Nós apresentamos um método simples para a construção de sistemas de cultivo nematóide 3D chamado NGT-3D e NGB-3D. Estas podem ser usadas para estudar a aptidão nematóide e comportamentos em habitats que são mais semelhantes aos naturais Caenorhabditis elegans habitats do que as placas padrão 2D cultura elegans laboratório C..
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso de organismos modelo genéticos, como Caenorhabditis elegans, levou a descobertas seminais em biologia nas últimas cinco décadas. A maior parte do que sabemos sobre C. elegans é limitada ao cultivo em laboratório dos nematóides que podem não refletir necessariamente os ambientes que normalmente habitam na natureza. O cultivo de C. elegans em um habitat 3D que é mais semelhante à matriz 3D que os vermes encontram em frutas podres e composto vegetativo na natureza pode revelar novos fenótipos e comportamentos não observados em 2D. Além disso, experimentos em 3D podem abordar como os fenótipos que observamos em 2D são relevantes para o verme na natureza. Aqui, um novo método no qual C. elegans cresce e se reproduz normalmente em três dimensões é apresentado. O cultivo de C. elegans em Nematoid Growth Tube-3D (NGT-3D) pode nos permitir medir a aptidão reprodutiva de cepas de C. elegans ou diferentes condições em um ambiente 3D. Também apresentamos um novo método, denominado Garrafa de Crescimento de Nematóides-3D (NGB-3D), para cultivar C. elegans em 3D para análise microscópica. Esses métodos permitem que os cientistas estudem a biologia de C. elegans em condições que refletem mais os ambientes que encontram na natureza. Isso pode nos ajudar a entender a relevância evolutiva subjacente da fisiologia e do comportamento de C. elegans que observamos em laboratório.
Introdução
O estudo do nematóide Caenorhabditis elegans em laboratório levou a descobertas seminais no campo da biologia nas últimas cinco décadas1. C. elegans foi o primeiro organismo multicelular a ter seu genoma sequenciado em 19982, e tem sido inestimável na compreensão das contribuições de genes individuais para o desenvolvimento, fisiologia e comportamento de um organismo inteiro. Os cientistas agora estão procurando entender melhor como esses genes podem contribuir para a sobrevivência e aptidão reprodutiva dos organismos em seus ambientes naturais, fazendo perguntas sobre ecologia e evolução no nível genético3-5.
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Protocolo
1. Prepare Soluções para NGT-3D e NGB-3D
- Preparar as seguintes soluções esterilizadas: 1 L de solução de NaCl a 0,1454 M, 1 L de 1 M de CaCl2, 1 L de 1 M de MgSO4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 H KPO tampão 4 (108,3 g de KH 2 PO 4 e 35,6 g de K 2 HPO 4, e preencher H2O a 1 L). Produção de NGM usando essas soluções podem ser encontradas em um protocolo anterior 10.
- soluções autoclave a 121 ° C, 15 min.
- Preparar 50 ml de uma solução estéril a 5 mg / ml de colesterol. Em um tubo cónico de 50 mL, misturar 0,25 g de colesterol e 50 ml de 99,99....
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Resultados
A construção de NGT-3D é um protocolo simples e directo que resulta em um tubo de ensaio de agar-enchido com pequenas colónias bacterianas espaçadas ao longo do ágar (Figura 1A). Worms pode circular livremente através da matriz de agar, encontrar e consumir as colónias de bactérias. Para confirmar se o C. elegans podem se reproduzir e crescer normalmente na NGT-3D, comparou fertilidade e desenvolvimento larval em 3D com placas padrão 2D NGM. No ensaio de tamanho.......
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Discussão
O cultivo laboratorial de C. elegans utilizando as placas de meio de crescimento nematóide clássicos foi crucial para as centenas de descobertas importantes que a pesquisa em C. elegans tem prestado. Aqui, nós apresentamos novos métodos de cultivar C. elegans em um ambiente que reflete com mais precisão seus habitats tridimensionais naturais. Embora outros métodos têm sido utilizados para observar C. elegans em 3D 13, este é o primeiro protocolo que permite a cultura de ver.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma nova Investigator Grant [2014R1A1A1005553] da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) para JIL; e uma Universidade Yonsei líder futuro Desafio Grant [2015-22-0133] para JIL
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Caldo LB, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Cloreto de sódio | DAEJUNG | 7548-4400 | 58,44 MW |
| Ágar, Granulado | Difco | 214530 | |
| Peptona | Bacto | 211677 | |
| Cloreto de cálcio, di-hidratado | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147,02 MW |
| Colesterol | Bio Básico | CD0122 | 386,67 MW |
| Álcool etílico | B& J | RP090-1 | 99,99%; 46,07 MW |
| Sulfato de magnésio, anidro | Bio Basic | MN1988 | 120,37 MW |
| Fosfato de potássio monobásico, anidro | Bio Basic | PB0445 | 136,09 MW |
| 2'-desoxi-5-fluorouridina | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246,19 MW |
| Fosfato de potássio dibásico anidro | Bio Basic | PB0447 | 174,18 MW |
| Tubos de ensaio multiuso | Stockwell Scientific | ST.8570 | ml |
| Tampas de tubo de ensaio | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Frasco de cultura de células | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| Cabeça de câmera colorida de alta definição | Nikon | DS-Fi2 | |
| Unidade de controle baseada em PC | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Software de imagem de microscópio | Nikon | MQS32000 |
Referências
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science.
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Reimpressões e permissões
