo, mostra a região (entre os 2 setas amarelas, aminoácidos (aa) 425-436) em IRF5 que é fosforilado por um número de quinases. Figura 1, canto superior direito, mostra um oval amarelo onde domínio fosforilada de IRF5 liga. A estrutura dimérica de 3DSH foi rodado para observar uma fenda ou vale para a esquerda da hélice 2 (aa303-312). Isto é, ...

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Discussão

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O objetivo era projetar um inibidor IRF5 para elucidar o papel do IRF5 sobre a inflamação, fibrose e função vascular nos corações de TSK / + camundongos. As descobertas são que IRF5D não induziu a proliferação ou a apoptose. Além disso, a inflamação foi reduzida e a função vascular melhorada. Estes dados sugerem que IRF5 desempenha um papel mecanicista importante no desenvolvimento de inflamação e fibrose no coração de TSK / + ratinhos e que tem o potencial de servir como um alvo terapêutico.

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) e HL-102836 (KAP) e Cimphoni Life Sciences (parte do salário de DW). Os autores agradecem a Meghann Sytsma pela edição do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  Triton X 100Sigma AldrichX100- 100ml
Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG anticorpo Reagente Bardford Thermo FisherA11001
Thermo Fisher23200Pierce 
BiosensorsForte-BioMR18-0009
CD64 (H-250)Santa Cruz Biotechnologiessc-15364
CellEvent Caspase-3/7 SubstrateThermo Fisher/Life TechnologiesC10427
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kitPromegaG3580Promega
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo FisherD-1306diluição 1:1.000 em PBS
burro anti rato Alexa 488Thermo FisherA-21208diluição 1:1.000 em PBS
ECL maisGE healthcare/AmershamRPN2133Depois de muita tentativa e erro, voltamos a este
microscópio Eclipse TE 200-U com software de varredura a laser EZ C1Nikon
cabra anti coelho Alexa 488Thermo FisherA-11008Diluição 1:1.000 em PBS
HRP  anti-cabraSanta Cruz Biotechnologiessc-516086!:Diluição de 10.000 em TBS
HRP burro anti-camundongoSanta Cruz Biotechnologiessc-2315Diluição 1:10.000 em
TBS ICAM-1corpoSanta Cruz Biotechnologiessc-1511Diluição 1:200 em
PBS IRF5 anticorpo (H56)Santa Cruz Biotechnologiessc-98651
Leitor de micro placas Elx800Marcador
Santa Cruz Biotechnologiessc-133821Diluição 1:200 em
PBS Octeto REDForte Bioligação à proteína-proteína
Design de peptídeo  Software Medit SARCSB.org
Síntese de proteína IRF5 recombinanteTopGene Technologiesexpressão de proteínas, serviço de síntese
dodecil fosfato de sódioSigma Aldrich436143detergente
FarmáciaCetamina Programação III substância controlada, prescipção necessária 
XylazineMedVet
3.5X-45X Microscópio Estéreo Zoom de Dissecção Trinocular com Luzes LEDGooseneck Am ScopeSKU: SM-1TSX-L6W
Colunas de Dessalinização ZebaThermofisher2161515
Endotelial Basal Media EBM Bullet kitLonzaCC-3124contém fontes de crescimento
VIA-100K  Boeckeler Instruments
4 - 15% TGX gelBio-Rad5671081
MedSuMo softwareMedit, Palaiseau, França
Laemmli BufferBioRad
de neutrófilos NIMP da Biotek

Referências

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