Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla In Situ Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Summary

O presente protocolo descreve a utilidade da hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e do cariótipo espectral (SKY) na identificação de aberrações estáveis intercromossômicas nas células da medula óssea de camundongos após exposição à irradiação total do corpo.

Abstract

A radiação ionizante (IR) induz numerosas aberrações cromossômicas estáveis e instáveis. Aberrações instáveis, onde a morfologia cromossômica está substancialmente comprometida, podem ser facilmente identificadas por técnicas convencionais de coloração cromossômica. No entanto, a detecção de aberrações estáveis, que envolvem troca ou translocação de materiais genéticos sem modificação considerável na morfologia cromossômica, requer técnicas sofisticadas de pintura cromossômica que dependem da hibridização in situ de sondas de DNA marcadas com fluorescência, uma técnica de pintura cromossômica popularmente conhecida como fluorescência in situ hibridização (FISH). As sondas FISH podem ser específicas para cromossomos inteiros ou sub-regiões precisas em cromossomos O método não só permite a visualização de aberrações estáveis, mas também pode permitir a detecção do(s) cromossomo(s) ou sequência(s) específica(s) de DNA envolvida(s) em uma formação de aberração específica. Uma variedade de técnicas de pintura cromossômica está disponível em citogenética; aqui, dois métodos altamente sensíveis, hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e cariótipo espectral (SKY), são discutidos para identificar aberrações estáveis intercromossômicas que se formam nas células da medula óssea de camundongos após a exposição à irradiação total do corpo. Embora ambas as técnicas dependam de sondas de DNA marcadas com fluorescência, o método de detecção e o processo de aquisição de imagens dos sinais fluorescentes são diferentes. Essas duas técnicas têm sido utilizadas em diversas áreas de pesquisa, como biologia da radiação, citogenética do câncer, biodosimetria retrospectiva por radiação, citogenética clínica, citogenética evolutiva e citogenética comparativa.

Introduction

Os dois métodos mais confiáveis de identificação de aberrações estáveis intercromossômicas induzidas por radiação são a hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH), que permite a pintura de dois ou mais cromossomos simultaneamente, e o cariótipo espectral (SKY), que confere uma cor distinta a cada par de cromossomos homólogos no genoma. Ao contrário das aberrações instáveis, as aberrações estáveis são de natureza persistente e podem ser propagadas por várias gerações em populações irradiadas¹, e são consideradas "assinaturas" moleculares críticas de lesões citogenéticas induzidas por radiação². Estudos de vários grupos têm mostrado que aberrações estáveis estão associadas à patogênese e ao desenvolvimento de uma série de doenças, incluindo o câncer³. Antes da era da pintura cromossômica (também conhecida como citogenética molecular), a técnica convencional de banda G era o único método para detectar aberrações cromossômicas estáveis. No entanto, o bandeamento cromossômico é um desafio para os citogeneticistas porque a resolução é limitada, a reprodutibilidade é incerta, é um procedimento trabalhoso e requer citogeneticistas altamente qualificados e experientes para uma interpretação confiável dos dados⁴. Além disso, a técnica clássica de bandagem não permite a detecção de rearranjos cromossômicos complexos, que envolvem a interação de três ou mais quebras distribuídas entre dois ou mais cromossomos, um resultado comum de danos por radiação. Aberrações complexas podem persistir em indivíduos muitos anos após a exposição à radiação, tornando-as úteis para biodosimetria retrospectiva⁵. Portanto, uma abordagem alternativa foi necessária para superar as limitações das técnicas convencionais de bandas para detectar rearranjos cromossômicos estáveis.

No final da década de 1960, o trabalho pioneiro de Gall e Pardue (1969) sobre hibridização molecular usando sondas de ácido nucleico marcadas com material radioativo deu início a uma nova era no campo da citogenética, que permitiu a detecção de uma sequência específica de DNA nos cromossomos⁶. No entanto, o uso de sondas radioativas para hibridização molecular teve várias desvantagens: as sondas radioativas são relativamente instáveis, a atividade da sonda depende do decaimento radioativo do isótopo usado, a hibridização leva mais tempo, a resolução é limitada, as sondas são relativamente caras e os materiais radioativos são perigosos para a saúde. Assim, tornou-se necessário desenvolver e projetar sondas não radioativas. A introdução de sondas de ácido nucleico marcadas com fluorescência nas décadas de 1980 e 1990 superou as limitações das sondas radioativas e aumentou muito a segurança, sensibilidade e especificidade da técnica de hibridização^7-10. As sondas fluorescentes dão origem a sinais extremamente brilhantes quando observadas em microscópios de fluorescência equipados com os filtros de excitação e emissão apropriados. Qualquer perda, ganho ou rearranjo de cromossomos marcados com fluorescência ou parte do cromossomo é facilmente identificável com esta técnica FISH.

