Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Resumo

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Resumo

protocolos de isolamento de ilhotas-à base de perfusão de grande pâncreas de mamíferos estão bem estabelecidos. Tais protocolos estão prontamente realizado em muitos laboratórios, devido ao grande tamanho do ducto pancreático que permite a injecção pronto colagenase e subsequente perfusão tecidual. Em contraste, o isolamento de ilhotas do pâncreas pequena, como a de ratinhos neonatais, é um desafio porque perfusão não é facilmente realizável na pequena pâncreas. Aqui nós descrevemos um procedimento simples detalhado que recupera um número substancial de ilhotas de ratos recém-nascidos com assistência visual. pancreata inteiro recentemente dissecados foram digeridos com 0,5 mg / ml de colagenase IV dissolvido em Hanks 'Solução Salina Equilibrada (SSHE) a 37 ° C, em tubos de microcentrífuga. Os tubos foram aproveitado regularmente para ajudar a dispersão do tecido. Quando a maior parte do tecido foi disperso em pequenos aglomerados de cerca de 1 mM, lisados ​​foram lavados três a quatro vezes com meio de cultura com 10% de soro fetal de bovino (FBS). aglomerados de ilhotas,desprovidas de tecidos acinares reconhecíveis, pode então ser recuperado sob dissecando estereoscópio. Este método recupera 20 - 80 pequenas e ilhotas de grande porte por pâncreas de rato recém-nascido. Estas ilhotas são adequadas para ensaios a jusante mais possíveis, incluindo a secreção de insulina, a expressão do gene, e a cultura. Um exemplo do ensaio de secreção de insulina é apresentado para validar o processo de isolamento. O fundo genético e grau de digestão são os maiores fatores determinantes do rendimento. solução de colagenase recentemente feito com alta atividade é preferível, uma vez que auxilia no isolamento endócrino-exócrina. A presença de catiões [cálcio ^{(Ca2 +)} e magnésio ^{(Mg2 +)]} em todas as soluções e soro fetal de bovino na lavagem / meios de recolha são necessárias para um bom rendimento de ilhotas com integridade adequada. Um escopo de dissecação com bom contraste e ampliação também vai ajudar.

Introdução

O isolamento de ilhotas pancreáticas puras é essencial para a dosagem da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) de células beta e para o transplante de ilhotas de doadores cadáveres ^1-3. Também é necessário estabelecer a expressão gênica endócrina nas células das ilhotas ^{4, 5}. Para este fim, protocolos detalhados foram estabelecidos para permitir o isolamento de ilhotas pancreáticas de grandes pancreatas (⁶ e referências neles). Esses métodos são baseados na perfusão enzimática para dissociar o acinar dos tecidos das ilhotas, juntamente com a separação por gradiente e a colheita manual. Assim, o isolamento das ilhotas do pâncreas grande pode ser realizado prontamente na maioria dos laboratórios. Por outro lado, não existe um protocolo passo a passo detalhado para permitir o isolamento de ilhotas do pâncreas que são pequenas demais para serem perfundidas.

Estudar a expressão gênica e a função das ilhotas neonatais é importante. As ilhotas neonatas têm propriedades diferentes dos adultos na capacidade de secreção e proliferação de insulina ^{7, 8}. No entanto, isolar ilhotas de animais recém-nascidos, especialmente camundongos, é um desafio devido ao pequeno tamanho do pâncreas recém-nascido. O tamanho impede o processo de perfusão usual quando a colagenase é injetada através do ducto pancreático. De fato, vários trabalhos apresentaram estudos nesse sentido, com procedimentos de isolamento enzimáticos ou não enzimáticos ^{7, 9, 10}. No entanto, falta uma descrição detalhada do processo de isolamento das ilhotas com auxílio visual ^{7, 9}, tornando um desafio para a maioria dos pesquisadores realizar estudos semelhantes.

Exploramos várias condições diferentes que produzem ilhotas de alta qualidade de camundongos neonatais. Aqui, apresentamos um protocolo que deve ajudar os pesquisadores a aprender os principais detalhes do processo de isolamento das ilhotas. Este protocolo é aplicável ao pâncreas de camundongos até duas semanas de idade, após o qual a perfusão pode ser realizada para isolamento de rotina das ilhotas. As ilhotas podem ser usadas diretamente para ensaios de secreção de insulina e expressão gênica.

