Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.
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Artigo de método
Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando episs�ica Vectors
Neste artigo
Resumo
Resumo
Induzidas células-tronco pluripotentes (iPSCs) são uma grande promessa para a modelagem de doenças e terapias regenerativas. Nós anteriormente relatada a utilização de vectores epissomais (EV) para gerar iPSCs livre de integração a partir de células mononucleares do sangue periférico (SP MNCs). Os vectores epissómicos são utilizados plasmídeos de ADN incorporados com OriP e EBNA1 elementos do vírus de Epstein-Barr (EB), que permitem a replicação e a longo prazo retainment de plasmídeos em células de mamífero, respectivamente. Com uma maior optimização, milhares de colónias IPSC pode ser obtido a partir de 1 ml de sangue periférico. Dois factores essenciais para alcançar altas eficiências de reprogramação são: 1) o uso de um 2A "auto-clivagem" péptido de ligação OCT4 e SOX2, conseguindo-se assim a expressão equimolar dos dois factores; 2) o uso de dois vectores para expressar MYC e KLF4 individualmente. Aqui nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a geração de iP livre de integraçãoSCs de amostras de sangue periférico de adultos. As iPSCs gerados são livres de integração como plasmídeos episs�icas residuais são indetectáveis após cinco passagens. Embora a eficiência reprogramação é comparável com a do vírus Sendai (VS) vectores, plasmídeos EV são consideravelmente mais económica do que os vectores comercialmente disponíveis SV. Este sistema EV reprogramação acessível tem potencial para aplicações clínicas em medicina regenerativa e fornece uma abordagem para a reprogramação direta de multinacionais PB para as células sem integração-tronco mesenquimais, células-tronco neurais, etc.
Introdução
Após expressão forçada de vários factores de transcrição (Ie OCT4, SOX2, MYC e KLF4), células somáticas podem ser reprogramadas para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que detêm grande promessa para aplicações em medicina regenerativa e terapia de reposição celular 1-3. Até à data, diversos métodos foram desenvolvidos para aumentar a taxa de sucesso de reprogramação 4-7. vectores virais induzida por reprogramação é amplamente utilizado para a produção eficiente de iPSCs, pois a integração virai conduz a um alto nível, a expressão estável dos fatores de reprogramação. No entanto, a integração permanente do ADN do ....
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Protocolo
Todas as amostras PB humanos foram obtidos de doadores adultos anônimos sem informações de identificação disponível a partir de Tianjin Hemocentro com a aprovação do comitê de ética em pesquisa local.
O plasmídeo Preparação 1. Endo-livre
- Use um kit Plasmid Maxi A purificação comercial para extrair os vectores epissomais de E. coli de acordo com o protocolo do fabricante. Para o passo final, tampão TE substituto com água estéril livre de endotoxinas para dissolver o sedimento de DNA.
- Medir a concentração de ADN utilizando um espectrofotómetro comercial de UV / Vis. A concentração é geralmente maior do que 1 mg....
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Resultados
Usando este protocolo, podemos obter centenas de colónias a partir de 1 x 10 5 nucleofected PB multinacionais (Figuras 1A e 1B). A eficiência de reprogramação é de aproximadamente 0,2-0,5% e as colónias expressam marcadores de pluripotência (Figuras 1C e 1D). iPSCs gerados utilizando o protocolo descrito são livres de integração e tem a capacidade de formar teratoma compor as 3 camadas germinais (Figur.......
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Discussão
Aquisição de amostras de sangue de dadores saudáveis ou doentes é conveniente e não invasivo, tornando-se uma fonte de células atraente para a investigação básica e clínica de terapia celular. Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração altamente eficiente de iPSCs livre de integração a partir de amostras de sangue periférico. Esta abordagem reprodutível e acessível deve beneficiar o campo da IPSC.
