Acidente vascular cerebral isquêmico é um evento complexo, no qual a contribuição específica dos astrócitos à região afetada do cérebro exposto a privação de oxigênio glicose (OGH) é difícil de estudar. Este artigo apresenta uma metodologia para obter isolados astrócitos e estudar sua reatividade e proliferação em condições OGH.
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Artigo de método
Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão complexa do cérebro causada por um trombo ou êmbolo obstruindo o fluxo sanguíneo para partes do cérebro. Isto leva à privação de oxigênio e glicose, o que faz com que a falha de energia e morte neuronal. Depois de um insulto isquêmico, astrócitos tornar-se reativa e proliferam em torno do local da lesão, como ela se desenvolve. Sob esse cenário, é difícil estudar a contribuição específica dos astrócitos, a região do cérebro exposto à isquemia. Portanto, este artigo apresenta uma metodologia para estudar a reatividade astrocyte primária e proliferação sob um modelo in vitro de um ambiente, como isquemia, chamado de privação de oxigênio glicose (OGH). Astrócitos foram isolados a partir de dia 1-4-velhos ratos Neonatais e o número de células hamartomas específico foi avaliada utilizando marcador seletivo de astrocyte gliais de proteína ácida fibrilar (GFAP) e coloração nuclear. O período em que astrócitos estão sujeitos à condição de OGH pode ser personalizado, bem como a percentagem de oxigênio que estão expostos. Essa flexibilidade permite aos cientistas caracterizar a duração do estado isquêmico, como em diferentes grupos de células in vitro. Este artigo discute os prazos de OGH que induzem a reatividade astrocyte, morfologia hipertrófica e proliferação, como medido por imunofluorescência usando Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Além de proliferação, astrócitos passam por energia e estresse oxidativo e respondem a OGH pela liberação de fatores solúveis no meio de célula. Este meio pode ser coletado e utilizado para analisar os efeitos das moléculas lançados por astrócitos em culturas neuronal preliminares sem interação célula a célula. Em resumo, este modelo de cultura celular primária pode ser usado com eficiência para entender o papel dos astrócitos isolados após lesão.
Introdução
Traço é definido como "uma aguda disfunção neurológica de origem vascular com súbito ou rápido desenvolvimento de sintomas e sinais, correspondentes à participação de áreas focais no cérebro"1,2. Existem dois tipos de AVC: isquêmico e hemorrágico. Quando a disfunção vascular é causada por um aneurisma ou uma avaria arteriovenosa, acompanhado pelo enfraquecimento com posterior ruptura de uma artéria, este é denominado acidente vascular cerebral hemorrágico3 que, na maioria dos casos, leva à morte. Quando um trombo ou um êmbolo obstrui o fluxo sanguíneo, causando uma temporária privação d....
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Protocolo
pós-natal ratos (Sprague Dawley) 1-4 dias de idade são usados para isolar os córtices. O método de eutanásia é decapitação, conforme aprovado pelas diretrizes do NIH.
1. preparação de instrumentos e materiais para cirurgia
- instrumentos esterilize em autoclave (temperatura: 121 ° c, pressão: 15 libras por polegada quadrada, tempo: 30 minutos) usando uma caixa de aço ou uma mágica instantânea selagem bolsa de esterilização. Ver os materiais na Tabela de materiais.
2. Concluir a preparação de DMEM
- em um copo de um litro contendo 700 mL de água esterilizada, adicionar Du....
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Resultados
Uma das principais preocupações da cultura hamartomas primária é a presença de outras células, como neurônios, oligodendrócitos, micróglia e fibroblastos. Na Figura 1, células isoladas de córtices rato tinham alterações de mídia a cada 3 dias em foram ou não tratada ou tratada com adicionado LME para 1 h. 24 horas mais tarde, as células foram immunostained para GFAP e counterstained com DAPI. Células não tratadas mostraram uma média de 39% não-GFAP células po.......
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Discussão
Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos de córtices de rato. Neste método, é fundamental para diminuir a contaminação com outros tipos celulares como fibroblasto, oligodendrócitos e micróglia. Para reduzir o número de micróglia, várias medidas podem ser tomadas: mudando a mídia, orbital tremendo e tratamentos químicos. Uma vez que a pureza da cultura é confirmada por imunofluorescência usando marcadores celulares seletivas ou para os contaminantes mais proeminentes de célula, experiências podem ser executadas........