Protocolo

utilização de animais segue os procedimentos especificados no protocolo M / 11/181 aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Vanderbilt para Gu. ratinhos CD1 ou CBA / Bl6 foram adquiridos de fornecedores comerciais e cruzou no biotério Vanderbilt obter camundongos neonatais.

1. Preparação de Ratos, Soluções de Stock, and Equipment

1. Para a cruz mouse: configurar uma cruz mouse e registrar as datas entupimento para auxiliar o planejamento experimental. ratinhos CD1 normalmente dão à luz por volta do dia 19 após o acasalamento. Use CD1 ou CBA / BL6 cruza para obter CD1 ou CBA / Bl6 neonatos, respectivamente. Intercruzamentos entre as duas linhas de utilizar fêmeas CD1 e machos CBA / Bl6.
2. Para o estoque de colagenase: pesar 200 mg de colagenase tipo IV com uma balança de alta precisão. Transferir para um tubo de centrífuga de 50 mL. Dissolve-se em 40 ml de HBSS com ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +} (1,26 e 0,5 mM, respectivamente) para produzir uma solução stock de 5 mg / mL.
   1. Permitir que a colagenasedissolver para ~ 30 min com agitação suave. Alíquotas e manter a solução congelada em -20 ° C como estoque, que permanece activo durante pelo menos um ano.
3. Autoclave para esterilizar vários pares de pinças, tesouras e dicas P20 para dissecção e picking ilhéu.
4. Para o estoque de glucose 1 H: pesar 9 g de glucose em um tubo de centrífuga de 50 ml, adicionar 50 ml de meio RPMI 1640 para dissolver a glicose. Tenha em 4 ° C até à sua utilização, mas não mais do que 6 meses.

2. As soluções de trabalho

NOTA: O dia de isolamento de ilhotas, preparar os seguintes reagentes.

1. Para a solução IV trabalho colagenase tipo: descongelar e diluir estoque colagenase no gelo. Dispensar 0,15 mL estoque em cada tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Adicionar 1,35 mL de HBSS com ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +.} Inverta o tubo 5 vezes. Deixar em gelo durante 15 min.
   1. Girar em alta velocidade por 3 min numa microcentrífuga. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Deixar em gelo até à sua utilização. Rejeitar o tubo de detritos insolúveis.
2. Para completo de mídia RPMI 1640: adicionar 2,5 mL 1 glucose M, 50 mL de calor FBS inactivado, e 5 mL 100x estoque Pen-strep em 500 ml RPMI 1640. Deixar em gelo até à sua utilização.

3. Isolamento pâncreas e Digestão

1. Eutanásia neonatos com isoflurano, seguido por decapitação de acordo com protocolos aprovados.
2. Coloque o mouse com a barriga virada para cima. Spray com 70% de etanol para esterilização.
3. Levantar a pele de barriga para cima, com uma pinça e cortar as camadas da pele e músculo longitudinalmente ao longo da linha média com um par de tesouras, a partir da área genital para a caixa torácica. Isto abre a cavidade abdominal para expor todos os órgãos internos.
4. Transferir todos os órgãos internos, de 100 cm de placa com um par de pinças. Localize o pâncreas, que é um órgão-dispersa com uma porção dorsal que se agarra ao estômago e baço e uma porção ventral que se agarra ao duodeno ^11.
5. Adicionar HBSS no prato para submergir os órgãos. Em solução, os tecidos pancreáticos não se agarram ao duodeno, estômago, ou baço. É facilmente reconhecível sob um escopo de dissecação causa de sua cor branca típica. Use um par de pinças para descascar os tecidos pancreáticos longe do tecido circundante e transferir para um novo prato 60 mm, com HBSS.
6. Corte cada pâncreas com uma tesoura em pedaços menores que 5 mm em qualquer dimensões. Transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Até cinco pancreata (menores de P7) pode ser digerida em um tubo. Para ratos P8-P16, use um tubo por pâncreas.
7. Adicionar 0.5 - Solução de trabalho de 1 ml a cada tubo colagenase (0,2 ml para cada pâncreas P1-P7 Utilizar 0,5 mL por cada pâncreas P8-P16.). Deixar o tubo numa incubadora a 37 ° C durante até 15 min. Inverta o tubo duas vezes a cada min.
8. Depois de ~ 5 min, toque no tubo para monitorar o estado de digestão do tecido pancreático. Prosseguir o processo de digestão até que a maior parte do pâncreastecido aparece como grupos de células fragmentadas, com diâmetro <2 mm. O ligado aparece turva, o que é devido a autólise celular acinar normal.

