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Artigo de método

Exame de fenótipos de acolhimento em

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DOI:

10.3791/55170

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22 de fevereiro de 2017

 ,  ,  , 
1Biological Sciences, Sam Houston State University, 2Irma Lerma Rangel College of Pharmacy, Texas A&M University Health Science Center

Neste artigo

Resumo

Este estudo envolve métodos para revelar efeitos sobre um modelo hospedeiro peixe seguintes alterações da pele e do intestino composição comunidades microbioma por um antibiótico.

Resumo

A semelhança do uso de antibióticos na medicina significa que a compreensão das consequências resultantes para o hospedeiro é vital. Os antibióticos geralmente diminuem a diversidade da comunidade do microbioma do hospedeiro e alteram a composição da comunidade microbiana. Muitas doenças, como enterocolite associada a antibióticos, doença inflamatória intestinal e distúrbios metabólicos, têm sido associadas a uma microbiota interrompida. A complexa interação entre hospedeiro, microbioma e antibióticos precisa de um modelo tratável para estudar as interações hospedeiro-microbioma. Nossos peixes vertebrados de água doce servem como um modelo útil para investigar os aspectos universais da estrutura e função do microbioma da mucosa, bem como analisar os efeitos consequentes do hospedeiro da alteração da comunidade microbiana. Os métodos incluem desafios do hospedeiro, como infecção por um patógeno de peixe conhecido, exposição a micróbios fecais ou do solo, estresse osmótico, toxicidade por nitrato, análise de crescimento e medição da motilidade intestinal. Essas técnicas demonstram um sistema modelo flexível e útil para determinação rápida de fenótipos de hospedeiros.

Introdução

Foi estabelecido que os antibióticos podem perturbar o microbioma humano levando a dysbiosis, o que significa um desequilíbrio comunidade microbiana. Alteração da composição da microbiota após tratamentos com antibióticos foi demonstrado para diminuir a diversidade da comunidade, reduzir os membros-chave, e alterar o metabolismo da comunidade, especialmente no intestino 1, 2. Perturbação antibiótico do microbioma intestinal pode reduzir a resistência à colonização a Clostridium difficile 3, 4 e 5 Salmonella.

Além disso, a interrupção da microbiota tem sido associada com o desenvolvimento de muitas doenças e síndromes em seres humanos (por exemplo, associada a antibióticos enterocolite, doença inflamatória do intestino, desordens metabólicas, etc.). Os antibióticos também são amplamente implementadas na agricultura como promotores de crescimento nagado e aves de produção 6. O uso dessas ferramentas poderosas não é sem efeitos colaterais, o que é evidente no rápido aumento da resistência aos antibióticos, bem como os efeitos de um microbioma interrompido tem com seu hospedeiro habitado. Muitos estudos têm mostrado que o amplo espectro da utilização de antibióticos tem longos consequências duradouras para a estrutura e função da microbiota, mas os efeitos colaterais de um microbioma impactando fisiologia acolhimento interrompido aos antibióticos são apenas especulações que ainda têm de ser suportados.

A interação entre hospedeiros, microbiota e antibióticos está longe de ser entendida de uma forma concisa. Portanto, um modelo simples e mais tratável é vantajoso para lançar luz sobre o sistema de mamíferos altamente complexa. superfícies mucosas em seres humanos, incluindo o intestino, abrigam a maior densidade e diversidade de micróbios, e também as interações entre microorganismos e acolhimento mais íntimos. O microbioma da pele da mucosa oferece peixes svantagens everal como um sistema modelo. O Teleostei (peixes ósseos) é uma das primeiras linhagens a divergir na acepção Vertebrados que teleósteos ter tanto inata e adquirida sistemas imunitários que co-evoluíram um relacionamento com comunidades bacterianas comensais 7. Partes de pele de peixe muitas características com as superfícies das mucosas um tipo de mamíferos, tais como as funções fisiológicas, componentes de imunidade, e arranjo de células produtoras de muco 8. A localização externa da superfície do peixe pele mucosa oferece um microbioma fácil de manipular experimentalmente e amostra.

