Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla In Situ Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Summary

O presente protocolo descreve a utilidade da hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e do cariótipo espectral (SKY) na identificação de aberrações estáveis intercromossômicas nas células da medula óssea de camundongos após exposição à irradiação total do corpo.

Abstract

A radiação ionizante (IR) induz numerosas aberrações cromossômicas estáveis e instáveis. Aberrações instáveis, onde a morfologia cromossômica está substancialmente comprometida, podem ser facilmente identificadas por técnicas convencionais de coloração cromossômica. No entanto, a detecção de aberrações estáveis, que envolvem troca ou translocação de materiais genéticos sem modificação considerável na morfologia cromossômica, requer técnicas sofisticadas de pintura cromossômica que dependem da hibridização in situ de sondas de DNA marcadas com fluorescência, uma técnica de pintura cromossômica popularmente conhecida como fluorescência in situ hibridização (FISH). As sondas FISH podem ser específicas para cromossomos inteiros ou sub-regiões precisas em cromossomos O método não só permite a visualização de aberrações estáveis, mas também pode permitir a detecção do(s) cromossomo(s) ou sequência(s) específica(s) de DNA envolvida(s) em uma formação de aberração específica. Uma variedade de técnicas de pintura cromossômica está disponível em citogenética; aqui, dois métodos altamente sensíveis, hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e cariótipo espectral (SKY), são discutidos para identificar aberrações estáveis intercromossômicas que se formam nas células da medula óssea de camundongos após a exposição à irradiação total do corpo. Embora ambas as técnicas dependam de sondas de DNA marcadas com fluorescência, o método de detecção e o processo de aquisição de imagens dos sinais fluorescentes são diferentes. Essas duas técnicas têm sido utilizadas em diversas áreas de pesquisa, como biologia da radiação, citogenética do câncer, biodosimetria retrospectiva por radiação, citogenética clínica, citogenética evolutiva e citogenética comparativa.

Introduction

Os dois métodos mais confiáveis de identificação de aberrações estáveis intercromossômicas induzidas por radiação são a hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH), que permite a pintura de dois ou mais cromossomos simultaneamente, e o cariótipo espectral (SKY), que confere uma cor distinta a cada par de cromossomos homólogos no genoma. Ao contrário das aberrações instáveis, as aberrações estáveis são de natureza persistente e podem ser propagadas por várias gerações em populações irradiadas¹, e são consideradas "assinaturas" moleculares críticas de lesões citogenéticas induzidas por radiação². Estudos de vários grupos têm mos....

Protocol

Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Todos os animais foram alojados em instalações para animais com ar condicionado padrão a 20 ± 2 ° C com 10 - 15 ciclos de uma hora de ar fresco e livre acesso à alimentação padrão para roedores e água. Após a chegada, os ratos foram mantidos em quarentena por uma semana e desde ração para roedores certificado.

Exposição 1.Radiation e....

Results

irradiação total do corpo induz inúmeras aberrações cromossómicas em células da medula óssea de ratos irradiados. O actual protocolo foi optimizado para a paragem da mitose in vivo de células de medula óssea após a exposição à radiação, a colheita de células de medula óssea a partir das patas traseiras de ratos irradiados, o isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade, a preparação dos diferenciais de células da metafase, e sub.......

Discussion

Vários passos críticos determinar o sucesso de mFISH e SKY. O primeiro e mais importante passo é para optimizar o tratamento com colchicina para paragem da mitose in vivo das células mononucleares de medula óssea. A concentração de colchicina e tempo de tratamento individual ou em concertação determinar o índice mitótico, bem como de cromossomos de condensação de dois pré-requisitos importantes para a pintura cromossomo eficaz. Uma alta concentração de colchicina ou um tempo mais longo de tratamento conduz a cr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formamida	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC Buffer 20× Reagente de laboratório concentrado	Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY para	imagem espectral aplicada	em camundongo FPRPR0030/M40
CAD - Kit de detecção de anticorpos concentrado	Imagem espectral aplicada	FPRPR0033
tintas simples personalizadas - 3 cores; Cromossomo 1 de camundongo: Vermelho, Cromossomo 2 de camundongo: Verde, Cromossomo 3 de camundongo: Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Lamínulas de vidro	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Ácido clorídrico, 37%, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Pratos de Mancha de Vidro Fisherbrand com Tampa de Rosca	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX Solução de Cloreto de Potássio	Life Technologies	10575-090
Lâminas de Microscópio Superfrost Plus da Fisherbrand Fisher	Scientific	12-550-15
Pó Colcemid	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaque-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, modelo 25 irradiador 137Cs J	. L. Shepherd & Seringa	Modelo 484B
1 mL	BD Biosciences	647911
Álcool Etílico, 200 Provas	Fisher Scientific	MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), sem Cálcio e Magnésio	Fisher Scientific	ICN1860454
Soro Fetal Bovino	Fisher Scientific	10-437-010
Metanol	Fisher Scientific	A454SK-4
Microscópio	científico glacial	Fisher AC295320010
Zeiss		Imager.Z2