4. Lysate de lavar roupa

1. Girar o lisado a 500 xg durante 10 s numa microcentrifuga. Retirar a camada sobrenadante com um Pipetman P1,000. O sobrenadante deve aparecer turva mas desprovido de agregados de células. Não utilizar aspiração, que pode aspirar rapidamente afastado os fragmentos de tecido na parte inferior devido à presença de uma amostra de DNA pegajoso.
2. Adicione 1 mL RPMI 1640 mídia completo. Toque suavemente o tubo para voltar a suspender o lisado fragmentado. Inverta cima e para baixo 10 vezes. Repita o passo 4.1.
3. Repita o passo 4.2 mais duas vezes ou até que o sobrenadante claro. Re-suspender pancre�ticos lavadas em 1 mL completos RPMI 1640.

5. Isolamento Islet

NOTA: Para um pequeno número de pancreata, mão-picking direto como a seguir (5.1) pode ser usado para o isolador do ilhéução. Para grandes números de pâncreas (> 6), é preferido o método descrito no ponto 5.2.

1. mão-picking direto:
   1. Transferir o lisado do passo 4.3 para um prato de 60 mm. Adicionar 5 ml completos RPMI 1640. Traga sob um microscópio de dissecação.
   2. Configurar a iluminação de campo brilhante no microscópio. Ajustar a intensidade da luz de ~ 50% da potência máxima. Sob esta condição, ilhotas aparecer como um pouco cachos cor de rosa, enquanto as células acinares aglomerados de forma irregular como escuras (Figura 1A). A ampliação de ~ 50X (combinando o poder da objetiva e da parte do olho) é recomendado para oferecer a melhor maneira de ilhotas visualização e a abertura ponta da pipeta, simultaneamente, para a colheita.
   3. Pegar ilhotas com uma ponta de pipeta P20, evitando aglomerados acinares. Fracções dispensar ilhotas enriquecido a um novo prato de 60 milímetros com meio RPMI completo (Figura 1B).
   4. Repita o processo de mão-picking mais duas vezes. Deixar ilhotas puro em uma nova 60prato mm com 4 ml de meio RPMI completo (Figura 1C).
2. centrifugação em gradiente:
   1. Preparar um tubo de centrífuga de 15 ml que é pré-carregado com 2 mL de polissacarose e diatrizoato de sódio, a uma densidade de 1,077 g / mL. Deixe o tubo em gelo até à sua utilização.
   2. Transferir a suspensão do passo 4.3 sobre o topo da solução de diatrizoato de sódio e polissacarose com uma pipeta de Pasteur. Não perturbe a camada inferior. Os tecidos de até 10 recém-nascidos ou 2 P17 pancreata pode ser colocada em cada tubo de 15 ml.
   3. Girar o tubo de a ~ 600 x g num rotor oscilante durante 15 min a 4 ° C. Use as configurações de freio-off.
   4. Após a centrifugação, transferir a mídia e camadas interfase (note que em condições de operação ideais, as ilhotas será localizado na interfase entre o polissacarose e cultura da mídia após a centrifugação) para um novo tubo de 15 mL. Adicionar 10 ml de mídia, misture delicadamente mas completamente.
   5. Spin down a fração enriquecida com ilhéua 300 xg durante 5 min. Remova o meio de lavagem. Repetir a lavagem mais uma vez com meio RPMI completo. Pelotas Ressuspender em 4 mL de mídia, que contém a maioria dos ilhéus e dutos (Figura 1D).
   6. Mão-pegar as ilhotas, conforme descrito na secção 5.1.

