Artigo de método

cultivo de Caenorhabditis elegans Em três dimensões em Laboratório

DOI:

10.3791/55048

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12 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Neste artigo

Resumo

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Nós apresentamos um método simples para a construção de sistemas de cultivo nematóide 3D chamado NGT-3D e NGB-3D. Estas podem ser usadas para estudar a aptidão nematóide e comportamentos em habitats que são mais semelhantes aos naturais Caenorhabditis elegans habitats do que as placas padrão 2D cultura elegans laboratório C..

Resumo

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O uso de organismos modelo genéticos, como Caenorhabditis elegans, levou a descobertas seminais em biologia nas últimas cinco décadas. A maior parte do que sabemos sobre C. elegans é limitada ao cultivo em laboratório dos nematóides que podem não refletir necessariamente os ambientes que normalmente habitam na natureza. O cultivo de C. elegans em um habitat 3D que é mais semelhante à matriz 3D que os vermes encontram em frutas podres e composto vegetativo na natureza pode revelar novos fenótipos e comportamentos não observados em 2D. Além disso, experimentos em 3D podem abordar como os fenótipos que observamos em 2D são relevantes para o verme na natureza. Aqui, um novo método no qual C. elegans cresce e se reproduz normalmente em três dimensões é apresentado. O cultivo de C. elegans em Nematoid Growth Tube-3D (NGT-3D) pode nos permitir medir a aptidão reprodutiva de cepas de C. elegans ou diferentes condições em um ambiente 3D. Também apresentamos um novo método, denominado Garrafa de Crescimento de Nematóides-3D (NGB-3D), para cultivar C. elegans em 3D para análise microscópica. Esses métodos permitem que os cientistas estudem a biologia de C. elegans em condições que refletem mais os ambientes que encontram na natureza. Isso pode nos ajudar a entender a relevância evolutiva subjacente da fisiologia e do comportamento de C. elegans que observamos em laboratório.

Introdução

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O estudo do nematóide Caenorhabditis elegans em laboratório levou a descobertas seminais no campo da biologia nas últimas cinco décadas1. C. elegans foi o primeiro organismo multicelular a ter seu genoma sequenciado em 19982, e tem sido inestimável na compreensão das contribuições de genes individuais para o desenvolvimento, fisiologia e comportamento de um organismo inteiro. Os cientistas agora estão procurando entender melhor como esses genes podem contribuir para a sobrevivência e aptidão reprodutiva dos organismos em seus ambientes naturais, fazendo perguntas sobre ecologia e evolução no nível genético3-5.

C. elegans mais uma vez pode fornecer um excelente sistema para responder a essas perguntas. No entanto, pouco se sabe sobre a biologia de C. elegans em habitats naturais de nematóides, e não existem métodos atuais para simular condições naturais controladas de C. elegans em laboratório. No laboratório, C. elegans é cultivado na superfície de placas de ágar semeadas com bactérias E. coli 6. Na natureza, no entanto, C. elegans e nematóides relacionados podem ser encontrados esparsamente habitando solos em todo o mundo, mas são especificamente encontrados prosperando em frutas podres e matéria vegetativa7,8. Esses ambientes complexos tridimensionais (3D) são bem diferentes dos ambientes 2D simples aos quais os vermes são expostos em laboratório.

Para começar a responder a perguntas sobre a biologia dos nematóides em um ambiente 3D mais natural, projetamos um habitat 3D para cultivo de nematóides em laboratório que chamamos de Nematode Growth Tube 3D ou NGT-3D para abreviar9. O objetivo era projetar um sistema de crescimento 3D que permitisse crescimento, desenvolvimento e fertilidade comparáveis às placas padrão de meios de crescimento de nematóides 2D (NGM)10. Este sistema suporta o crescimento de bactérias e nematóides ao longo de todo o seu ciclo de vida em 3D, permite que os vermes se movam e se comportem livremente em três dimensões e é fácil e barato de fabricar e empregar.

No estudo atual, fornecemos um método passo a passo para fabricar NGT-3D e avaliar o desenvolvimento e a fertilidade do verme. Além de avaliar a aptidão do verme em 3D, procuramos obter imagens, vídeos e avaliar o comportamento e a fisiologia do verme no cultivo 3D. Assim, além do NGT-3D, apresentamos aqui um método alternativo chamado Nematode Growth Bottle 3D ou NGB-3D, para a imagem microscópica de C. elegans durante o cultivo 3D. Isso será especialmente importante para o estudo de comportamentos conhecidos identificados em 2D e a identificação de novos comportamentos exclusivos do cultivo 3D.

