Artigo de método

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

DOI:

10.3791/55112

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28 de dezembro de 2016

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1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células humanas para analisar os fatores de iniciação da tradução que se ligam à tampa 5' do mRNA durante condições fisiológicas de oxigênio. Este método utiliza um análogo de tampa m7GTP ligado à agarose e é adequado para investigar fatores de ligação de tampas e seus parceiros de interação.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O controle translacional é um ponto focal da regulação gênica, especialmente durante períodos de estresse celular. A tradução dependente de cap através do complexo eIF4F é de longe a via mais comum para iniciar a síntese de proteínas em células eucarióticas, mas variações específicas de estresse desse complexo estão surgindo agora. A purificação de proteínas de ligação à tampa com uma resina de afinidade composta de m7GTP ligado à agarose (um análogo da tampa de mRNA 5') é uma ferramenta útil para identificar fatores envolvidos na regulação do início da tradução. A hipóxia (baixo oxigênio) é um estresse celular encontrado durante o desenvolvimento fetal e a progressão do tumor e é altamente dependente da regulação da tradução. Além disso, foi relatado recentemente que os órgãos humanos adultos têm um teor de oxigênio mais baixo (fisioxia 1-9% de oxigênio) que está mais próximo da hipóxia do que o ar ambiente, onde as células são cultivadas rotineiramente. Com a caracterização contínua de um complexo eIF4F hipóxico (eIF4FH), há um interesse crescente em entender o início da tradução dependente de oxigênio através da tampa de mRNA 5'. Recentemente, desenvolvemos um método de cultura de células humanas para analisar proteínas de ligação a tampas que são reguladas pela disponibilidade de oxigênio. Este protocolo enfatiza que a cultura celular e a lise sejam realizadas em uma estação de trabalho de hipóxia para eliminar a exposição ao oxigênio. As células devem ser incubadas por pelo menos 24 horas para que o meio líquido se equilibre com a atmosfera dentro da estação de trabalho. Para evitar essa limitação, meios pré-condicionados (desoxigenados) podem ser adicionados às células se forem necessários pontos de tempo mais curtos. Certas proteínas de ligação à tampa requerem interações com uma segunda base ou podem hidrolisar o m7GTP, portanto, alguns agentes de tampa podem ser perdidos no processo de purificação. Análogos de capa ligados à agarose enzimaticamente resistentes podem ser substituídos neste protocolo. Este método permite que o usuário identifique novos fatores de tradução regulados por oxigênio envolvidos na tradução dependente de cap.

Introdução

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Controle de translação está a emergir como um passo igualmente importante para a regulação da transcrição na expressão do gene, especialmente durante períodos de estresse celular 1. Um ponto focal de controlo de tradução é para o passo limitante da velocidade de início em que os primeiros passos da síntese de proteínas envolve a ligação do factor eucariótico de iniciação 4E (eIF4E) para o 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 'tampão de mRNAs 2 . eIF4E é parte de um complexo trimérico chamado eIF4F que inclui elF4A, uma helicase de ARN, e eIF4G, uma proteína andaime necessário para o recrutamento de outros factores de tradução e os ribossomas 40S 3. Sob condições fisiológicas normais, a grande maioria dos mRNAs são traduzidas por um mecanismo dependente da tampa, mas sob períodos de stress celular, aproximadamente 10% de mRNAs humanos contêm 5 'UTRs que podem permitir a tradução independente de cap iniciação 1,4. tradução dependente de Cap tem sido historicamente sinônimoous com eIF4F, no entanto, variações específicas de estresse dos eIF4F tornaram-se um trending topic 5-8.

