transplante de pele de espessura total murino é um modelo bem estabelecido para estudar a rejeição em um ambiente alloimmune. Aqui, nós fornecemos um tutorial de cada etapa envolvida na realização de um / c BALB -> C57BL / 6 transplante de pele de espessura total.
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Artigo de método
Murino Transplante de pele de espessura total
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Resumo
Resumo
O transplante de pele de espessura total de murino é um modelo bem estabelecido para o estudo in vivo de resposta aloimune e rejeição de enxerto. Apesar da sua aplicação limitada a seres humanos, o transplante de pele em ratinhos tem sido amplamente utilizada para a pesquisa em transplantes. O procedimento é fácil de aprender e executar, e não requer técnicas de microcirurgia delicada, nem treinamento extensivo. Além disso, a rejeição do enxerto neste modelo ocorre em uma reacção imunológica muito reprodutível e é facilmente monitorizado por inspecção e palpação directa. Além disso, o transplante de pele secundário combinados com enxertos de pele de doadores ou de terceiros pode ser realizada em modelos de transplante mais complexos como um método alternativo e simples para avaliar a tolerância específica do dador. As complicações são baixos e são, em geral, limitado a uma overdose de anestesia ou angústia respiratória após o procedimento. falha do enxerto, por outro lado, ocorre geralmente como um resultado da má preparação da Grpopa, posicionamento incorreto no leito do enxerto, ou posicionamento inadequado de o curativo. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o transplante de pele de espessura total em ratos e descrever os passos importantes necessários para o sucesso do procedimento.
Introdução
O transplante de órgãos é o tratamento de escolha para pacientes com casos de insuficiência terminal de órgãos, e os resultados têm melhorado notavelmente com os avanços em procedimentos cirúrgicos e protocolos de imunossupressão. No entanto, a imunossupressão a longo prazo está associada a efeitos colaterais significativos, e o desenvolvimento de novas estratégias que promovem a tolerância continua a ser o objectivo da investigação moderna transplante.
Numerosos modelos animais têm sido desenvolvidos para a pesquisa básica em transplante, para estudar os mecanismos da rejeição do enxerto e para testar se aproxima de imunossupressão para a prevenção da rejeição de enxertos e para promover a tolerância a longo prazo 1-3. mouse modelos tornaram-se o esteio da pesquisa imunológica devido à disponibilidade exclusiva e vasta de anticorpos diagnósticos e terapêuticos e estirpes puras e transgênicas bem definidas. transplante de pele é um procedimento simples que não requer habilidades especiais de microcirurgia e podeser facilmente monitorizado no pós-operatório. Tomados em conjunto, o transplante de pele de ratinho tem sido uma ferramenta excepcional para estudar muitos aspectos envolvidos na resposta aloimune, incluindo a entrega de antigénio, o tráfico de células, e a destruição do tecido durante a rejeição de enxerto de 4,5.
Aqui, mostramos o procedimento passo-a-passo para o transplante de pele de espessura total utilizando o modelo de rato, e descrevemos as etapas importantes necessárias para um enxerto bem-sucedida da pele transplantada.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e foram aprovados pela Comissão de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (JHUACUC). Os procedimentos específicos foram realizados sob a MO13M292 protocolos ACUC aprovado e MO13M370.
1. Donor Colheita da pele
- Anestesiar o rato doador com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia.
- Usando uma máquina de barbear, a barba do dorso do animal e desinfecção com 10% de iodo de povidona (por exemplo, Betadine).
- Com uma tesoura estéril, luvas e técnica asséptica, colheita doador de pele de volta a partir do quadril para o pescoço, com dissecção romba ao nível do tecido conjuntivo areolar.
- Eutanásia do animal por deslocamento cervical após a colheita daenxerto de pele.
- Sob um microscópio, separar o tecido conjuntivo, tecido adiposo, e panículo carnoso da pele do dorso utilizando tesouras finas Tenotomia. O panículo carnoso é um músculo fino e transparente responsáveis por movimentos espasmos pele.
- Utilizando uma técnica estéril instrumentos, cortar enxertos de 15 mm x 15 mm a partir da pele de volta para uma de 10 mm x 10 mm para a cama enxerto de 15 mm x 15 mm.
- Armazenar os enxertos em gazes impregnadas com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) numa placa de petri em gelo.
NOTA: 8 - 10 enxertos pode ser obtido a partir de um rato dador.