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Protocolo

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1. Prepare Soluções para NGT-3D e NGB-3D

  1. Preparar as seguintes soluções esterilizadas: 1 L de solução de NaCl a 0,1454 M, 1 L de 1 M de CaCl2, 1 L de 1 M de MgSO4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 H KPO tampão 4 (108,3 g de KH 2 PO 4 e 35,6 g de K 2 HPO 4, e preencher H2O a 1 L). Produção de NGM usando essas soluções podem ser encontradas em um protocolo anterior 10.
  2. soluções autoclave a 121 ° C, 15 min.
  3. Preparar 50 ml de uma solução estéril a 5 mg / ml de colesterol. Em um tubo cónico de 50 mL, misturar 0,25 g de colesterol e 50 ml de 99,99% de etanol e misture bem. Não autoclave. Esterilizar a solução colesterol utilizando uma seringa de 50 ml com um filtro de seringa de 0,45 um. Isso também irá remover qualquer colesterol não dissolvido.
  4. (Opcional) Preparar 10 ml de uma 150 mM de 2'-desoxi-5-fluorouridina estoque (FUdR). Em um tubo cónico de 15 ml, 0,3693 g misturarde FUdR e 10 ml de água destilada. Agite bem.

2. Prepare Cultura das bactérias para NGT-3D e NGB-3D

  1. Inocular 10 ml de caldo LB com bactérias. As bactérias comuns usados para a C. elegans alimentação é a estirpe de E. coli OP50.
  2. Cultura a inoculação bacteriana a 37 ° C num incubador com agitação durante a noite.
  3. Na preparação para uma diluição em série, alíquotas de 9 ml da solução de NaCl em 15 ml estéreis tubos cónicos. Por exemplo, alíquotas de 9 ml em um total de 7 tubos para obter uma diluição de 10 -7 estirpe de E. coli OP50.
  4. Utilizando uma pipeta estéril de 1.000 ul, pipeta de 1 ml da cultura bacteriana ou cultura bacteriana diluída para o novo tubo estéril com 9 ml de solução de NaCl e agitar com vortex a mistura de 10 ml bem. Repita até a diluição bacteriana desejada é atingida.
    NOTA: A diluição bacteriana desejada depende do tipo e condição de bactérias, bem como as condições experimentais exactos.Por exemplo, um 10 -6 - diluição da estirpe de E. coli OP50 10 -8 era suficiente para produzir a partir de 1 - 200 colónias bacterianas por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms desenvolvido e reproduzidos normalmente quando o número de colónias foi superior a 60, o que ocorreu a uma diluição de 10 -6 fiavelmente - 10 -7. Para NGB-3D, usar uma diluição de 10 -8.

3. Fazer NGT-3D e NGB-3D (200 ml)

  1. Depois de preparar a cultura bacteriana, misturar 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, e 0,5 g de peptona, em um balão de 500 ml. Inserir uma barra de agitação magnética para o balão.
  2. Adicione 195 ml de água destilada e cobrir a boca do balão com folha de alumínio.
  3. Autoclave de 121 ° C durante 15 min.
  4. Colocar o balão autoclavada quente sobre uma placa de agitação, e agitar a uma velocidade moderada durante pelo menos 2 h. Arrefece-se o balão a 40 ° C. Certifique-se de arrefecer o suficiente como continuar a partir daqui a altas temperaturas pode levar a opacificação do agar acabado.No entanto, as temperaturas mais baixas podem resultar no endurecimento prematuro do agar.
    1. (Opcional) Para acelerar o processo de resfriamento, colocar o balão em um 40 ° C banho de água 15 min antes de colocar em uma placa de agitação.
  5. Quando a temperatura do meio de ágar atinge 40 ° C, adicionar 200 ul de 1 M de CaCl2, a 200 ul de 5 mg de solução de colesterol / ml, 200 ul de 1 M de MgSO 4 e 5 ml de 1 M de KPO tampão 4, tal como a solução continua a agitar para concentrações finais de 1 mM de CaCl2, 5 ug / ml de colesterol, MgSO 4 1 mM, KPO4 1 mM.
    1. (Opcional) Para o ensaio do tempo de vida NGT-3D adicionar 80 ul de FUdR a 150 mM para uma concentração final de 120 pM 12.
  6. Adicionar 6 ml de 10 ml de cultura bacteriana diluído do passo 2.4 para dentro do frasco directamente.
    1. (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de ágar antes do passo 3.6 e mantê-lo aquecido separadamente. Este suporte vai ser utilizado para os livre de bactériascamada superior.
  7. Usando procedimentos de esterilização, dispensar a mídia em uma câmara de cultura estéril. Verifique se a tampa da câmara fecha hermeticamente.
    1. (Opcional) Para evitar a formação de colónias de bactérias na superfície superior do ágar, fazer uma camada de meio de ágar livre de bactérias a partir do passo 3.6.1 em cima antes que o material a partir do passo 3.7 endurece completamente. Isto irá criar uma zona livre de bactérias no topo da NGT-3D.
    2. Para NGT-3D, despeje 6,5 ml de meio em 8 ml tubos de ensaio de plástico claras para fazer uma camada de agar de bactérias, e dispensar cuidadosamente 200 ul de meios de comunicação sem bactérias na parte superior do meio de cultura semi-endurecido 3D para fazer uma fina bacteria- camada livre no topo.
    3. Para NGB-3D, despeje 65 ml de mídia na 25 centímetros garrafa de cultura celular 2 clara de plástico. Esta quantidade deve encher o corpo da garrafa de 25 centímetros de cultura 2 de células.
  8. Deixar câmaras verticalmente à temperatura ambiente durante uma semana para permitir que as colónias bacterianas a crescerpara um tamanho considerável de pelo menos 1 mm de diâmetro.
    1. (Opcional) Para o ensaio vida na NGT-3D, câmaras cubra com papel alumínio para evitar a degradação luz do FUdR.

