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Artigo de método

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

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DOI:

10.3791/55045

⸱

21 de janeiro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Parkinson’s Institute and Clinical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo de cultura leptomeninges explante a partir de cérebro pós-morte humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar fibroblastos meninges fibronectina-positiva dentro de 6-8 semanas e criopreservação de aproximadamente 20-30 milhões de células.

Resumo

Apesar de grandes progressos foram feitos na caracterização clínico da doença de Parkinson, vários estudos relatam que o diagnóstico da doença de Parkinson não é patologicamente confirmada em até 25% da doença clinicamente diagnosticada de Parkinson. Portanto, o tecido coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de doença de Parkinson idiopática pode ter uma alta taxa de erros de diagnóstico; portanto, os estudos in vitro a partir de tais tecidos para estudar a doença de Parkinson como um modelo pré-clínico pode tornar-se inútil.

Através da recolha leptomeninges humanos pós-mortem com um diagnóstico neuropatológico confirmado de doença de Parkinson e caracteriza-se por perda de células nigroestriatal e inclusões de proteínas intracelulares denominadas corpos de Lewy, pode-se ter a certeza de que o parkinsonismo clinicamente observada não é causado por um outro processo de doença subjacente (por exemplo, de tumores, arteriosclerose).

Este protocolo presents a dissecação e preparação de leptomeninges humanos pós-morte para derivação de uma cultura de fibroblastos meníngea. Este processo é robusto e tem uma elevada taxa de sucesso. O desafio da cultura é esterilidade como a aquisição cérebro geralmente não é realizado sob condições estéreis. Portanto, é importante para completar o meio de cultura com um cocktail de penicilina, estreptomicina, e anfotericina B.

A derivação de fibroblastos meninges de casos de autópsia-confirmadas com a doença de Parkinson fornece a base para a modelagem in vitro da doença de Parkinson. fibroblastos meninges aparecem 3-9 dias após a preparação da amostra e cerca de 20-30 milhões de células podem ser criopreservados em 6-8 semanas. A cultura de fibroblastos meníngea é homogéneo e as células expressam fibronectina, um marcador comumente usado para identificar as meninges.

Introdução

Meninges constituído por três membranas que protegem o cérebro: dura-máter máter, aracnóide e pia. Mais recentemente, tem sido reconhecido que as meninges também desempenham um papel importante no desenvolvimento do cérebro e do cérebro 1 homeostase. Meninges são derivadas de mesênquima e células derivadas da crista neural e interessantemente, foi mostrado que as células progenitoras que residem em meninges pode dar origem a neurónios in vitro e in vivo após o transplante 2, 3, 4. Culturas meninges foram também utilizados com sucesso como camadas alimentadoras, como eles possuem actividade indutora derivada de células de estroma para a diferenciação de células estaminais embrionárias em neurónios dopaminérgicos 5. Além disso, leptomeninges têm o potencial para se diferenciar em neurónios directamente, astrócitos, oligodendrócitos e sob condições isquémicas 6.

Para este protocolo, as amostras de meninges pós-morte humanos são recolhidos a partir do aracnóide e pia, chamados coletivamente os leptomeninges, e são adquiridos como parte de uma doação cérebro humano para fins de pesquisa. Dissecção do cérebro é realizada dentro de 24 h da morte e da amostra leptomeninges é colocado em meio de cultura frio para posterior processamento dentro do próximo 6-8 h, conforme ilustrado aqui neste protocolo.

Este protocolo descreve a dissecção e a preparação de amostras de meninges humanos para o desenvolvimento de culturas de células primárias leptomeninges paciente. O tecido é cortado em pedaços de aproximadamente 25-30 3 mm x 3 mm quadrados. Três peças são colocadas em cada poço de 6 poços e realizou-se com lamelas de vidro redondas revestidas com gelatina. A dissecção meninges leva cerca de 25-35 minutos. O principal desafio com esta cultura é a esterilidade como a aquisição cérebro, transporte e dissecção geralmente não são realizados em condições estéreis. Tor conseguinte, é importante para completar o meio de cultura com um cocktail de penicilina, estreptomicina, e anfotericina B e usar pratos de poços múltiplos para separadamente pedaços de tecido de cultura.

Crescimento de fibroblastos meníngeos ocorre geralmente dentro da primeira semana. Meios é mudada a cada dois ou três dias até que as células estão confluentes, e as células são passadas enzimaticamente. Os fibroblastos meninges são criopreservadas em 1 milhão de células por mL / recipiente em mídia criopreservação. Com este protocolo, 20-30 milhões de fibroblastos meninges pode ser derivado de 6-8 semanas para a criopreservação. aplicações a jusante desses fibroblastos meninges são culturas primárias para a pesquisa da doença, a diferenciação neuronal direta ou derivação de células-tronco pluripotentes induzidas a partir das leptomeninges para a compreensão dos mecanismos da doença e para o desenvolvimento de drogas.

