Summary
Deze studie omvat werkwijzen effecten op een modelvis gastheer na verandering van de huid en darmen microbiome gemeenschappen compositie van een antibioticum onthullen.
Introduction
Er is vastgesteld dat antibiotica het menselijk microbiome leidt tot dysbiosis kunnen verstoren, wat betekent dat een microbiële gemeenschap onbalans. Compositionele veranderingen microbiota na antibiotica is aangetoond dat de diversiteit van de gemeenschap te verlagen, verlagen belangrijke leden, en veranderen door metabolisme, met name in de darm 1, 2. Antibioticum verstoring van de darm microbiome kan kolonisatieweerstand verminderen Clostridium difficile 3, 4 en 5 Salmonella.
Daarnaast is de verstoring van de microbiota in verband gebracht met de ontwikkeling van vele syndromen en ziekten bij mensen (bijvoorbeeld met antibiotica geassocieerde enterocolitis, ontstekingsdarmziekte, stofwisselingsziekten, enz.). Antibiotica worden ook op grote schaal toegepast in de landbouw als groeibevorderaar invee en pluimvee productie 6. Het gebruik van deze krachtige instrumenten niet zonder neveneffecten, die blijkt uit de snelle opkomst van antibioticaresistentie, evenals de effecten van een verstoorde microbiome heeft met bewoonde gastheer. Vele studies hebben aangetoond dat breed-spectrum antibiotica heeft langdurige gevolgen voor de structuur en functie van de microbiota, maar de bijwerkingen van een antibioticum verstoord microbiome invloed ontvangende fysiologie alleen beschouwingen die nog moeten worden ondersteund.
Het samenspel tussen de gastheer, microbiota, en antibiotica is nog lang niet begrepen in een bondige wijze. Een eenvoudig en soepel model voordelig om licht te werpen op de zeer complexe zoogdiersysteem. Mucosale oppervlakken bij mensen, zoals de darm, haven de hoogste dichtheid en diversiteit van microben, en ook de meest intieme microbe-gastheer interacties. De mucosale huid microbiome vis aanbiedingen several voordelen als een modelsysteem. De Teleostei (beenvissen) is één van de eerste lijnen divergeren in de zin dat teleosten vertebraten zowel aangeboren en verworven immuunsystemen die samen geëvolueerd relatie commensale bacteriële 7. Vissenhuid deelt vele eigenschappen met type 1 mucosale oppervlakken van zoogdieren, zoals fysiologische functies, immuniteit componenten en een opstelling van slijm producerende cellen 8. De externe locatie van de vis huid slijmvliesoppervlak biedt een microbiome makkelijk te manipuleren en experimenteel monster.
De Westerse mosquitofish, Gambusia affinis (G. affinis), is een model vis die is gebruikt in het verleden voor het bestuderen van de paring en toxicologie 9, 10, 11. Gezien de geringe omvang, de bevolking overvloed in het wild als een invasieve soort, m inimal zorg kosten en winterharde de natuur, hebben we G. Affinis ontwikkeld als een mucosale microbiome model. Verder Gambusia delen de fysiologie van de bevalling jong met levendbarende zoogdieren, dat is ongewoon in vissoorten te leven. We voltooiden de meest uitgebreide studie op het moment van vissenhuid normale microbiota met behulp van 16S profileren met Gambusia 12. Verdere werkzaamheden aangetoond drie negatieve effecten op de host na verstoring van de huid en de darmflora met behulp van een breed-spectrum antibioticum 13.
Vijf verschillende effecten werden in de vis volgende antibiotica blootstelling onderzocht. De meest gevestigde gastheer voordeel van de microbiome concurrerend uitsluiting van pathogenen. De vis ziekteverwekker Edwardsiella ictaluri is bekend dat uitbraken van enterische bloedvergiftiging veroorzaken commerciële meerval landbouwbedrijven 14. E. ictaluri is ook aangetoond dat dodelijk infecteren zebravisclass = "xref"> 15, 16 en 17 Gambusia. Een probleem met dit pathogeen uit de waterkolom kan dienen als een maat voor uitsluiting. Als vergelijking gevoeligheid voor individuele pathogeen, werd overleving bij blootstelling aan een hoge dichtheid van gemengde organismen ook uitgevoerd. Uitwerpselen en organisch-rijke bodem werden gebruikt als veelvoorkomende bronnen van microbiële gemeenschappen.
Een andere gevestigde rol van de bacteriële darm gemeenschap voert is voedingsstoffen verwerken en energie oogsten, hetgeen van invloed van de algemene nutritionele opname voor de gastheer. Als een grove meting van de voeding, werd vis lichaamsgewicht vergeleken vóór en na een maand van te worden gevoed met een standaard dieet. Antibiotica behandeld vis als een gemiddelde verloren gewicht, terwijl de controle vis gemiddeld gewicht gekregen over de maand. Het mechanisme voor dit gebrek aan gewichtstoename onduidelijk. Een mogelijke factor is transittijd van voedsel in de darm. Een GI motiliteit methode werd aangepast van de zebravis (Adam Rich, SUNY Brockport, persoonlijke communicatie) om de doorvoer te bepalen. Het is nog niet vastgesteld of antibiotica behandeld vissen hebben een veranderde transittijd.