Nós relatamos que existem dois factores críticos responsáveis pela reprogramação PB alt.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes ou conflitantes a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2015CB964902, 2013CB966902 e 2012CB966601), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81500148, 81570164 e 81421002), pela bolsa GCAT da Escola de Medicina da Universidade de Loma Linda (2015) e pelo Centro de Pesquisa em Telemedicina e Tecnologia Avançada (W81XWH-08-1-0697).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio de Expansão de Células-Tronco Hematopoiéticas | Sigma | S0192 | Armazene a 4 ° C |
| Fator de Células-Tronco Humanas (SCF) | Peprotech | 300-07 | Armazene a -20 ou -80 ° C |
| Interleucina-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Armazenar a -20 ou -80 &graus; C |
| Eritropoietina (EPO) | Peprotech | 100-64 | Armazenar a -20 ou -80 ° C |
| Fator de Crescimento de Insulina-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Loja a -20 ou -80 ° C |
| Dexametasona | Sigma | D4902 | Loja em -20 ou -80 ° C |
| 1-tioglicerol (MTG) | Sigma | M6145 | Armazene a -20 ou -80 ° C |
| DMEM/F12 médio | Gibco | 112660-012 | Loja em 4 ° C |
| L-glutamina (100x) | Gibco | 25030-081 | Armazene a -20 ° C |
| Penicilina/Estreptomicina (100x) | Gibco | 15140-122 | Armazene a -20 ° C |
| Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x) | Gibco | 11140-050 | Armazene a 4 ° C |
| Fator de Crescimento de Fibroblastos 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Armazenar a -20 ou -80 ° C |
| Insulina-Transferrina-Selênio (ITS, 100x) | Gibco | 41400-045 | Loja em 4 ° C |
| Ácido ascórbico | Sigma | 49752 | Armazenar a -20 ° C |
| DMEM (glicose alta) meio | Thermo | SH30243.01B | Armazenar a 4 &graus; C |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Hyclone | SV30087.01 | Armazenar a -20 ° C |
| Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Loja em RT |
| Trehalose | Sigma | T9531 | Loja em 4 ° C |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | Armazene na RT, proteja da luz |
| Endofree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | Armazene na RT |
| IMDM | Gibco | 21056-023 | Armazene em 4 ° C |
| Nucleofecção de Células CD34+ Humanas | Lonza | VPA-1003 | Armazene em RT, o tampão de nucleofecção e o suplemento devem ser armazenados a 4 &graus; C |
| Butirato de Sódio | Sigma | B5887 | Armazene a -20 ou -80 ° C |
| Inibidor de ROCHA - Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Armazene a -20 &graus; C |
| Essential 8 meio basal (E8) | Gibco | A15169-01 | Armazene em 4 ° C, o suplemento deve ser armazenado a -20 ou -80 & C |
| Matrigel | BD | 354277 | Loja em -20 ou -80 ° C |
| 2x EasyTaq PCR SuperMix (+corante) | TransGen Biotech | AS111 | Loja a -20 ° |
| Solução de descolamento de células | STEMGENT | 01-0006 | Armazenar a -20 &graus; C, Accutase como uma solução de desprendimento de células para obter uma suspensão de célula única |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | Armazenar a 4 ou -20 &graus; C |
| Anti-Nanog AF488 | BD | 560791 | Armazenar em 4 ° C, anticorpo primário usado para imunofluorescência, diluir 1/100 quando usado |
| Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Armazenar a 4 &graus; C, anticorpo primário usado para imunofluorescência, diluir 1/100 quando usado |
| AF488 burro anti-rato IgG | Invitrogen | A21202 | Armazenar em 4 ° C, anticorpo secundário usado para imunofluorescência, diluir 1/500 quando usado |
| PE anti-humano TRA-1-60-R anticorpo | Biolegend | 330610 | Armazenar a 4 ° C, anticorpo usado para citometria de fluxo |
| eFluor 570-conjugado anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Armazenar a 4 ° C, anticorpo usado para citometria de fluxo |
| Isotipo anticorpo | eBioscience | 11-4011 | Armazenar a 4 &graus; C, anticorpo usado para citometria de fluxo |
| Kit de Detecção de Fosfatase Alcalina | SiDanSai | 1102-100 | Armazene a 4 ° C |
| Kit de extração de DNA genômico | TIANGEN | DP304-02 | Armazene na RT |
| Solução azul de tripano | Sigma | T8154 | Armazene na RT |
| Analisador de células de citometria de fluxo | BD | LSRII | |
| Spinning Disk Microscópio confocal (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | para imagem confocal |
| Dispositivo de nucleofecção | Lonza | Nucleofector 2b | para a nucleofecção do PB MNC |
| ImageQuant LAS-4010 | GE | para tirar fotos da coloração AP em massa |
Referências
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human....
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Reimpressões e permissões