Transplante de pele 2. Destinatário
- Anestesiar o mouse destinatário com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia.
- Administrar 0,02 mg / kg de peso corporal de buprenorfina para o alívio da dor pós-operatória.
- Raspar o lado das costas do animal, onde o wi enxertoll ser inserido e desinfectar com 10% de iodopovidona.
- Com uma tesoura, corte de 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm quadrado de pele. O tamanho de defeito deve ser ligeiramente maior (10%) do que o enxerto. Corte o mais superficialmente possível. Tome cuidado para preservar o panículo carnoso e vasos. O panículo carnoso pode ser distinguida da fáscia subjacente por sua mobilidade e os vasos sanguíneos superficiais que executam a ele.
- Posicionar o enxerto no leito de enxerto, evitando dobras ao longo das bordas.
- Coloque 8 suturas nos cantos e no meio de cada borda. Para cada fio de sutura, a agulha passar através do enxerto e, em seguida, através do panículo carnoso do enxerto de leito inferior a pele circundante destinatário.
- Retire a máscara de anestésico e deixar o animal recuperar parcialmente da anestesia antes de aplicar a bandagem adesiva.
- Enrole o mouse destinatário em uma bandagem adesiva com gaze dobrada sobre o enxerto. Faça o curativo pela combinação de duas ataduras, cortandoa parte adesiva de um e colocando as duas almofadas absorventes em conjunto.
- Monitorar o mouse de perto durante a recuperação para garantir que o curativo não está restringindo tórax excursão e respirar. Remover o curativo, se a taxa respiratória diminui ou o animal começa a ofegar ou respiração superficial.
3. Cuidados Pós-Operatórios
- Administrar enrofloxacina 5 mg / kg após a cirurgia para a profilaxia da infecção.
- Posicione o mouse transplantado em uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento no forno até que se recupere totalmente da anestesia.
- Observe o mouse por 1 hora de pós-operatório antes de retornar para a instalação de habitação.
- Sete dias após a cirurgia, anestesiar o rato como no Passo 2.1. Remover o curativo, cortando apenas através do lado ventral do curativo.
- Observar e palpar o enxerto no dia seguinte para sinais de formação de crostas, contração ou dureza. Se estiver presente, o enxerto pode não ter alcançado vasculariza adequadação e deve ser considerada uma falha técnica.
- Monitorizar diariamente quanto a sinais de rejeição. Considere enxertos rejeitada quando ≥90% do tecido do enxerto torna-se necrótica.
- Eutanásia dos animais rejeitados e colhê-las para análise.
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Resultados
A colocação do curativo sobre o mouse destinatário é um passo importante do processo. O enxerto de pele é posicionada no tronco recipiente, entre o ombro, anca e espinha (Figura 1). A ligadura é feita com gaze dobrada e a combinação de duas ataduras adesivas de plástico. O rato receptor é colocado com o enxerto para baixo sobre a gaze sobre o centro da ligadura. Usando dois micro pinças curvas, a extremidade inferior da ligadura é primeiro removido, e em seguida, a parte...
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Discussão
Desde a sua introdução por Medawar, primeiro em estudos humanos e, em seguida, em coelhos e ratinhos, o transplante de pele tem sido um modelo de valor inestimável para o estudo das respostas imunitárias alogénicas 6,7. Neste artigo, apresentamos um modelo de grande escala, o transplante de pele não-vascularizado de espessura total com a pele para trás superior e inferior. Vários métodos alternativos, incluindo o uso da pele da cauda ou da pele da orelha de rato como fonte de tecido do enxerto, foram relatado...
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI077610.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Micro pinça reta | Sigma | F4017 | |
| Micro pinça curva | Aesculap | BD333R | |
| Tesoura de tenotomia Stevens curva | Aesculap | BC905R | |
| Tesoura de dissecação Mayo | Sigma | S3146 | |
| Micro porta-agulha | Aesculap | BM563R | |
| Gaze estéril | Covidien | ||
| 6-0 Sutura de Nylon | MWI | 31849 | |
| Tira de Plástico Banda- Ajuda | Johnson & Johnson | Obtido da farmácia | |
| 10 cm Placa de Petri | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Qualidade Biológica | 119069131 | |
| Buprenorfina | Número DEA necessário; Obtido da farmácia hospitalar | ||
| Enrofloxacina | Bayer Health Care | 186599 |
Referências
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- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
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Reimpressões e permissões