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Protocolo

O registro de doação do cérebro inclui a documentação, o registando a sua intenção de doar. A permissão da autópsia para a recuperação do tecido é fornecido pelo parente mais próximo, conforme permitido por lei. Pesquisas utilizando amostras de autópsia recolhidos são analisados ​​pelo conselho de revisão institucional (IRB) para garantir o cumprimento Health Insurance Portability e Accountability Act normas (HIPAA).

NOTA: As amostras leptomeninges são recolhidos pelo dissector cerebral ou neuropatologista durante uma dissecção cérebro e são armazenados em 50 tubos cônicos mL contendo 25-30 mL meninges meios de crescimento. A amostra é armazenada a 4 ° C até à preparação da amostra. O tratamento deve ser realizado tão rapidamente quanto possível, a viabilidade das células diminui com o tempo de pós-mortem.

1. Set-up antes de iniciar o leptomeninges Dissection

NOTA: As etapas 1,1-1,3 devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica.

  1. Prepare meio de crescimento meninges através da combinação de 375 mL de Dulbecco Modified Eagle Media, 100 mL de soro bovino fetal, 5 ml 10 mM de aminoácidos não essenciais, 5 mL de 200 mM de L-alanil-L-glutamina, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM, 5 ml 10000 U / mL de penicilina / estreptomicina e 5 ml de 250 ug / mL de anfotericina B, em 500 mL unidade de filtro. Filtrar e misturar. Use a mídia por até quatro semanas.
  2. Coloque todos os materiais na cabine de segurança biológica, antes de iniciar a dissecção: pratos de Petri 4x, 2x placas de 6 poços, 2x escalpelos esterilizados, 15-20 lamelas de 15 mm, tampão fosfato salino (PBS), pipetas serológicas, aspirando pipetas.
  3. Adicionar 1 ml de solução esterilizada por autoclave de gelatina a 0,1% a cada poço de uma placa de 6 poços. Colocou o prato de lado por 30-60 min. Prepare 2x placas de 6 poços.

2. Preparação de leptomeninges Amostra

NOTA: As etapas 2,1-2,3 devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica.

  1. Adicionar aproximadamente 10 mL de PBS paraa 10 cm de placa de cultura de tecido estéril e colocar a amostra no prato meninges. Utilizando uma pinça, lavar cuidadosamente leptomeninges com PBS para remover o sangue.
  2. Transferir as meninges para uma nova placa de cultura de tecidos de 10 cm contendo 10 ml de PBS fresco e continuar a lavar. Repita como necessário para remover o máximo de sangue possível.
  3. Usando dois bisturis, cortados leptomeninges tecido em uma cerca de 6 cm x 6 cm grande pedaço.
  4. Coloque a tampa sobre um prato de cultura e transferência para um microscópio de dissecação numa câmara de fluxo laminar horizontal.

3. Dissecção da leptomeninges Tissue

NOTA: As etapas 3,1-3,3 devem ser executadas dentro de uma câmara de fluxo laminar horizontal usando um microscópio de dissecação.

  1. Remover os vasos sanguíneos a partir de uma região sobre a peça leptomeninges (passo 2.3) suficientemente grande para criar pelo menos 20-25 3 peças mm x 3 mm. Segure as leptomeninges em lugar com um bisturi e com a outra, usar um mo raspagem suave e superficialção para separar os vasos.
  2. Cortar pequenos quadrados de tecido da região preparado. Corte em um processo passo a passo pela primeira confecção de peças maiores e, em seguida, cortando os em seções menores.
  3. Usar um bisturi para manter o tecido no lugar e outra bisturi para cortar o tecido com um movimento de balanço. Devido à consistência do tecido, é difícil para deslizar os bisturis uns contra os outros. Isso só vai rasgar o tecido distante e resulta em bordas irregulares.
  4. Continue cortando as peças pela metade até que haja cerca de 20-25 peças 3 mm x 3 mm.

4. Transmissão de dissecado meninges partes em placas de cultura de tecidos

NOTA: Passo 4 deve ser efectuado dentro de uma cabine de segurança biológica.

  1. gelatina aspirado a partir da placa de 6 poços (a partir do passo 1.3). Adicionar 1 mL de meio de crescimento meninges a cada poço. Utilizando uma pinça estéril, colocar 3-4 peças de biópsia em cada poço.