6. Os ensaios GSIS em isolados Ilhotas

1. Incubar os ilhéus a partir do passo 5.1.4 em meio RPMI completo, durante 2 h num incubador de cultura de tecido C 37 °.
2. Usar uma pipeta para remover RPMI sob um microscópio de dissecação. Adiciona-se 3 mL de solução de KRB com glucose 2,8 mM e a placa ^3. Agitar 10 vezes para lavar as ilhotas. Remover soluções KRB.
   1. Repetir o processo de lavagem uma vez. Incubar as ilhotas com 3 mL de solução de KRB a 37 ° C durante 1 hora numa incubadora.
3. Aliquota de 1 mL de KRB a cada poço de uma placa de 12 poços. Pré-aqueça o estoque KRB e placa a 37 ° C em uma incubadora.
4. Lavar as ilhotas duas vezes com KRB pré-aquecido como em 6.2. transfer 10 ilhotas para cada poço das placas pré-aquecido. Incubar numa incubadora a 37 ° C.
5. Após 45 minutos, retirar-se 50 ul de sobrenadante. Este contém a solução de insulina segregada sob basais de glucose.
6. Adicionar glucose 32 mL de 500 mM. Agitar a placa 20 vezes para misturar a solução. Incubar numa incubadora a 37 ° C. Agitar a placa 5 vezes a cada 5 min.
7. Após 45 minutos, retirar-se 50 uL de sobrenadante. Esta é a insulina segregada sob alto teor de glucose.
8. Transfira todas as ilhotas a um tubo de 1,5 mL. Congelar em -20 ° C durante 30 min. Descongelar à temperatura ambiente durante 5 min. Repita o processo de congelamento e descongelamento.
9. Adicionar 0,5 mL de etanol a 70% com HCl 20 mM. Deixe durante a noite. Esta é a insulina nas ilhotas.
10. Use de ELISA convencional para ensaiar os níveis de insulina, descrito anteriormente ^3.

Resultados

Em condições óptimas, o método apresentado pode rendimento de 20 - 80 de cada pequena ilhotas do pâncreas do rato. Este número depende do fundo genético, idade de ratinhos, e o tamanho das ilhotas para ser recuperado. Entre os comumente usados, CD1 fora de raça C57BL / 6J de raça pura produzem menos ilhotas com tamanho menor do que híbridos entre CD1 e C57BL / 6 ou B6CBAF1 comercial / mice J fazer. Mão directa colheita geralmente deu um menor número de ilhotas, provavelmente devido à exc...

Discussão

Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo de isolamento de ilhotas de pâncreas que são demasiado pequenos para perfusão convencional. Espera-se, para se obter ilhotas prontos para todos os estudos baseados em purificação de ilhotas, tais como beta-célula, a análise da expressão do gene, a maturação das células beta dos ilhéus pancreáticos, proliferação, as respostas de stress celular, sobrevivência celular, metabolismo, e manutenção GSIS funcional, etc. Este será, para o melhor do nosso conhecimento, o pr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase Tipo IV	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C5138
1x HBSS com Ca2+/Mg2+	Mediatech/Cellgro, Manassas, VA	MT21020CV	Se o HBSS sem Ca2+/Mg2+ for obtido, CaCl2 e MgSO4 podem ser adicionados a 1,26 e 0,5 mM, respectivamente.
RPMI 1640 sem glicose	Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA	11879-020	A glicose precisa ser adicionada a níveis específicos para não interferir no uso subsequente das ilhotas.
Glicose	Sigma Aldrich, St Louis, MO	G-7021
solução de polissacarose e diatrizoato de sódio	Sigma Aldrich, St Louis, MO	Histopaque-10771
Estereoscópio	Carl-Zeiss, Oberkochen, Alemanha	Stemi2000
Stereoscope	Leica, Wetzlar, Alemanha	Microcentrífuga Leica M165
	Eppendorf, Hauppauge, NY	Centrífuga 5417C
Centrífuga	Eppendorf, Hauppauge, NY	Centrifuge 5810R
Tubos centrfuge de 15 mL	VWR, Radnor, PA	89039-666
Tubos centrfuge de 50 mL	VWR, Radnor, PA	89039-658
Balança de precisão	VWR, Radnor, PA	VWR-225AC
Tubos de microfuga	VWR, Radnor, PA	87003-294
Pipetman P1000	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123602
Pipetman P20	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123600
prato de 100 x 15 mm	VWR, Radnor, PA	25384-088
prato de 60 x 15 mm	VWR, Radnor, PA	25384-168
Pratos de 12 poços	VWR, Radnor, PA	665-180
Scissor	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	14080-11
Pinças	Fine Scientific Tools, Foster City, CA	5708-5
Camundongos CD1	Charles River Laboratories, Wilminton, MA	CD-1
C57BL/6J	O laboratório Jackson, Farmington, CT	C57BL/6J
B6CBAF1/J	O laboratório Jackson, Farmington, CT	B6CBAF1/J