O mosquitofish Ocidental, Gambusia affinis (G. affinis), é um modelo de peixe que tem sido utilizado no passado para o estudo de toxicologia de acoplamento e 9, 10, 11. Dado o pequeno tamanho, abundância população em estado selvagem como uma espécie invasora, m o custo de cuidados inimal e natureza resistente, temos desenvolvido G. affinis como um modelo microbioma mucosa. Além disso, Gambusia compartilhar a fisiologia de dar à luz filhotes vivos com mamíferos vivíparos, o que é raro em espécies de peixes. Nós completaram o estudo mais extenso no momento da pele de peixe microbiota normal usando 16S perfilar com Gambusia 12. Além disso trabalho demonstrou três efeitos negativos sobre o hospedeiro seguintes perturbações da pele e da flora intestinal através de um antibiótico de largo espectro 13.

Cinco efeitos diferentes foram examinados nos peixes após a exposição aos antibióticos. O benefício de acolhimento mais bem estabelecida do microbioma é a exclusão competitiva de patógenos. O patógeno peixes Edwardsiella ictaluri é conhecido por causar surtos de septicemia entérica em fazendas catfish comerciais 14. E. ictaluri também foi mostrado para infectar letalmente peixe-zebraclass = "xref"> 15, 16 e 17 Gambusia. Um desafio com este agente patogénico a partir da coluna de água pode servir como uma medida de exclusão. Como uma comparação para susceptibilidade a um patógeno indivíduo, sobrevivência durante a exposição a uma alta densidade de organismos mistos também foi efectuada. Fezes e solo orgânico-ricos foram usados ​​como fontes comumente encontradas de comunidades microbianas.

Outro papel estabelecido a comunidade intestino bacteriana executa é o processamento de nutrientes e energia colheita, afetando a absorção nutricional global para o anfitrião. Como uma medição bruta de alimentação, o peso do corpo dos peixes foi comparado antes e depois de um mês de ser alimentados com uma dieta padrão. Tratados com antibióticos de peixe como uma média perderam peso, enquanto peixes de controle, em média, ganho de peso ao longo do mês. O mecanismo para esta falta de ganho de peso não é clara. Um factor que contribui possível é o tempo de trânsito dos alimentos no intestino. A moti GIlidade método foi adaptado do peixe-zebra (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicação pessoal) para determinar o tempo de trânsito. Ainda não foi determinado se os peixes tratados com antibiótico tem um tempo de trânsito alterada.

Um desafio comum vivida no ambiente natural por todos os organismos, especialmente peixes, é o estresse osmótico. Gambusia foram mostrados para adaptar-se rapidamente quando agudamente sublinhado em altas concentrações de salinidade 18. Surpreendentemente, os peixes com um microbioma alterou a antibióticos exibiu reduzido sobrevivência a uma tensão elevada de sal. O mecanismo para este romance fenótipo está sob investigação. Outro esforço comum em animais aquáticos, especialmente em aquários, é formas tóxicas de azoto (amoníaco, nitrato e nitrito). Sobrevivência contra o nitrato não foi significativamente diferente entre os tratados com antibiótico e controle de peixe. Os métodos apresentados neste manuscrito pode ser usado com ou Gambusia modelo peixe semelhante organismos, tais como zebrapeixes e medaka, para medir fenótipos nos peixes após a manipulação experimental.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados sob a aprovação de protocolos IACUC, numeradas 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 e 14-04-17-1018-3-01.