A análise de aberrações cromossômicas pela pintura FISH levou a um progresso acentuado na pesquisa citogenética ao longo dos anos. O projeto de sondas marcadas com fluorescência para aplicações específicas, desde sondas específicas de locus até sondas de pintura de cromossomos inteiros, avançou significativamente o campo; Isso também facilitou a detecção de rearranjo submicroscópico ("críptico"), o que não era possível por bandas cromossômicas convencionais. A pintura cromossômica por mFISH e SKY provou ser ferramentas valiosas para a identificação de rearranjos intercromossômicos simples e complexos. Os princípios básicos para ambas as técnicas são semelhantes, mas o método de detecção e discriminação do sinal fluorescente após hibridização in situ e o processo de aquisição de imagens são diferentes. No mFISH, imagens separadas de cada um dos quatro fluorocromos são capturadas usando filtros de microscópio passa-banda estreitos; O software dedicado é então usado para combinar as imagens. Enquanto no SKY, a aquisição de imagens é baseada em uma combinação de microscopia de epifluorescência, imagem de dispositivo acoplado a carga e espectroscopia de Fourier, que permite a medição de todo o espectro de emissão com uma única exposição em todos os pontos da imagem. Tanto no mFISH quanto no SKY, as imagens monocromáticas são capturadas de forma independente, depois mescladas e, finalmente, pseudocores exclusivas são atribuídas aos cromossomos em imagens monocromáticas com base no corante específico anexado a cada sonda de fluorocromo.

A contribuição da análise mFISH e SKY no campo da biologia da radiação é notável, particularmente para estimativa retrospectiva da dose de exposição humana à IR (biodosimetria por radiação)^11-14, avaliação do risco de carcinogênese por radiação¹⁵, bem como detecção e estimativa de risco de câncer secundário relacionado à radioterapia¹⁶. Um estudo recente em camundongos mostrou que uma técnica de pintura cromossômica baseada em FISH também é uma ferramenta importante para avaliar a eficácia da contramedida de radiação¹⁷. No presente estudo, o efeito da exposição total à radiação corporal na indução de aberrações cromossômicas estáveis nas células da medula óssea de camundongos foi demonstrado usando as técnicas mFISH e SKY.

Protocol

Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Todos os animais foram alojados em instalações para animais com ar condicionado padrão a 20 ± 2 ° C com 10 - 15 ciclos de uma hora de ar fresco e livre acesso à alimentação padrão para roedores e água. Após a chegada, os ratos foram mantidos em quarentena por uma semana e desde ração para roedores certificado.

Exposição 1.Radiation e In Vivo Detenção de células em metafase

1. ratos expor un-anestesiados com 2 Gy de radiação de corpo inteiro em uma câmara de irradiação. Durante a irradiação, colocar ratos em uma câmara de retenção bem ventilado para garantir que eles não se movem livremente e receber uma dose uniforme.
2. Injectar 100 ul de solução de colchicina a 0,05% (Cpó olchicine dissolvido em cálcio e magnésio livre PBS) por via intraperitoneal usando uma agulha 25 G anexo com 1 mL seringa descartável. Evitar a injeção diretamente em qualquer órgão.
3. Deixar o animal na gaiola durante 2 h antes da colheita de células de medula óssea. Observar o animal para detectar quaisquer sinais de dor ou sofrimento.

2. Colheita da medula celular e Isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade

1. Euthanize o mouse por asfixia com _CO2.
2. Spray de etanol a 70% sobre o lado ventral e dorsal.
3. Adicione de 2 cm da incisão na pele abdominal com uma tesoura afiada. Segure a pele em ambos os lados da incisão com uma pinça sem corte e puxe abrir os músculos abdominais.
4. Cortar ambas as patas traseiras com uma tesoura e coloque-os imediatamente na pré-refrigerados PBS com 4% de FBS.
5. Limpe cuidadosamente todos os músculos ligados à pata traseira com uma lâmina de barbear e gaze de algodão bandage afiada.
6. Separe a tíbia do fêmur. Apare as duas pontas de cada osso com uma lâmina de barbear.
7. Lavar o conteúdo da medula óssea com 3 mL de PBS (com 4% de FBS), utilizando uma agulha de 23 G ligada a uma seringa de 3 ml e recolher o conteúdo num tubo de centrífuga de 15 mL. Passar a suspensão de células, pelo menos, 10 vezes, através da agulha para fazer uma suspensão de células individuais.
8. Cuidadosamente sobrepor a suspensão de células em um volume igual de meio de separação de linfócitos (3 mL), sem perturbar a interface entre a suspensão de células e meio de separação de linfócitos. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente.
9. Recolher o creme leucocitário cuidadosamente, sem perturbar as outras camadas e transferência em um novo tubo de centrífuga de 15 mL.

