Fatores epigenéticos podem interagir com programas genéticos para modular a expressão gênica e regulam a função de células B. Combinando a estimulação de vitro em células B, qRT-PCR e elevado-throughput do microRNA-sequência e abordagens de RNAm-sequência, podemos analisar a epigenética modulação da expressão de gene e miRNA em células B.
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Artigo de método
Genoma-largo mediada por análise de inibidor HDAC modulação de microRNAs e mRNAs em B células induzidas a recombinação de DNA de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Respostas de anticorpos são realizadas através de vários processos, células B crítico-intrínseca, incluindo somática (SHM), recombinação de DNA de classe-switch (RSE) e diferenciação de células plasmáticas. Nos últimos anos, modificações epigenéticas ou fatores, tais como deacetilação de histona e microRNAs (miRNAs), têm sido mostrados para interagir com os programas genéticos de células B a respostas de anticorpos de forma, enquanto a disfunção dos fatores epigenéticos foi encontrada para conduzir a respostas de auto-anticorpos. Analisando a expressão de miRNA e mRNA de todo o genoma em células B em resposta a epigenéticas moduladores é importante para compreender a regulação epigenética da célula B função e anticorpo resposta. Aqui, demonstramos um protocolo para indução de células B submeter-se a diferenciação de RSE e células plasmáticas, tratando estas células B com inibidores de histona deacetilase (HDAC) (IDHs) e analisando a expressão do mRNA e microRNA. Neste protocolo, analisamos diretamente complementares sequências de DNA (cDNA) usando sequenciamento de mRNA de próxima geração (seq-mRNA) e tecnologias de miRNA-seq, mapeamento do sequenciamento lê ao genoma e quantitativa (qRT) a transcrição reversa-PCR. Com estas abordagens, definimos que, em células B induzidas a se submeter a RSE e diferenciação de células plasmáticas, HDI, um regulador epigenético, seletivamente modula a expressão miRNA e mRNA e altera a diferenciação de RSE e células plasmáticas.
Introdução
Marcas epigenéticas ou fatores, como a metilação do DNA e RNA não-codificante (incluindo microRNAs), posttranslational modificações do histone modulam a função celular, alterando a expressão de gene1. Modificações epigenéticas regulam a função de linfócitos B, tais como recombinação de DNA de classe-interruptor de imunoglobulina (RSE), somática (SHM) e diferenciação de células B de memória ou pilhas de plasma, desse modo, modulando o anticorpo e auto-anticorpos respostas de2,3. RSE e SHM criticamente exigem deaminase citidina induzida por ativação (auxílio, codificado como Aicda
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Protocolo
o protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais de The cuidados institucionais do Animal e uso de comitês da University of Texas Health Science Center em San Antonio.
1. estimulação de pilhas do rato de B para a RSE, diferenciação de células plasmáticas e HDI tratamento
- preparação de suspensões celulares de baço
Nota: executar todas as etapas em uma capa de fluxo laminar, com exceção do mouse eutanásia e dissecção.- Euthanize a isentos de agentes patogénicos específicos C57BL/6J mouse (8-12 semanas de idade) por inalação de CO 2.
- Colocar o mouse na placa de dissecação ....