1. Animal Collection, manuseio e cuidados éticos

  1. Recolha Gambusia affinis do local de campo (guia de identificação no http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) usando uma pequena rede de mergulho e coloque em 19 baldes L. Use inspeção visual para identificar as espécies.
  2. peixes descanso para 1-2 d em um balde com água da lagoa. Em seguida, transferir o peixe até 76 ou 189 tanques L aquário cheio de meia água da lagoa / metade água da torneira a 25 ° C, gaseificadas com uma pedra porosa borbulhante. Use uma pequena rede de mergulho durante o manuseamento de peixe como para perturbar minimamente o seu microbioma da pele.
    NOTA: densidade de peixes deve ser superior a 20 peixes / 38 L de água do aquário. Os peixes são aclimatados para o aquário por pelo menos 5 d antes de experimentação.
  3. Alimentar os peixes em um regime diário com 5 mg de ração por peixe. Hopeixes ld com um 12 h ciclo claro / escuro de 12 h.

2. A exposição a antibióticos inicial para todas as experiências

  1. Tiragem Todos os peixes de cada experimento do mesmo aquário, coloque em dois grupos separados (tratados: expostos a antibióticos e controle: não exposto) em 19 baldes L. Dados anteriores recolhidos mostram que o peixe no mesmo aquário têm homogeneizados microbiomes pele que têm pouca variação na composição da comunidade. 12
  2. Durante as experiências, manter os peixes em 2 L de lagoa artificial água (APW; 0,33 g / L de CaCl2, 0,33 g / L de MgSO4, 0,19 g / L de NaHCO3) que é esterilizada em autoclave antes do uso.
  3. Preparar a solução stock de antibiótico rifampicina por adição de 50 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (DMSO). A rifampicina é um antibiótico de largo espectro representativo que é não-tóxica para os peixes. Em humanos e ratos, distribui-se bem nos tecidos.
  4. A partir do estoque rifampicina administrar uma finalconcentração de 25 ug / mL em 2 L de APW para exposição aos antibióticos do grupo dos peixes tratados durante 3 dias. Note-se que após 3 d, pele cultivável números bacterianos retornar semelhante à da pele de peixe pré-tratado.
  5. Em paralelo, manter um grupo de peixe não tratado em APW e dar uma quantidade equivalente de DMSO (0,5 mL por cada L de APW) na coluna de água para actuar como um grupo de controlo.
  6. Como as experiências sejam destina-se a medir os efeitos de uma microbiota alterou-antibiótico em fenótipos de peixe, a fim de evitar efeitos directamente a partir do próprio antibiótico, após a exposição de três dias de antibiótico (ou de controlo) período, a transferência de peixe dentro de um balde com 2 L de APW fresco.
    1. Use um período de descanso de 10 horas para que o antibiótico é removido por os corpos dos peixes. Base de Dados desta vez eliminação em experimentos onde os peixes foram expostos a 25 mg / mL de antibiótico durante três dias. Euthanize o peixe cortando a medula espinhal seguido de mielotomia, homogeneizar em seguida o corpo inteiro usando um triturador de tecidos.
    2. Determinar a presença de antibióticos através da colocação de 50 ul desta suspensão, depois de filtração de 0,2 um para o centro de uma placa de petri de agar. Faça um buraco para esta suspensão pressionando uma cabeça para baixo estéril 200 mL ponta da pipeta na agar, que remove um pequeno plug.
    3. Utilizar placas de agar com 20 ml de volume medido de ágar nutriente, e espalhar uniformemente usando um cotonete de algodão com um organismo indicador, Bacillus subtilis, que é sensível à rifampicina. Obter o B. subtilis a partir de um ágar nutriente incubadas a 25 ° CO / N e utilizando a haste de algodão para se obter uma colónia. Observando-se uma zona de inibição após incubação durante a noite a 25 ° C, indica a presença de antibiótico nos tecidos de peixes.