Várias tensões celulares causar actividade eIF4E a ser reprimido através do alvo de mamífero do complexo rapamicina 1 (mTORC1). Esta quinase torna-se prejudicada sob estresse, o que resulta no aumento da atividade de um dos seus alvos, proteína do 4E de ligação (4E-BP). Não fosforilada 4E-BP liga-se a eIF4E e bloqueia a sua capacidade de interagir com eIF4G fazendo com que a repressão da tradução dependente de tampão 9,10. Curiosamente, um homólogo de eIF4E chamado eIF4E2 (ou 4EHP) tem uma afinidade muito menor para 4E-BP 11, permitindo que ele talvez para evadir a repressão mediada por stress. Com efeito, caracterizada inicialmente como um repressor da tradução devido à sua falta de interacção com eIF4G 12, eIF4E2 inicia a tradução de centenas de ARNm que contêm elementos de resposta a hipoxia de ARN na sua UTR 3 'durante o stress hipóxico 6,13. Este i activaçãos alcançado através de interações com ligação eIF4G3, RNA motivo de proteína 4 e 2α o fator inducible hipoxia (HIF) para constituir um complexo eIF4F hipóxica ou eIF4F H 6,13. Como um repressor em condições normais, se liga com eIF4E2 GIGYF2 e ZNF598 14. Estes complexos foram, em parte, identificados através de m 7 resinas GTP de afinidade de agarose ligadas. Este método clássico 15 é padrão na área de tradução e é os ensaios de melhor e mais comumente utilizado técnica para isolar complexos de ligação de PAC em puxar para baixo e in vitro de ligação 16-19. À medida que a maquinaria de tradução dependente de tampão está a emergir como flexível e adaptável com partes inter- mudando 6-8,13, este método é uma ferramenta poderosa para identificar rapidamente novas proteínas de ligação ao tampão envolvidas na resposta ao stress. Além disso, as variações na eIF4F poderia ter implicações amplas como vários sistemas modelo eucarióticos parecem usar um homólogo eIF4E2 para as respostas ao estresse taiscomo A. thaliana 20, S. Pombe 21, 22 de D. melanogaster e C. elegans 23.

As evidências sugerem que variações no eIF4F pode não ser estritamente limitado a condições de estresse, mas estar envolvidos na fisiologia normal 24. O fornecimento de oxigénio para os tecidos (em extremidades capilares) ou dentro dos tecidos (medida através de microeléctrodos) varia de 2-6% no cérebro 25, 3-12% nos pulmões 26, 3,5-6% no intestino 27, 4% em o fígado 28, 7-12% no rim 29, 4% no músculo 30, e 6-7% na medula óssea 31. Células e mitocôndrias contêm menos de 1,3% de oxigênio 32. Estes valores são muito mais próximos à hipoxia do que a do ar ambiente, quando as células são cultivadas por rotina. Isto sugere que o que foram previamente pensado como processos celulares específicas de hipóxia pode ser relevante em um ambiente fisiológico. Curiosamente, eIF4F e H eIF4F participar activamente na iniciação da tradução de piscinas distintas ou classes de mRNAs em várias linhas de células humanas diferentes expostas ao oxigénio fisiológica ou "physioxia" 24. Baixo oxigênio também impulsiona o desenvolvimento fetal adequado 33 e células geralmente têm taxas mais elevadas de proliferação, a expectativa de vida mais longos, menos danos ao DNA e menos respostas de estresse geral em physioxia 34. Portanto, é provável H eIF4F um factor-chave na expressão de genes selecionados em condições fisiológicas.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para células de cultura em condições de oxigénio fisiológicas fixos ou em um intervalo de flutuação dinâmica que é provável mais representativo do microambiente do tecido. Uma vantagem deste método é que as células são lisadas dentro da estação de trabalho hipóxia. Não é claro como muitas vezes a transição a partir da cultura de células hipóxicas à lise das células é realizada em outros protocolos. As células são muitas vezes removidos em primeiro lugar a partir de uma pequena incubadora ser hipoxiatona lise, mas esta exposição ao oxigénio poderia afectar vias bioquímicas como a resposta celular ao oxigénio é rápido (uma ou duas min) 35. Certas proteínas de ligação PAC necessitem de interações com uma segunda base ou pode hidrolisar o GTP m 7, portanto, alguns interagentes cap podem ser desperdiçada no processo de purificação. Agarose ligada aos análogos cap resistentes enzimaticamente pode ser substituído neste protocolo. Explorando a atividade e composição do eIF4F H e outras variações de eIF4F através do método descrito aqui vai lançar luz sobre os mecanismos de expressão genética intrincados que as células utilizam durante as condições fisiológicas ou respostas ao estresse.

