Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Chen Huang; Guoqiang Gu

doi:10.3791/55160

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Artigo de método

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

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DOI:

10.3791/55160

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6 de janeiro de 2017

Chen Huang¹ , Guoqiang Gu¹

¹Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Resumo

protocolos de isolamento de ilhotas-à base de perfusão de grande pâncreas de mamíferos estão bem estabelecidos. Tais protocolos estão prontamente realizado em muitos laboratórios, devido ao grande tamanho do ducto pancreático que permite a injecção pronto colagenase e subsequente perfusão tecidual. Em contraste, o isolamento de ilhotas do pâncreas pequena, como a de ratinhos neonatais, é um desafio porque perfusão não é facilmente realizável na pequena pâncreas. Aqui nós descrevemos um procedimento simples detalhado que recupera um número substancial de ilhotas de ratos recém-nascidos com assistência visual. pancreata inteiro recentemente dissecados foram digeridos com 0,5 mg / ml de colagenase IV dissolvido em Hanks 'Solução Salina Equilibrada (SSHE) a 37 ° C, em tubos de microcentrífuga. Os tubos foram aproveitado regularmente para ajudar a dispersão do tecido. Quando a maior parte do tecido foi disperso em pequenos aglomerados de cerca de 1 mM, lisados foram lavados três a quatro vezes com meio de cultura com 10% de soro fetal de bovino (FBS). aglomerados de ilhotas,desprovidas de tecidos acinares reconhecíveis, pode então ser recuperado sob dissecando estereoscópio. Este método recupera 20 - 80 pequenas e ilhotas de grande porte por pâncreas de rato recém-nascido. Estas ilhotas são adequadas para ensaios a jusante mais possíveis, incluindo a secreção de insulina, a expressão do gene, e a cultura. Um exemplo do ensaio de secreção de insulina é apresentado para validar o processo de isolamento. O fundo genético e grau de digestão são os maiores fatores determinantes do rendimento. solução de colagenase recentemente feito com alta atividade é preferível, uma vez que auxilia no isolamento endócrino-exócrina. A presença de catiões [cálcio ^{(Ca2 +)} e magnésio ^{(Mg2 +)]} em todas as soluções e soro fetal de bovino na lavagem / meios de recolha são necessárias para um bom rendimento de ilhotas com integridade adequada. Um escopo de dissecação com bom contraste e ampliação também vai ajudar.

Introdução

O isolamento de ilhotas pancreáticas puras é essencial para a dosagem da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) de células beta e para o transplante de ilhotas de doadores cadáveres ^1-3. Também é necessário estabelecer a expressão gênica endócrina nas células das ilhotas ^{4, 5}. Para este fim, protocolos detalhados foram estabelecidos para permitir o isolamento de ilhotas pancreáticas de grandes pancreatas (⁶ e referências neles). Esses métodos são baseados na perfusão enzimática para dissociar o acinar dos tecidos das ilhotas, juntamente com a separação por gradiente e a colheita manual. Assim, o isolamento das ilhotas do pâ....