3. Microbiome Extração

  1. Extrair uma amostra de pele a partir de microbioma epiderme mucosas exteriores, colocando o peixe dentro de um tubo estéril cónico de 15 mL cheio com 2 ml de PBST estéril (Na 137 mMCl, 10 mM de fosfato, 0,1% de Tween-20, pH 7,4) e solução de vórtex com uma definição de 10 durante 1 min, com incrementos de 10 s pausa. Detergente e sal no tampão promove a dispersão uniforme de bactérias em solução. Resultados comparáveis ​​foram encontrados com 0,85% de solução salina mas baixou contagens bacterianas com água pura.
  2. Transferir o peixe do tubo cónico para um balde de recuperação. A letalidade de extracção da pele é tipicamente menor do que 10%. Ou, analisar a suspensão bacteriana no tubo imediatamente após extracção ou sedimentar as bactérias por centrifugação a 2 minutos numa centrifugadora à temperatura ambiente a 15000 xg e armazenar a -80 ° C para análise futura.
    NOTA: Toda a cultura e análises bioquímicas são imediatos; ADN ou de extracção de proteína pode ser a partir de amostras congeladas.
  3. Para obter uma amostra do intestino microbioma, primeiro coloque o peixe em uma placa de Petri estéril. Euthanize o peixe, cortando a medula espinhal cervical diretamente atrás da cabeça com uma tesoura cirúrgica, seguido por mielotomia, E, em seguida, o corpo higienizar externamente com 70% de etanol toalhetes.
  4. Após a dissecção, remover todo o intestino por corte após o esôfago e antes do ânus.
  5. Cortar o intestino em seções pequenas 1 - 2 mm de comprimento e coloque todas as seções em duas mL de solução PBST em um tubo cônico. Após vortex durante 1 min, remover o sobrenadante para outro tubo limpo (tome cuidado para não chamar-se as secções do intestino).
    NOTA: O sobrenadante contém as bactérias do intestino extraídos que podem ser utilizados para análises directas ou granuladas pelo método anterior mencionados para amostras de pele.

4. Infecção preparação do modelo e banho de um patógeno específico

  1. Obter uma estirpe infecciosa de Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) e manter a cultura armazenada a -80 ° C. Strain 93-146 utilizados neste estudo, isolado a partir de um peixe-gato infectado, foi obtido de Mark Lawrence, Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Mississippi.
  2. streestoque ictaluri AK E. para um meio selectivo e diferenciais chamada E. ictaluri meios (MIE) de agar de 19 a cultura das bactérias e incubar durante 2 d a 27 ° C.
  3. Transferir uma colónia puro isolado a partir da cultura e inocular um frasco de 150 ml contendo 40 ml de caldo nutriente (NB; 5 g / L de peptona, 4 g / L de extracto de carne de vaca). Colocar o balão num agitador ajustado a 150 rpm durante 2 d a 27 ° C.
  4. Após a incubação, dilui-se uma amostra da cultura em PBST a um espectrómetro de leitura de 0,2 DO a 650 nm para calibrar E. cultura ictaluri para volumes de doses infecciosas desejados.
  5. Próxima transferência ambas tratadas (após 3 d da exposição a antibióticos) e grupos de peixes não tratados em copos plásticos contendo 130 mL de água doce da lagoa artificial, ou APW por aproximadamente 10 h para a eliminação da droga dos tecidos do peixe.
  6. Em seguida, de ambos os grupos, transferir novamente a cada peixe em copos de plástico de 8 onças contendo 130 mL de APW limpo.
  7. Dê a cada peixe uma dose letal contendo 2,8 x 10 6 UFC / mL de E. cultura ictaluri na APW (modelo de infecção banheira) e manter-se em um 27 ° C incubadora por 24 h.
  8. Após o banho ictaluri E., transferir peixe individualmente em novos copos com 130 mL de APW.
  9. Na sequência de reposição de água, ficha mortandade de peixes ao longo da duração de uma semana. Os peixes não são alimentados ao longo deste período. Em contraste com o peixe-gato, Gambusia não mostram sinais externos de infecção, portanto, é essencial utilizar letalidade como um ponto final experimental.