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores querem agradecer Paola López Pieraldi pela assistência técnica. A.H.M é grato para o 8G12MD007600 de subsídios e U54-NS083924 que suporte esta publicação. Agradecemos a subvenção de NIH-NIMHD-G12-MD007583 para o suporte de instalação. D.E.R.A. é grato para a bolsa fornecida pelo NIHNIGMS-R25GM110513. Estamos gratos pelo uso da área comum de instrumentação e a ajuda do Dr. Priscila Sanabria para o uso da instalação de imagem óptico do programa RCMI por conceder G12MD007583. Além disso, queremos agradecer seu papel proeminente em filmagem e edição do protocolo visual Jose Padilla.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumentos para Cirurgia - Etapa 1 | |||
| Tesoura de operação 5,5" | Roboz Company | RS-6812 | Ferramentas usadas para decapitar os ratos. |
| Pinça curva 7" | Roboz Company | RS-5271 | Segura a pele do rato enquanto o crânio é removido. |
| Tesoura de micro-dissecação 4" | Roboz Company | RS-5882 | Corta tanto a pele quanto o crânio do rato. |
| Pinça de micro-dissecação 4" angulada, fina e afiada | Roboz Company | RS-5095 | Segura a pele do rato enquanto o crânio é removido. |
| Pinça de micro-dissecação 4" ligeiramente curvada 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Ferramenta usada para separar córtices. |
| Pinças de microdissecação | Roboz Company | RS-4972 | Peelings meninges cerebrais. |
| Microscópio de dissecção | Olympus | SZX16 | Importante para remover a meninge dos córtices. |
| Preparação DMEM - etapa 2 | |||
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM) | GibCo. Empresa | 11995-065 | Suporta o crescimento de células. |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Suplemento para meios de cultura de células. |
| Soro fetal bovino (FBS) | GibCo. Empresa | 10437-010 | Suplemento de soro para cultura de células. |
| Penicilina-estreptomicina | GibCo. Empresa | 15140-148 | Inibe o crescimento de bactérias na cultura de células. |
| Sistema de filtro 1L com poro de 0,22um | Corning | 431098 | |
| Cultura de astrócitos - passo 3 | |||
| Pipetas serológicas 5mL | VWR | 89130-896 | Para pipetar DMEM para recipientes com células. |
| Pipetas serológicas 10mL | VWR | 89130-898 | Para pipetar DMEM para recipientes com células. |
| Pipetas serológicas 25mL | VWR | 89130-900 | Para pipetar DMEM para recipientes com células. |
| Tubo cônico centrífugo 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Tubo de trava segura 1,5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Pontas de barreira 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Pontas de barreira 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Saco laranja de risco biológico 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| de Petri de 60mm | Falcon | 351007 | |
| Almofadas de gaze estéreis | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturar o tecido cerebral. |
| Sacos Estéreis para Liquidificador Stomacher 80 | de Laboratório Sewar | BA6040 | Saco estéril para o homogeneizador de células stomacher. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Peneira de dissociação de células estéreis, malha #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | Para obter uma suspensão uniforme de célula única. |
| Peneira de dissociação de células estéreis, malha #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | Para obter uma suspensão uniforme de célula única. |
| Microscópio de fase invertida | Nikon | Eclypse Ti-S | Verifique as células quanto a contaminação ou crescimento celular anormal. |
| Frascos estéreis de 75 cm2 | Falcon | 353136 | |
| Placa multipoços | Falcon | 353046 | |
| Micro óculos de cobertura (lamínulas), 18 mm, redondos | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line Hemacitômetro | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pipetas | Pasteur Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Álcool etílico | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| Cloridrato de éster metílico de L-leucina 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promove a eliminação de células da microglia no cultivo de astrócitos corticais primários. |
| Citosina β-D-arabinofuranosídeo (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Bromidrato de poli-D-lisina, peso mol 70.000-150.000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Tripsina/EDTA | GibCo. Empresa | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Tampão fosfato salina (PBS) comprimidos | Calbiochem | 524650 | |
| Água Estéril | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| Preparação do meio OGD - passo 5 | |||
| Tubo cónico da centrífuga 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco' s Águia modificada' s glicose livre média | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Suporta o crescimento de células. |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Suplemento para meios de cultura de células. |
| Penicilina-estreptomicina | GibCo. Empresa | 15140-148 | Inibe o crescimento de bactérias na cultura de células. |
| 200mM L-glutamina | GibCo. Empresa | 25030-081 | Aminoácido que complementa o crescimento das células. |
| Pastilhas de tampão de fósforo salina (PBS) | Calbiochem | 524650 | |
| Sistema de Filtro 50mL com poro de 0.22um | Corning | 430320 | |
| 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Medidor de Fluxo Único | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Meça o fluxo de gás na purga de oxigênio. |
| Câmara de Incubadora de Hipóxia | StemCell | 27310 | Gera um ambiente hipóxico para a cultura de células. |
| Medidor de Oxigénio Dissolvido Rastreável | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Mistura | de Gás Linde | Purga o ambiente de oxigénio. | |
| primário imunofluorescência de astrócitos - etapa 6 | |||
| Comprimidos de tampão fosfato salino (PBS) | Calbiochem | 524650 | |
| Solução de formalina Tampão neutro 10% | de HT501128 | Sigma-Aldrich | usada para fixar células. |
| Metanol | Fisher | A4544 | Solução usada para fixar células. |
| Surfactante não iônico (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | GibCo. Empresa | 10437-010 | Suplemento de soro para cultura de células. |
| Sinalização Celular | Anti-NeuN | 24307 | Detecta neurônios maduros, serve para validar a cultura astrocítica. |
| Sinalização Celular | Anti-PCNA | 2586 | Detecta células em proliferação. |
| Iodeto de propídio (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Coloração por apoptose. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detecta oligodendrócitos maduros. |
| Anti-IBA1+ | Wako | 016-20001 | Detecta células microgliais. |
| Anti-GFAP conjugado com Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detecta astrócitos reativos nas células tratadas. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anticorpo secundário anti-camundongo. |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anticorpo Secundário Anti-Coelho. |
| 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Coloração nuclear. |
| Microscópio confocal | Olympus |
Referências
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z.
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Reimpressões e permissões