3. Preparação de Spreads celular Metaphase

1. Adicionar 10 ml de PBS ao tubo contendo o buffy coat.
2. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, quebrar-se tele célula pellet com toque suave e adicionar 10 mL PBS.
4. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular, quebrar-se o sedimento, e adicionar 4 ml de solução de cloreto de potássio 0,075 M hipotónica pré-aquecido. Adicionar gota solução hipotônica a gota, com agitação constante suave.
6. Incubar as células durante 20 min a 37 ° C num banho de água.
7. Após o tratamento hipotónico, adicionar um volume igual (4 ml) do fixador (metanol: ácido acético glacial, 3: 1 v / v) no tubo de 15 mL e misturar suavemente por inversão do tubo.
8. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
9. Quebra-se o agregado de células com batimento seguido de vortex suave durante alguns segundos e adicionar 3 mL de gota solução fixadora a gota, com agitação constante.
10. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugar a 400 xg durante 5 min.
11. Remover o sobrenadante, romper o pellet celular com gentle tocando, e adicionar 3 ml de fixador fresco.
12. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante. Quebra-se o pellet celular com toque suave, e adicionar fresco 3 ml de fixador.
13. Repita o passo 3.12 mais duas vezes.
14. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Em seguida, adicione 400 a 600 mL fixador e misturar completamente com pipetagem.
15. Queda de 30 mL células fixadas em lâminas pré-limpas e molhadas inclinado em um ângulo de 45 ° e permitir que as lâminas para o ar seco completamente durante a noite.

4. mouse pintura cromossômica por mFISH

1. A desnaturação cromossomo
   1. Colocar a lâmina contendo diferenciais de células em metafase 2x SSC durante 2 minutos à temperatura ambiente.
   2. Desidratar a corrediça por lavagem etanol série durante 2 minutos cada em 70%, 80%, e 100%. Incubar durante 60 minutos a 65 ° C.
   3. Pré-aqueça solução de desnaturação de 40 mL (70% de formamida / 2x SSC; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) num frasco Coplin vidro durante 30 min. Desnaturar cromossomos incubando o slide na solução de desnaturação pré-aquecido para 1-1,5 min.
   4. Extingue-se deslizar imediatamente em gelo-etanol frio a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação. Em seguida, desidrata por lavagem com etanol a 80% durante 2 min. Repetir a lavagem de etanol com 100% de etanol por 2 min. Completamente secar o slide à temperatura ambiente.
2. Desnaturação e Hibridação da sonda Mistura
   1. Resumidamente, centrifugar a mistura de sonda fornecido pelo fabricante, transferir 10 ul de mistura de sonda para um encaixe 500 uL tampão tubo de centrífuga, e desnaturadas por incubação a 80 ° C (± 2 ° C) em banho de água durante 7 minutos.
   2. Colocar o tubo de centrifugação com a mistura de sonda num banho de água a 37 ° C durante 10 min.
   3. Aplique a mistura sonda desnaturada para o slide com chromoso desnaturadomes.
   4. cobrir cuidadosamente a área com um x 18 mm lamela de vidro 18 mm e eliminar as bolhas de ar visíveis, pressionando muito suavemente a lamínula a deslizar. Selar todos os quatro lados da lamela de cobertura com cimento de borracha e incubar durante 12 h a 16 h no escuro a 37 ° C numa câmara humidificada para hibridação.
3. Pós Hibridização de lavar roupa e Detecção
   1. Retire cuidadosamente o cimento de borracha ea lamela.
   2. Colocar a lâmina em SSC 0,4x pré-aquecido a 74 ° C (± 2 ° C) durante 5 min.
   3. Lavar corrediça na solução de lavagem II (4x SSC / 0,1% de Tween-20) durante 2 min.
   4. Coloque 20 mL de anti-fade meio de montagem com DAPI contracoloração (1,5 mg / mL) e cobrir com uma lamela de vidro. Pressione suavemente lamela com o tecido laboratório para remover as bolhas de ar e solução de montagem excesso. Selar as bordas da lamela com unha polonês.
   5. Visualização de slides usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros adequados.