5. polimicrobiana Desafio com fezes e solo

  1. Tratamento fezes
    1. Obter fezes humanas frescas de um assunto voluntários saudáveis ​​que não receberam antibióticos nas duas semanas anteriores, usando luvas estéreis e um tubo cônico estéril 50 mL.
    2. Após a coleta, recolher a matéria fecal em um saco plástico estéril e, em seguida, transferir para um estéril 15 mL ctubo onical. Criar uma concentração da suspensão por fezes em PBST para se obter uma solução de estoque de 500-800 mg / mL. Esta mistura espessa é melhor para transferir com um 1 ml ou maior ponta de pipeta de plástico que tenha sido cortada na parte inferior com uma tesoura esterilizada de modo a que a abertura é maior.
    3. Após a exposição inicial de antibióticos de grupos de peixes tratados e não tratados controle, separam-se em copos de plástico individuais contendo suspensão fecal em concentrações finais de qualquer de 15 mg / mL ou 10 mg / mL em APW com um volume total de 130 mL. Segurar copos numa incubadora a 25 ° C.
    4. mortandade de peixes registro durante a exposição fecal pela observação atenta sobre 2 d.
  2. O tratamento do solo
    1. Recolha 1 - 2 kg de rico solo orgânico (deve conter a maior densidade e diversidade de micróbios) aproximadamente 7 - 15 centímetros para baixo em profundidade e coloque em um recipiente de plástico limpo. Note-se que o solo deve ser utilizado no prazo de dois dias após a colheita.
    2. terrívelctly após o período de exposição inicial, separar ambos os grupos de antibiótico tratado e não tratado de peixes em copos de plástico individuais contendo 18,2 g de solo em 130 mL de APW. Misturar o solo no poço de água à mão antes de adicionar o peixe. A maioria das partículas não suspender e ficar no fundo do copo.
    3. Expor peixe para uma duração de 3 d a 25 ° C e registar qualquer mortalidade.

6. Desafio estresse osmótico

  1. Após o tratamento, seguido de um período de repouso de 10 h, como descrito acima, individualizar peixes em copos separados contendo NaCl a 17,5 mg / mL (300 mM) em 150 mL de APW. Isto é metade da salinidade da água do mar normal, o que não é completamente letal (<50%) para controlar peixes, mas é fortemente estressante, exigindo osmoregulação eficaz.
  2. Observar o desenvolvimento de mortandade de peixes ao longo de um período de 36 h.

7. Nitrate Toxicidade Desafio

  1. peixes descanso por um período de 10 h após expos antibióticosUre, peixes e, em seguida, separado em copos individuais contendo uma concentração de nitrato de sódio 10 mg / ml (118 mM) ou 17,5 mg / ml (206 mM) em 130 mL de APW.
  2. Recorde de mortalidade durante 4 d para a dose baixa e 1 d para a dose alta.

8. Análise de crescimento dos peixes individualizada ou agrupada

  1. exposição a antibióticos ou controle período de 3 d completa como grupos em baldes.
  2. Para individual, preencher 8-oz copos de isopor com 150 mL APW cada, transferir uma peixes individuais no copo e registe o peso total do corpo para a avaliação inicial.
    1. Repita o procedimento para todos os peixes em ambos os grupos tratados e não tratados. Use copos de isopor branco em vez de copos de plástico transparente porque o peixe não vai comer quando nos copos claros.
  3. Alimentar os peixes diariamente com a dieta padrão de duas pelotas por peixes. Os sedimentos foram usadas em vez de flocos, devido aos projéteis têm baixa variação na massa individual (3,53 ± 0,42 mg cada um, ou variação de 8%), resulting em peixes recebendo quantidades similares de alimentos. Monitorar o consumo gravando visualmente pelotas não consumidos. As taxas de consumo eram tipicamente acima de 80%.
  4. No final de cada semana, durante 4 semanas, determinar o peso do peixe. Prepare um novo copo com APW fresco, coloque em um equilíbrio, e, em seguida, registrar o peso. Em seguida, verter um peixe em uma rede de mergulho do copo original e transferir para a nova taça, que é então pesado novamente. Os peixes não são tratadas para evitar o estresse.
  5. Para grupos, coloque 2 litros de APW em um 19 L balde e rasgou a escala. Manter os peixes juntos em ambos os grupos durante a transferência para novos baldes APW, em seguida, gravar o peso total do grupo. Registro do peso do grupo de peixe a cada semana mais de um mês período de tempo, transferindo para um novo balde.