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Protocolo

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1. Preparativos para Cultura de Células

  1. Comprar ações disponíveis no mercado de células humanas.
    NOTA: Este protocolo utiliza carcinoma colorectal HCT116 e células primárias humanas renais proximais tubulares epiteliais (HRPTEC).
  2. Adicione 500 ml de meio de cultura de HCT116: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), meio de glucose / alta suplementado com 7,5% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S).
  3. Adicione 500 ml de meio de cultura de HRPTEC: meio de células epiteliais suplementado com FBS a 5%, suplemento de crescimento de células epiteliais de 1%, e 1% de P / S.
  4. Preparar 500 ml de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS): NaCl 140 mM, KCl a 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM de KH 2 PO 4. Ajustar o pH para 7,4 e esterilizar em autoclave durante 40 min a 121 ° C.

2. Início de cultura de células

  1. Aspirar cuidadosamente o meio de um prato confluentes 80-90% sem perturbar tele células.
  2. Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS.
  3. Aliquota de 3 ml de ácido etilenodiaminotetra-tripsina a 0,05% (EDTA) em cada placa de cultura e agitar suavemente para revestir uniformemente as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min.
  4. Transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 4000 xg durante 90 seg.
  5. Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de DMEM completo.
  6. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Calcula quantos não pirogénica e 100 milímetros de poliestireno celular de cultura de pratos são necessárias para alcançar uma densidade de sementeira inicial de cerca de 2.500-5.000 células por cm2.
  7. meio completo pré-quente de cultura celular feito em etapas 1.2 ou 1.3 em um 37 ° C banho de água por 30-45 min.
  8. Descontaminar a garrafa médio e frasco de células com etanol 70%. Deste ponto em diante tudooperações devem ser realizadas de forma asséptica.
  9. Aliquota 6 ml de DMEM completo em tantas placas de cultura de células de 100 mm é necessária para utilizar todo o volume de células congeladas dentro da densidade de sementeira mencionada no passo 2.6.
  10. Transferir o volume de suspensão de células no passo 2.6 calculada para cada um dos pratos de cultura de 100 mm. Rocha cada placa manualmente para distribuir uniformemente as células sobre a superfície da placa.
  11. Colocar a placa de cultura de célula de 100 milímetros semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar, pelo menos, 24 h antes de os passos seguintes.

3. Subcultura

  1. Ver cada prato de cultura de células sob um microscópio para determinar a percentagem de confluência celular (% de células que cobrem a área do prato). Retorno células para a incubadora e meio completo pré-quente e 1x PBS. Vá para a próxima etapa se as células são 80-100% confluentes.
  2. Aspirar cuidadosamente o meio passou sem perturbar oAs células em cada placa de cultura.
  3. Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS.
  4. Alíquota de 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA em cada placa de cultura e agite levemente para uniformemente revestir as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min.
  5. Durante esta incubação, uma alíquota de 10 ml de meio completo em tantas placas de cultura são necessários para obter a densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2.
  6. Quando as células terem separado da placa, adicionar rapidamente 3 ml de inibidor de tripsina 1x definido e agitar suavemente o prato durante 1 minuto para assegurar que toda a tripsina-EDTA foi neutralizado.
  7. Transferência das células isoladas em um 15 ml tubo de centrífuga estéril e reserve. Adicionar 3 ml de 1x PBS para o prato para recolher quaisquer células restantes, e transferir o mesmo que para 15 ml tubo de centrífuga.
  8. Agregar as células por centrifugação a 150 xgdurante 5 min.
  9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meio completo.
  10. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e semear placas de cultura de 150 mm contendo 15 ml de meio completo para se obter uma densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2. Use duas 150 mm para cada ensaio de ligação cap.
    NOTA: Oxygen difusão de células através de meios líquidos é dependente do volume 36. Recomenda-se para manter o volume do meio consistente entre as experiências se as células aderentes ou células em suspensão são utilizados. Os meios podem ser pré-condicionado (incubados na estação de trabalho, durante 24 h, como discutido em Discussão) para evitar estas variabilidades em difusão.
  11. Colocar os pratos de cultura semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar pelo menos 24 horas antes de prosseguir para as próximas etapas.