5. Spectral Cariotipagem (SKY) do mouse Cromossomos

1. Cromossomos e Probe desnaturação
   1. Equilibrar corrediça em 2x SSC à temperatura ambiente durante 2 minutos, sem agitação.
   2. Desidratar diapositivos numa série de etanol (70%, 80%, e 100% de etanol) durante 2 minutos cada, à temperatura ambiente. Ar seco a corrediça para remover o etanol completamente.
   3. solução quente de 40 ml de desnaturação (70% formamida / 2x SSC; pH 7,0) em um frasco Coplin vidro durante 30 min.
   4. Incubar corrediça na solução de desnaturação pré-aquecido durante 1 a 1,5 minutos.
   5. mergulhar imediatamente a deslizar para gelada etanol a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação.
   6. Desidratar a corrediça, colocando-o em etanol a 80% durante 2 min e em seguida em etanol a 100% durante 2 min à temperatura ambiente.
   7. Desnaturar a sonda CÉU (frasco n ° 1 fornecido pelo fabricante) num banho de água regulado para 80 ° C (± 2 ° C)durante 7 minutos, e, em seguida, colocar imediatamente em um banho de água diferente definido como 37 ° C durante 10 min.
2. sonda de hibridação
   1. Adicionar 10 ul de sonda desnaturada CÉU para os cromossomas desnaturadas.
   2. Com cuidado, coloque um x 18 mm lamela de vidro 18 mm sobre a sonda SKY modo que não há bolhas de ar presas sob a lamela.
   3. Selar as bordas da lamela com cimento de borracha.
   4. Colocar a lâmina numa câmara humidificada à prova de luz e incubar no escuro a 37 ° C durante 24 h a 36 h.
3. Lavagem pós-hibridação e detecção de fluorescência
   1. Remover o cimento de borracha com muito cuidado, sem perturbar a lamela.
   2. Colocar a lâmina em pré-aquecido a solução de lavagem rápida (SSC 0,4x) a 72 ° C (± 2 ° C) durante 5 min com agitação constante. Imergir corrediça em solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar durante 1 minuto, agitando.
   3. Opcional: adicionar 80 ul de reagente de bloqueio(Frasco n ° 2 fornecido pelo fabricante) para a área de hibridação, coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se no escuro a 37 ° C durante 30 minutos numa câmara humidificada.
   4. Suavemente remover a lamela de plástico e lava-se a corrediça com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III durante 5 min.
   5. Aplicar 80? L de reagente de coloração com Cy5 (frasco n ° 3 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada.
   6. Dip slide num frasco Coplin contendo vidro pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar a 45 ° C num banho de água durante 2 min com agitação. Repita este passo de lavagem 3 vezes.
   7. Aplicar 80? L de reagente de coloração Cy5.5 (frasco n ° 4 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada.
   8. Lave o slide 3 vezes com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III.
   9. Segure o slide em uma posição inclinada contra uma toalha de papel para drenar o excesso de líquido. Adicionar 20 ul anti-fade reagente DAPI (frasco # 5 fornecido pelo fabricante) e coloque cuidadosamente um x 60 milímetros lamela de vidro 24 mm sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Selar as bordas da lamela com unha polonês e observar com um microscópio de epifluorescência equipado para capturar imagens do céu.

Results

irradiação total do corpo induz inúmeras aberrações cromossómicas em células da medula óssea de ratos irradiados. O actual protocolo foi optimizado para a paragem da mitose in vivo de células de medula óssea após a exposição à radiação, a colheita de células de medula óssea a partir das patas traseiras de ratos irradiados, o isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade, a preparação dos diferenciais de células da metafase, e sub...

Discussion

Vários passos críticos determinar o sucesso de mFISH e SKY. O primeiro e mais importante passo é para optimizar o tratamento com colchicina para paragem da mitose in vivo das células mononucleares de medula óssea. A concentração de colchicina e tempo de tratamento individual ou em concertação determinar o índice mitótico, bem como de cromossomos de condensação de dois pré-requisitos importantes para a pintura cromossomo eficaz. Uma alta concentração de colchicina ou um tempo mais longo de tratamento conduz a cr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formamida	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC Buffer 20× Reagente de laboratório concentrado	Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY para	imagem espectral aplicada	em camundongo FPRPR0030/M40
CAD - Kit de detecção de anticorpos concentrado	Imagem espectral aplicada	FPRPR0033
tintas simples personalizadas - 3 cores; Cromossomo 1 de camundongo: Vermelho, Cromossomo 2 de camundongo: Verde, Cromossomo 3 de camundongo: Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Lamínulas de vidro	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Ácido clorídrico, 37%, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Pratos de Mancha de Vidro Fisherbrand com Tampa de Rosca	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX Solução de Cloreto de Potássio	Life Technologies	10575-090
Lâminas de Microscópio Superfrost Plus da Fisherbrand Fisher	Scientific	12-550-15
Pó Colcemid	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaque-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, modelo 25 irradiador 137Cs J	. L. Shepherd & Seringa	Modelo 484B
1 mL	BD Biosciences	647911
Álcool Etílico, 200 Provas	Fisher Scientific	MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), sem Cálcio e Magnésio	Fisher Scientific	ICN1860454
Soro Fetal Bovino	Fisher Scientific	10-437-010
Metanol	Fisher Scientific	A454SK-4
Microscópio	científico glacial	Fisher AC295320010
Zeiss		Imager.Z2