5. A colocação de tampa desliza sobre Meninges Pieces

NOTA: As etapas 5,1-5,2 devem ser executadas dentro de uma câmara de fluxo laminar horizontal usando um microscópio de dissecação.

  1. Cubra os pedaços com 1-2 lamelas circulares de 15 mm estéreis por poço.
  2. Pressionar firmemente com uma pinça para garantir que as peças são tocar no fundo da placa. Isto permite a fixação das peças de tecido para o fundo do poço.
  3. Colocar a placa de 6 poços a uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2.

Manutenção Cultura 6. celular

NOTA: As etapas 6,1-6,3 devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica. Lidar com placas de cultura com cuidado como lamelas não deve se mover e deslocar as peças meninges.

  1. Após 2 dias em cultura, adicionar um adicional de 1 ml de meio de crescimento fresco as meninges a cada poço.
  2. No dia 7, aspirar cuidadosamente os meios de comunicação e adicionar 2 mL de meio fresco a cada poço.
  3. Após o Dia 9, continuam a mudar meios de crescimento a cadaoutro dia até que a cultura se torna confluente.

7. Passaging

NOTA: Todas as etapas devem ser executadas dentro de uma cabine de segurança biológica. Uma vez que os fibroblastos meníngeos ter migrado para fora dos pedaços de tecido das meninges e começam a crescer em direcção as bordas do recipiente de cultura, expandir fibroblastos meníngeos em maior placa de cultura.

  1. Antes de iniciar o Passaging, revestir a placa de cultura com 1% de gelatina durante 15-30 min.
  2. media aspirado de 6 poços prato e lavar as células com 2 ml PBS.
  3. Adicionar 1 ml de tripsina / EDTA a cada poço e incubar a 37 ° C durante 5-10 min. Não é necessário retirar as peças de cobertura ou do tecido meníngeo para este passo.
  4. Quando as células são arredondadas e começar a destacar, adicionar 2 mL de meio de cultura.
  5. células de pipeta cima e para baixo para interromper completamente todos os aglomerados e transferir a solução de célula para maior prato de cultura.
  6. Usar uma proporção de 1: 3 a 1: 4 para combinar as células a partir de três pratos de 6 poços empara uma placa de cultura T75.
  7. Uma vez que as células de fibroblastos meníngeas estão confluentes em frascos de cultura T75, trypsinize as células, e criopreservar em meios de criopreservação a 1x10 6 células / ml por frasco. Um balão de cultura T75 com fibroblastos meninges confluentes contém cerca de 5-7 milhões de células.

8. Caracterização dos fibroblastos Meníngeas por imunocoloração

NOTA: Antes de iniciar o procedimento, preparar solução de paraformaldeído a 4%, soro de cabra normal a 5% em PBS (tampão de bloqueio), 0,3% de Triton X-100 em PBS (tampão de permeabilização), soluções de anticorpos primários e secundários, e 1 ug / mL de Hoechst 33342 diluído em PBS a partir de 10 mg estoque / mL.

  1. Semente de 15.000 a 30.000 fibroblastos meníngeos em slides câmara de 8 poços revestidos com gelatina a 0,1%.
  2. Depois de 24 h, quando as células são ligadas, fixar as células em 100 uL de paraformaldeído a 4% por poço, durante 10 min à temperatura ambiente. Lavar os poços 3 vezes com PBS 1x.
  3. Permeabilizar as células com 150 uL de 0,3% de Triton X-100 durante 5 min à temperatura ambiente. Lavar os poços 3 vezes com PBS 1x.
  4. Adicionar 200 uL de solução de bloqueio (PBS + 5% de soro normal de cabra) durante 1 h à temperatura ambiente.
  5. Aspirar a solução de bloqueio e adicionar 150 uL de anticorpos primárias desejadas diluído em solução de bloqueio. Para double-coloração, prepare diluições de trabalho dos anticorpos primários em tubos de centrífuga separados no gelo como se segue:
    1. Prepare a diluição de 1: 300 de anti-fibronectina + 1: 200 de diluição de anti-nestina em solução de bloqueio. Prepare diluição 1: 250 de anti-SERPINH1 + 1: 1000 diluição de anti-TUJ1 em solução de bloqueio. Prepare 1: 250 de diluição de anti-SERPINH1 + 1: 100 de diluição de anti-SOX2 em solução de bloqueio
  6. Incubar a 4 ° C durante a noite.
  7. Lavar os poços 3 vezes com PBS 1x.
  8. Prepare um trabalho diluição 1: 400 de fluorescente etiquetado anticorpos secundários de cabra anti-coelho (verde; Ex / Em 2 495/519 nm) e de cabra anti-ratinho (vermelho; Ex / Em 590/617 nm 2) em solução de bloqueio e adicionar 100 uL a cada poço. Incubar durante 1 h, no escuro, à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços uma vez com PBS 1x.
  9. Adicionar 100 uL de 1 ug / ml de Hoechst 33342 (azul; Ex / Em 358/461 nm 2) solução a cada poço e incuba-se no escuro durante 3 min. Lavar os poços 3 vezes com 1x PBS, deixando na final de lavagem 1x PBS no poço, e cobrir o slide com folha de alumínio.
  10. Analise as células sob microscópio fluorescente.