4. A exposição Physioxic

  1. Ver as células ao microscópio. para besresultados t, assegurar que as células são 70-80% confluentes para uma exposição de 24 horas, 50-60% confluentes para uma exposição de 48 horas, e 40-50% confluentes para uma exposição de 72 horas.
  2. Colocar as células em hipoxia uma estação de trabalho durante o tempo desejado (24, 48, ou 72 horas, dependendo da experiência).
  3. Defina a estação de trabalho para o physioxia apropriado.
    NOTA: Por exemplo, uma configuração de 3% de O2 seria acompanhado por 5% de CO 2 e 92% de N2.
    NOTA: Se as flutuações de oxigênio dentro de um intervalo dinâmico são desejados ao longo de um cronograma específico, o programa da agenda para o instrumento ou ajustar manualmente as configurações de oxigênio nos intervalos desejados.
  4. Ajuste a umidade para 60%. A atmosfera da estação de trabalho é muito seco, no entanto, e meios de comunicação visivelmente evaporar durante experimentos longos (> 48 h). Manter uma reserva de mídia em uma garrafa de cultura de célula dentro da estação de trabalho (de modo que a mídia está equilibrada com a atmosfera estação de trabalho) para repor os meios de comunicação no dis cultura de célulashes.
    NOTA: Qualquer solução que vai interagir com as células antes da lise (tal como PBS e tripsina-EDTA) deve ser pré-condicionadas durante 24 horas antes da utilização dentro da estação de trabalho de hipoxia de modo que o oxigénio dissolvido se equilibra com o oxigénio atmosférico 36.
  5. Manter as células no interior da estação de trabalho até a lise.

5. Amortecedores preparando para Ensaio Cap-obrigatório

  1. Prepare 1x Tris salina (TBS).
    1. Em 800 mL de dH2O, dissolve-se 8,76 g de NaCl e 6,05 g de Tris Base.
    2. Levar a solução a um pH final de 7,4 utilizando HCl 1 M.
    3. Levar o volume final de 1 L utilizando dH2O
  2. Preparar tampão de lise não desnaturante. Preparar tampão de lise no dia do ensaio de ligação a tampa. Adicione tampão de lise adicional para lavar as pérolas de agarose em branco e o γ-aminofenil-m 7 GTP agarose C10-ligados (passos 7.9 e 7.13).
    1. Em 7 ml de dH 2 O, adicionar 160 ul de 5 M NaCl, 160 ul de 1 M de Tris-HCl pH 7,4, 40 ul de 200 mM de NaF, 40 ul de 1 M de MgCl2, e ortovanadato de sódio 1 mM 40 ul.
    2. Adicionar 40 ul de Igepal-se à solução 7 ml. Cortar a ponta da pipeta para ajudar a recuperar o Igepal, uma vez que é extremamente viscoso.
    3. Misturar por pipetagem para cima e para baixo, ou de vórtice, a solução 7 ml até todo o Igepal foi dissolvido.
    4. Aumentar o volume final da solução de 8 ml e manter em gelo.
  3. Prepare tampão de 4x Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -Page Sample.
    1. Numa proveta, combinar 16 ml de 1 M de Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml de glicerol, e 8 ml de ditiotreitol (DTT).
    2. Adicionar 3,2 g de SDS e 0,16 g de azul de bromofenol. Permitir que o pó se dissolver completamente, misturando com uma barra de agitação magnética.
    3. Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.