4. Medida da aptidão da População Sem-fim na NGT-3D (Brood Relativa Tamanho Assay)

  1. Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina pegar e transferência em uma placa NGM sem bactérias. Permitir worm para mover-se livremente ao redor por alguns minutos para remover bactérias aderidas ao corpo.
  2. Repita o passo 4.1 e certificar-se de que o worm é livre de bactérias. Geralmente, duas repetições de 4.1 são suficientes.
  3. Com cuidado, coloque o worm limpo na superfície da mídia 3D com uma picareta fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D.
  4. Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, mas impedindo a secagem do ágar.
  5. Incubar durante 96 horas a 20 ° C.
  6. Após 4 dias, a fechar as tampas hermeticamente e colocar ocâmara de cultura NGT-3D em um banho de água a 88 ° C para fundir o ágar. O calor mata vermes, mas seus corpos permanecem intactos.
    NOTA: Usando 8 ml tubos para NGT-3D, 20 - 30 minutos de incubação é geralmente suficiente.
  7. Usando uma pipeta de vidro, transferir os meios derretido sobre de 9 cm de prato de petri de plástico. pipetas de plástico não são aconselhados, como vermes pode muitas vezes ficar com eles.
  8. Usando um microscópio de dissecação transmissão estéreo, contar o número de vermes no L3, L4, e estágios adultos. Não conte vermes que estão fase L2 e mais jovens, como as gerações F1 e F2 podem ser confundidos aqui. Assim, este ensaio é um ensaio tamanho da ninhada em relação ao invés de um ensaio total de tamanho da ninhada.

5. Imagem e registrar o comportamento Worm na NGB-3D

  1. Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina escolher e remover qualquer bactéria coladas à superfície através da transferência a uma placa NGM sem bactérias e permitindo-lhe mover-se livremente para alguns min.
  2. Repita o passo 5.1 para garantir que o worm é livre de bactérias.
  3. Cuidadosamente colocar o verme limpo para o centro da superfície de agar do NGB-3D perto do gargalo da garrafa com uma escolha de fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D.
  4. Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, evitando a secagem do ágar.
  5. Imagem ou gravar o worm sob um microscópio de dissecação transmissão estéreo. Ajuste o foco como o worm se move através da matriz 3D.

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Resultados

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A construção de NGT-3D é um protocolo simples e directo que resulta em um tubo de ensaio de agar-enchido com pequenas colónias bacterianas espaçadas ao longo do ágar (Figura 1A). Worms pode circular livremente através da matriz de agar, encontrar e consumir as colónias de bactérias. Para confirmar se o C. elegans podem se reproduzir e crescer normalmente na NGT-3D, comparou fertilidade e desenvolvimento larval em 3D com placas padrão 2D NGM. No ensaio de tamanho...

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Discussão

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O cultivo laboratorial de C. elegans utilizando as placas de meio de crescimento nematóide clássicos foi crucial para as centenas de descobertas importantes que a pesquisa em C. elegans tem prestado. Aqui, nós apresentamos novos métodos de cultivar C. elegans em um ambiente que reflete com mais precisão seus habitats tridimensionais naturais. Embora outros métodos têm sido utilizados para observar C. elegans em 3D 13, este é o primeiro protocolo que permite a cultura de ver...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por uma nova Investigator Grant [2014R1A1A1005553] da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) para JIL; e uma Universidade Yonsei líder futuro Desafio Grant [2015-22-0133] para JIL

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Caldo LB, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
Cloreto de sódioDAEJUNG7548-440058,44 MW
Ágar, GranuladoDifco214530
PeptonaBacto211677
Cloreto de cálcio, di-hidratadoBio BasicCD00502*H2O; 147,02 MW
ColesterolBio BásicoCD0122386,67 MW
Álcool etílicoB& JRP090-199,99%; 46,07 MW
Sulfato de magnésio, anidroBio BasicMN1988120,37 MW
Fosfato de potássio monobásico, anidroBio BasicPB0445136,09 MW
2'-desoxi-5-fluorouridinaTokyo Chemical IndustryD2235246,19 MW
Fosfato de potássio dibásico anidroBio BasicPB0447174,18 MW
Tubos de ensaio multiusoStockwell ScientificST.8570ml
Tampas de tubo de ensaioStockwell ScientificST.8575
Frasco de cultura de célulasSPL Lifescience7012525 cm2
Research Stereo MicroscopeNikonSMZ18
Cabeça de câmera colorida de alta definiçãoNikonDS-Fi2
Unidade de controle baseada em PCNikonDS-U3
NIS-Elements Basic Research, Software de imagem de microscópioNikonMQS32000
8

Referências

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