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Resultados

Quando o protocolo de processamento tem sido bem sucedida leptomeninges, crescimento de fibroblastos meníngeos primeiro se observa três a nove dias após a dissecação, embora isso possa depender do comprimento do intervalo pós-mortem de cérebro. A Figura 1 demonstra culturas de fibroblastos meninges de quatro doadores diferentes. A Figura 1A mostra um pedaço leptomeninges pressionada por uma lamela de vidro (linha diagonal escuro) e crescimento de fibrobl...

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Discussão

Este protocolo descreve um protocolo simples e robusto para derivar de uma cultura de fibroblastos a partir de meninges leptomeninges postmortem humanos recolhidos em conjunto com uma doação cérebro. Há muito poucas descrições de protocolos para derivar culturas de células a partir de material humano post-mortem. Dois estudos descrevem culturas de fibroblastos 7, 8, derivados de pele 9, um estudo descreve amostras da dura

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O desenvolvimento deste protocolo foi financiado por doações privadas direcionadas ao Programa de Doação de Cérebros do Instituto de Parkinson.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de Petri CorningFisher Scientific351029
Nunc Placa de 6 poçosFisher Scientific14-832-11
Lamínulas de 15 mmFisher Scientific12-545-83 15CIR-1D
Bisturis, lâmina estéril, No. 15Miltex4-415
Pinça de ponta de precisão curvaFisher Scientific16-100-122
Pipetas sorológicasFisher Scientific13-678-11E
Pipetas PasteurFisher Scientific22-230490
GelatinaSigmaG1890-100G
Tampão de fosfato SalinoFisher ScientificSH30264.02
Corning Unidade de filtro de 500 mLFisher Scientific430770Combine componentes de mídia e filtro.
Frascos Tratados com Cultura de Células Nunc com Tampas de Filtro, T175 cm2 Thermo Scientific178883
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Growth Media
Hyclone DMEMFisher ScientificSH30081.02
Hyclone FBSFisher Solução deSH30910.03
MEM (100x)Suplemento Thermo Fisher11140-050
GlutaMAX (100x)Thermo Fisher35050-061
Piruvato de Sódio (100 mM)Thermo Fisher11360-070
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)Thermo Fisher15140-122
Anfotericina B (Solução Amarela/250 µ g/mL)Fisher ScientificBP264520
Bambanker Freeze 120 mLFisher ScientificNC9582225
NomeEmpresa<strong>Número de catálogoComentários
Coloração de Fibronectina
8 lâminas de câmara de poço Fisher Scientific1256518
20% de paraformaldeído Ciências de Microscopia Eletrônica15713
Triton X-100 SigmaT8787
100% Glicerol BioRad9455
Soro de cabra 100% normalFisher Scientific101098-382
Anticorpo anti-fibronectina [F1]Abcamab32419diluição 1:300 em solução de bloqueio
Anti-SERPINH1SigmaS5950-200uldiluição 1:250 em solução de bloqueio
Anti-SOX2MilliporeMAB4343diluição 1:100 em solução de bloqueio
Anti-NestinMilliporeMAB53261:200 diluição em solução de bloqueio
Anti-TUJ1CovanceMMS-435Pdiluição 1:1.000 em solução de bloqueio
Alexa Fluor 488 anti-coelhoThermo FisherA11029diluição 1:400 em solução de bloqueio; (canal verde; Ex/Em2 495/519 nm) 
Alexa Fluor 555 anti-mouseThermo FisherA21424diluição 1:400 em solução de bloqueio; (canal vermelho; Ex/Em2 590/617 nm) 
Hoechst 33342 manchaThermo FisherH3570diluir a uma concentração final de 1,0 μ g/mL; (canal azul; Ex/Em2 358/461 nm)
Fornecedores são sugestões, produtos similares de fornecedores alternativos também podem ser usados.
Aminoácidos Não Essenciais Scientific

Referências

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