6. Lise Celular

  1. Preparar tampão de lise não desnaturante e manter em gelo do dia do the ensaio de ligação cap-.
  2. Pré-aquecido PBS 1x tripsina e num banho de água a 37 ° C durante 30 min.
  3. Alíquotas de 980 ul de tampão de lise para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada teste de ligação de tampa a ser realizada.
  4. Adicionar 10 ul de 4- (2-aminoetil) benzenossulfonilo cloridrato de fluoreto e 10 ul de mistura de inibidores de protease 100X aos 980 ul de tampão de lise. Manter em gelo.
  5. Descarte a mídia a partir de cada prato 150 mm de um recipiente de resíduos dentro da estação de trabalho hipóxia.
  6. Lavar as células com 3-4 ml de PBS morno 1x e descartar todo o líquido.
  7. Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina quente-EDTA a cada placa e deixar repousar durante 2 minutos ou até que as células não estão aderidas à chapa.
  8. Usando uma pipeta, transferir as células de uma placa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita conforme necessário de modo a que cada placa de células é transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado.
  9. Centrifugar os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 6.000 xg durante 90 seg tO sedimentar as células.
  10. Aspirar a tripsina usando uma pipeta, sem perturbar o sedimento. Se o sedimento é perturbado, re-centrifugar o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 6000 xg durante 90 seg.
  11. Lavam-se as células com PBS morno 1x pipetando suavemente 200 ul de PBS para dentro do tubo imediatamente acima do sedimento. Re-se o sedimento de centrifugação é perturbado.
  12. Aspirar o PBS sem perturbar o sedimento.
  13. Pipetar 500 ul de 1 ml dos preparados solução tampão de lise sobre o primeiro sedimento celular. Ressuspender o sedimento inteiramente por pipetagem cima e para baixo.
  14. Combine as células ressuspensas com o segundo agregado de células e ressuspender o pellet segunda pipetando cima e para baixo. Repetir este processo até que todos os peletes foram combinadas e ressuspensas para cada amostra.
  15. Combinar o lisado com os restantes 500 ul de tampão de lise em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  16. Retirar amostras a partir da estação de trabalho hipóxia.
    NOTA: Depois de adicionar tampão de lise, all passos subsequentes devem ser realizadas no ar ambiente como a estação de trabalho hipoxia é definido como 37 ° C e os passos seguintes são para ser realizada a frio (4 ° C ou sobre gelo).
  17. Lisar as células, utilizando agitação suave através da rotação das amostras a 4 ° C durante 1,5-2 h.
  18. Centrifugar as células lisadas a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C para remover os restos celulares.
  19. Transferir o lisado para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL e rejeitar o sedimento.
  20. Reservar uma parte (5-10%) do sobrenadante a ser usado como um controle de entrada de lisado de células inteiras para futura análise Western Blot.

7. Ensaio de ligação Cap

  1. Para cada amostra, transferir 50 ul da suspensão de esferas de agarose de controlo em branco e 50 ul da suspensão do grânulo γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 ligado para separar 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Utilize uma tesoura para remover a ponta da pipeta para facilitar a recolha da pasta de grânulo.
  2. Sedimentar as contas bY centrifugação da suspensão a 500 xg durante 30 seg.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente as pérolas em 500 ul de TBS.
  4. Repita os passos 7.2 e 7.3. Sedimentar as pérolas a 500 xg durante 30 seg e remover o sobrenadante.
  5. Transferir o sobrenadante contendo o lisado proveniente de passo de 6,19 para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo as contas de agarose em branco.
    NOTA: As esferas de agarose em branco actuar como um passo de pré-limpeza para remover as proteínas a partir do lisado que não interagem especificamente com o grânulo.
  6. Incubar durante 10 min a 4 ° C com agitação suave.
  7. Sedimentar as pérolas de agarose em branco por centrifugação a 500 xg durante 30 seg.
  8. Transferir o lisado para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo os γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10.
  9. Lavam-se as pérolas de agarose em branco por ressuspensão das pérolas em 500 ul de tampão de lise, sedimentando os grânulos por centrifugação a 500 xg durante 30 seg, e descartando o Supernatant. Repetir este quatro vezes para um total de cinco lavagens.
  10. Ressuspender as esferas de agarose em tampão de amostra em branco 1x SDS-PAGE, e os grânulos ferver durante 90 segundos a 95 ° C. Armazenar a -20 ° C para futura análise de Western blot para observar se a proteína de interesse se liga não especificamente à esfera.
  11. Incubar o lisado com os grânulos γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 com ligações com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C para capturar as proteínas de ligação ao tampão.
  12. Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. Descartar o sobrenadante.
  13. Lavar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10, repetindo o passo 7.9.
  14. Ressuspender as pérolas em 600 ul de tampão de lise.
  15. Adicionar GTP a uma concentração final de 1 mM.
  16. Incubar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10 + GTP 1 mM, com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Esteirá dissociar as proteínas que não interactuam especificamente com M 7 GTP (isto é, também interagir com GTP não-metilada).
  17. Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg.
  18. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 200 ul de tampão de amostra 4x de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%). Armazenar a amostra de controlo de GTP a -20 ° C para futura análise de Western blot 37. Lave as contas repetindo o passo 7.9.
  19. Ressuspender as esferas em 1x tampão de amostra de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%), e ferver a 95 ° C durante 90 seg. Armazenar a fracção m-7 GTP ligado a -20 ° C para futura análise de Western blot 37.