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Resultados
Usando nosso protocolo, purificado de células B colocadas com LPS (3 µ g/mL) e IL-4 (5 ng/mL) para 96 h pode induzir a 30-40% da RSE para IgG1 e ~ 10% de diferenciação de células plasmáticas. Após o tratamento com HDI (500µM VPA), a RSE para IgG1 diminuiu para 10-20%, enquanto a diferenciação de células plasmáticas diminuíram de ~ 2% (Figura 1). Inibição mediada por HDI de RSE foi confirmada por uma diminuição da quantidade de pós-recombinação Iμ-Cγ1 e madura VH
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Discussão
Este protocolo fornece abordagens globais para induzir a comutação de classe B célula e diferenciação de células plasmáticas; para analisar o seu impacto por moduladores epigenéticos, ou seja, IDH; e para detectar o efeito de IDH na expressão do mRNA e miRNA nestas células. A maioria dessas abordagens também pode ser usada para analisar o impacto do factor epigenética na expressão de função e mRNA/miRNA B-célula humana. O qRT-PCR e mRNA-seq/miRNA-seq abordagens também podem ser usadas para analisar as células B isoladas .......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas 105813 AI e AI 079705 (para PC), a Aliança para identificação de alvo de pesquisa de Lúpus no lúpus Grant ALR 295955 (para PC) e a pesquisa da artrite National Research Foundation concedem (a HZ). TS foi apoiado pelo centro médico de Pediatria, segundo Xiangya Hospital, Universidade de South Central, Changsha, China, no contexto do programa visita Xiangya-UT escola de medicina, San Antonio de estudante de medicina.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos C57BL/6 | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Médio (Mod.) 1X com L-Glutamina (Tamanho: 6 x 500mL; Com L-Glutamina) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Solução Antimistótica Antibiótica 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoetanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Filtros de Células Falcon Fisher | Scientific | 21008-952 | |
| Mancha Azul Trypan 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Câmara de Contagem Bright-Line da Hausser Scientific | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Tubos de Poliestireno de Fundo Redondo com Tampa | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Kit de Isolamento de Células B de Camundongo | Stem Cell Tech | 19854 | |
| Apenas Agulha BD 18 Gauge 1.5 polegada SHORT BEVEL 100/caixa | BD Biosciences | ||
| PE/Cy7 anti-camundongo CD138 (Syndecan-1) Anticorpo | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 anticorpo | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-camundongo / humano CD45R / B220 anticorpo | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µ g | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-camundongo IgM Anticorpo | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-camundongo/humano CD45R/B220 Anticorpo | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-humano/camundongo CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Albumina de soro bovino, fração V, Tratamento para Choque Térmico | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolissacarídeos de Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Camundongo recombinante IL-4 (sem transportador) | BioLegend | 574302 (tamanho: 10 ug) | |
| Sal de sódio de ácido valpróico | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Classe II Tipo A2 | The Baker Company | SG404 | |
| Incubadora de CO2 de Grande Capacidade de Alcance | Banhos | 3950 | |
| Isotemp: Modelo 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Tubos de Centrífuga | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| Microtubo de 1,7 mL, transparente | Genesee | 22-282 | |
| Tubos de Centrífuga de Plástico de Leitura Fácil de Alta Velocidade 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M Rotor 6M.06 | |
| ELMI | 6M.06 | ||
| Drummond Portátil Controlador de pipeta Pipet-Aid XP | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Ponteiras de pipeta sorológica de 25 mL | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| Ponteiras de pipeta sorológicas de 10 mL | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| Ponteiras de pipeta sorológica de 5 mL | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| Placas de 48 poços | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Centrífuga de Bancada Allegra 6, Rotor Beckman | Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Não Refrigerado, Horizontal, ARIES Smart Balance | Centrífuga de Bancada Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R, Rotor | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Refrigerado, Ângulo Fixo | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Mixer de Vórtice Analógico Fisher Scientific | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Clorofórmio (Aprox. 0.75% Etanol como Conservante/Biologia Molecular) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Conjunto de Dnase Sem Rnase (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Espectrofotômetros | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III Sistema de Síntese de Primeiro Filamento RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Placas PCR Semi-Skirted de 96 Poços Fisherbrand, caixa de 25 | Microseal Fisher | 14-230-244 | |
| Módulo Óptico MyiQ | Bio-Rad | ||
| Chassi iCycler Bio-Rad | 170-8701 | ||
| Analisador de Citometria de Fluxo BD LSR II BD | Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalisador | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Ultrassônico Focalizado | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I para Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Sequenciador de Genoma | Illumina | SY-401-1001 | |
| Kit de Preparação de Biblioteca de RNA TruSeq v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| Kit de Preparação de Biblioteca de RNA Pequena TruSeq | Illumina RS-200-0012 | ||
| NEXTflex Illumina Pequena Kit de Sequenciamento de RNA v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
Referências
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P.
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Reimpressões e permissões
