O protocolo de cultura leptomeninges explante a partir de cérebro pós-morte humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar fibroblastos meninges fibronectina-positiva dentro de 6-8 semanas e criopreservação de aproximadamente 20-30 milhões de células.
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Artigo de método
Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apesar de grandes progressos foram feitos na caracterização clínico da doença de Parkinson, vários estudos relatam que o diagnóstico da doença de Parkinson não é patologicamente confirmada em até 25% da doença clinicamente diagnosticada de Parkinson. Portanto, o tecido coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de doença de Parkinson idiopática pode ter uma alta taxa de erros de diagnóstico; portanto, os estudos in vitro a partir de tais tecidos para estudar a doença de Parkinson como um modelo pré-clínico pode tornar-se inútil.
Através da recolha leptomeninges humanos pós-mortem com um diagnóstico neuropatológico confirmado de doença de Parkinson e caracteriza-se por perda de células nigroestriatal e inclusões de proteínas intracelulares denominadas corpos de Lewy, pode-se ter a certeza de que o parkinsonismo clinicamente observada não é causado por um outro processo de doença subjacente (por exemplo, de tumores, arteriosclerose).
Este protocolo presents a dissecação e preparação de leptomeninges humanos pós-morte para derivação de uma cultura de fibroblastos meníngea. Este processo é robusto e tem uma elevada taxa de sucesso. O desafio da cultura é esterilidade como a aquisição cérebro geralmente não é realizado sob condições estéreis. Portanto, é importante para completar o meio de cultura com um cocktail de penicilina, estreptomicina, e anfotericina B.
A derivação de fibroblastos meninges de casos de autópsia-confirmadas com a doença de Parkinson fornece a base para a modelagem in vitro da doença de Parkinson. fibroblastos meninges aparecem 3-9 dias após a preparação da amostra e cerca de 20-30 milhões de células podem ser criopreservados em 6-8 semanas. A cultura de fibroblastos meníngea é homogéneo e as células expressam fibronectina, um marcador comumente usado para identificar as meninges.
Introdução
Meninges constituído por três membranas que protegem o cérebro: dura-máter máter, aracnóide e pia. Mais recentemente, tem sido reconhecido que as meninges também desempenham um papel importante no desenvolvimento do cérebro e do cérebro 1 homeostase. Meninges são derivadas de mesênquima e células derivadas da crista neural e interessantemente, foi mostrado que as células progenitoras que residem em meninges pode dar origem a neurónios in vitro e in vivo após o transplante 2, 3, 4. Culturas meninges foram também utilizados com sucesso....
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Protocolo
O registro de doação do cérebro inclui a documentação, o registando a sua intenção de doar. A permissão da autópsia para a recuperação do tecido é fornecido pelo parente mais próximo, conforme permitido por lei. Pesquisas utilizando amostras de autópsia recolhidos são analisados pelo conselho de revisão institucional (IRB) para garantir o cumprimento Health Insurance Portability e Accountability Act normas (HIPAA).
NOTA: As amostras leptomeninges são recolhidos pelo dissector cerebral ou neuropatologista durante uma dissecção cérebro e são armazenados em 50 tubos cônicos mL contendo 25-30 mL meninges meios de crescimento. A amostra é ar....
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Resultados
Quando o protocolo de processamento tem sido bem sucedida leptomeninges, crescimento de fibroblastos meníngeos primeiro se observa três a nove dias após a dissecação, embora isso possa depender do comprimento do intervalo pós-mortem de cérebro. A Figura 1 demonstra culturas de fibroblastos meninges de quatro doadores diferentes. A Figura 1A mostra um pedaço leptomeninges pressionada por uma lamela de vidro (linha diagonal escuro) e crescimento de fibrobl.......
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Discussão
Este protocolo descreve um protocolo simples e robusto para derivar de uma cultura de fibroblastos a partir de meninges leptomeninges postmortem humanos recolhidos em conjunto com uma doação cérebro. Há muito poucas descrições de protocolos para derivar culturas de células a partir de material humano post-mortem. Dois estudos descrevem culturas de fibroblastos 7, 8, derivados de pele 9, um estudo descreve amostras da dura
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O desenvolvimento deste protocolo foi financiado por doações privadas direcionadas ao Programa de Doação de Cérebros do Instituto de Parkinson.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri Corning | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc Placa de 6 poços | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Lamínulas de 15 mm | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Bisturis, lâmina estéril, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Pinça de ponta de precisão curva | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Pipetas sorológicas | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipetas Pasteur | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatina | Sigma | G1890-100G | |
| Tampão de fosfato Salino | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning Unidade de filtro de 500 mL | Fisher Scientific | 430770 | Combine componentes de mídia e filtro. |
| Frascos Tratados com Cultura de Células Nunc com Tampas de Filtro, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Solução de | SH30910.03 | |
| MEM (100x) | Suplemento Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Piruvato de Sódio (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Anfotericina B (Solução Amarela/250 µ g/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Nome | Empresa< | strong>Número de catálogo | Comentários |
| Coloração de Fibronectina | |||
| 8 lâminas de câmara de poço | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% de paraformaldeído | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glicerol | BioRad | 9455 | |
| Soro de cabra 100% normal | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anticorpo anti-fibronectina [F1] | Abcam | ab32419 | diluição 1:300 em solução de bloqueio |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | diluição 1:250 em solução de bloqueio |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | diluição 1:100 em solução de bloqueio |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 diluição em solução de bloqueio |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | diluição 1:1.000 em solução de bloqueio |
| Alexa Fluor 488 anti-coelho | Thermo Fisher | A11029 | diluição 1:400 em solução de bloqueio; (canal verde; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | diluição 1:400 em solução de bloqueio; (canal vermelho; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 mancha | Thermo Fisher | H3570 | diluir a uma concentração final de 1,0 μ g/mL; (canal azul; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Fornecedores são sugestões, produtos similares de fornecedores alternativos também podem ser usados. |
Referências
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential....
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Reimpressões e permissões