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Resultados

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Análise da Capacidade Cap-obrigatório em resposta a Oxygen de eIF4E e eIF4E2 em uma m 7 GTP de afinidade de coluna

As Figuras 1 e 2 representam Western blot de m 7 GTP purificação por afinidade típica de duas importantes proteínas de ligação do tampão em resposta a flutuações de oxigênio em duas linhas de células humanas: células primárias humanas renais proximais tubulares ...

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Discussão

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A análise de proteínas de ligação de PAC em células humanas expostas a condições fisiológicas de oxigénio pode permitir a identificação de novos factores de iniciação de tradução regulada de oxigénio. A afinidade destes factores para a tampa 5 'do mRNA ou de outras proteínas associadas a tampa pode ser medida pela força da sua associação a 7 m-GTP ligados esferas de agarose. Uma limitação desta técnica é que ele mede o potencial de ligação a tampa de proteínas pós-lise, mas é realizada sob condições não d...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e pelo Ministério de Pesquisa e Inovação de Ontário.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
γ-aminofenil-m7GTP agarose C10 Placa deagarose m7GTP
100 mmCorning87722210 cm Placa de
cultura de 150 mmThermofisher13018315 cm
HidrocloroACROS OrganicsA0356829AEBSF
Contas de AgaroseJena Bioscience AC-0015Controle de contas de agarose
Bromofenol AzulFisherBP112-25Componente do buffer de carregamento SDS-PAGE
1,5 ml Tubos de centrífugaFroggaBio1210-00SUsado para centrifugar pequenos volumes
15 ml Tubos de centrífuga cônicosFisher1495970CUsado na cultura de células primárias
Inibidor de tripsina definidoFisherR007100DTI
DitiotreitolFisherBP172-25DTT
Meio de células epiteliais (kit completo)ScienCell4101Inclui suplementos de soro e fator de crescimento)
GlicerolFisherBP229-1Componente do tampão de carregamento SDS-PAGE
100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 carcinoma colorretalATCCCCL-247Linha celular de câncer humano
Células epiteliais tubulares proximais renais humanasATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/High GlucoseGE Life SciencesSH30022.01Meio padrão para cultura de células humanas
Solução de Hyclone Penicilina-EstreptomicinaGE Life SciencesSV30010Componente antibiótico do DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/AEstação de trabalho de hipóxia
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596Componente detergente do tampão de lise
Fosfato monopotássicoFisherP288-500KH2PO4
Cloreto de potássioFisherP217-500KCl
Cloreto de magnésioFisherM33-500MgCl2
Cloreto de sódioFisherBP358-10NaCl
Fluoreto de sódioFisher5299-100NaF (componente inibidor da fosfatase do tampão de lise)
Fosfato dissódicoFisher5369-500Na2HPO4
Grau Premium Fetal BovinoSeradigm1500-500FBS
Coquetel de Inibidor de Protease (100x)Sinalização Celular58715Componente do tampão de lise
Dodecil Sulfato de SódioFisherBP166-100SDS
Ortovanadato de SódioSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Componente de tampões
0,05% Tripsina-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Tripsina usada para separar células aderentes
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Referências

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