9. Gut Transit Time

  1. Use 70 kDa aniónico dextrano marcado com fluoresceína. O dextrano não é significativamente digerido, e é muito grande para ser absorvida através da camada do intestino, assim, a passagem irá medir o tempo de trânsito através do intestino.dextrano marcado foi incorporado em alimentos para peixes.
  2. Para um tubo de 1,7 ml estéril, adicionar 360 mL de água desionizada estéril e 52 mg de gelatina (solução a 13%), e colocar o tubo num bloco de calor a 60 ° C até derreter gelatina e é totalmente dissolvido.
    1. Moagem flocos de peixe do alimento até um pó fino usando um almofariz e pilão, e adicionar 40 mg deste pó ao tubo, em conjunto com 20 uL de óleo de peixe. Depois de misturar, adicionar 1,6 mg de FITC-dextrano.
  3. Distribua a mistura de líquido quente em 20 mL cai sobre Parafilm na bancada do laboratório, e deixá-los esfriar rapidamente e solidificar. Drops pode ser armazenado por até 4 d antes que se tornem muito difícil para os peixes para comer. Loja gotas no frigorífico, colocando o Parafilm para metade de uma placa de Petri, que é então lançada sobre água esterilizada dentro de um recipiente de plástico fechado, o que mantém as gotas umidificadas.
  4. Pouco antes de alimentação, trimestre cai em seções usando uma lâmina de barbear. Aclimatar o peixe para o Styrocopos de espuma individualmente por 2 dias sem alimentação (Nota: foram utilizados apenas os peixes de controlo não exposto). Coloque quatro trimestres de a comida no copo com o peixe, e observar o peixe por 30 minutos por quantos pedaços de comida que cada um comer.
  5. Para começar o período de monitoramento, a transferência de peixe individualmente em copos com 80 ml de APW, utilizando uma rede de mergulho. A cada 2 h, rode suavemente o APW à mão, e em seguida, tomar uma amostra de 1 mL e armazenar em um 1,7 tubo rotulado mL a 4 ° C. Colher amostras para 36 h.
  6. fluorescência da ficha, com um espectrofotómetro de fluorescência, de todas as amostras, ao mesmo tempo após a conclusão do ensaio. Coloque toda a amostra 1 mL numa cuvete e gravar a fluorescência medida com excitação a 495 nm e emissão a 520 nm.

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Resultados

Um diagrama esquemático geral do sistema experimental utilizado para estudar os efeitos da exposição do hospedeiro peixe antibiótico 13 está representada na Figura 1A e inclui a técnica para a extracção da pele (Figura 1B) e intestino (Figura 1C) microbiomas do peixe. Três dias foi seleccionado como o período de exposição aos antibióticos porque dados anteriores revela que, enquanto o número total de pele cultiváv...

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Discussão

Alguns desafios requerem um período de descanso na APW limpo após o tratamento antibiótico para a droga para ser empobrecido em tecidos de peixes. Se o período de descanso é ignorado, então a presença de antibióticos podem confundir os resultados, especialmente quando o ensaio envolve a exposição a bactérias. A fim de examinar os efeitos de uma composição microbioma alterada sem grandes alterações no número total de micróbios no host, experimentos preliminares monitorização da composição da microbiota (16S perfis ou seq...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi parcialmente financiado por um prêmio FAST (Faculty and Student Team) para TPP e JMC do EURECA (Centro para Aprimorar Experiências de Pesquisa de Graduação e Atividades Criativas) da Sam Houston State University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RifampicinaCalbiochem557303-1GM
Nitrato de SódioSigma AldrichS5506
Marcado com fluoresceína 70 kDa dextrano aniônicoThermoFisher ScientificD1823
Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS) Os comprimidosde Calbiochem6500-OPdissolvem-se em água para fazer PBS

Referências

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Reimpressões e permissões

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