Een gemeenschappelijke uitdaging in de natuurlijke omgeving ervaren door alle organismen, met name vissen, is osmotische stress. Gambusia bleken zich snel aanpassen aan acuut benadrukt in hoge concentraties zoutgehalte 18. Verrassend, vissen met een antibioticum veranderd microbiome tentoongesteld verlaagd overleven op een hoog zout stress. Het mechanisme voor dit nieuwe fenotype wordt onderzocht. Een andere veel voorkomende op aquatische dieren, met name in aquaria, is giftig vormen van stikstof (ammoniak, nitraat en nitriet). Survival nitraat was niet significant verschillend tussen antibiotica behandelde en controle vis. De in dit manuscript werkwijzen kunnen worden gebruikt met Gambusia of soortgelijke vis modelorganismen, zoals zebravis en medaka, om fenotypen in de vis volgende experimentele manipulatie te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van IACUC protocollen, genummerd 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 en 14-04-17-1018-3-01.
1. Dierlijke Collection, Handling, en ethische zorg
- Verzamel Gambusia affinis uit het veld website (identificatie gids op http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) met behulp van een kleine dip net en plaats in een 19 L emmers. Gebruik visuele inspectie om soorten te identificeren.
- Rest vis voor 1-2 d in een emmer met vijverwater. Daarna overdracht vis in 76 of 189 L aquarium tanks gevuld met een half vijverwater / half kraanwater bij 25 ° C, belucht met een borrelende luchtsteentje. Gebruik een kleine dip net bij het omgaan met vis als om hun huid microbiome minimaal verstoren.
LET OP: Fish dichtheid mag niet hoger zijn dan 20 vis / 38 L aquariumwater zijn. Vissen worden gewend aan het aquarium minstens 5 d voor experimenten. - Voeden vis op een dagelijkse regime met 5 mg vlok voedsel per vis. Hold vis met een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus.
2. De eerste antibiotica blootstelling voor alle experimenten
- Tekenen van alle vis uit elk experiment uit hetzelfde aquarium, te plaatsen in twee aparte groepen (behandeld: blootgesteld aan antibiotica & control: onbelichte) in 19 L emmers. Vorige verzamelde gegevens blijkt dat vissen in dezelfde aquarium huid microbiomes dat er weinig variatie in de gemeenschap samenstelling hebben gehomogeniseerd. 12
- Tijdens experimenten, blijven vissen in 2 L van kunstmatige vijver water (APW; 0,33 g / l CaCl2, 0,33 g / l MgSO4, 0,19 g / l NaHCO3), die wordt gesteriliseerd in een autoclaaf voor gebruik.
- Bereid de rifampicine antibioticavoorraadoplossingen door toevoeging van 50 mg / ml in dimethylsulfoxide (DMSO). Rifampicine is een representatief breed-spectrum antibioticum dat niet giftig voor de vissen. Bij mensen en muizen, verdeelt en in de weefsels.
- Vanuit de rifampicine voorraad te beheren een definitiefconcentratie van 25 ug / ml in 2 L van APW antibiotische blootstelling van de behandelde vis groep 3 dagen. Merk op dat na 3 d, huid kweekbare bacteriën M weer gelijk aan die van voorbehandelde vissenhuid.
- Tegelijkertijd houden van onbehandelde vis in APW en geven een equivalente hoeveelheid DMSO (0,5 ml per liter APW) in de waterkolom te treden als een controlegroep.
- Zoals experimenten beogen effecten van een antibioticum veranderd microbiome vis fenotypes te meten, om de effecten direct van het antibioticum zelf voorkomen na de driedaagse antibioticum blootstelling (controle) periode overdracht vis in een emmer met 2 L van verse APW.
- Gebruik een 10 uur rusttijd zodat het antibioticum wordt verwijderd door de organen van de vis. Baseren eliminatietijd experimenten waarin vissen werden blootgesteld aan 25 ug / ml antibioticum gedurende drie dagen. Euthanaseren de vis door te knippen het ruggenmerg, gevolgd door pithing, dan homogeniseren het hele lichaam met behulp van een tissue slijpmachine.
- Bepaal antibiotische aanwezigheid door het plaatsen van 50 ul van deze suspensie na 0,2 urn filter in het midden van de agar petrischaal. Maak een gat voor deze schorsing door het indrukken van een omgekeerde steriele 200 pi pipet tip in de agar, die een kleine stekker verwijdert.
- Gebruik agarplaten met 20 ml afgemeten hoeveelheid van nutriënt agar en gelijkmatig met een wattenstaafje met een indicator organisme, Bacillus subtilis, die gevoelig is voor rifampicine. Haal de B. subtilis uit een nutriënt agar geïncubeerd bij 25 ° CO / N en met het wattenstaafje een kolonie te verkrijgen. Waarnemen van een zone van remming na overnacht incubatie bij 25 ° C geeft de aanwezigheid van antibioticum in het visvlees.
3. Microbiome Extraction
- Extract huid microbiome monster van het buitenste mucosale epidermis door het plaatsen van de vis in een steriele 15 ml conische buis gevuld met 2 ml steriele PBST (137 mM NaCl, 10 mM fosfaat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) oplossing en vortexen bij een instelling van 10 gedurende 1 min 10 s in stappen pauzeren. Wasmiddel en zout in de buffer zorgt voor een gelijkmatige verspreiding van bacteriën in oplossing. Vergelijkbare resultaten werden gevonden met 0,85% zoutoplossing, maar verlaagde bacteriële telt met zuiver water.
- Breng de vis uit de conische buis op een herstel emmer. Dodelijkheid van de huid extractie is meestal lager dan 10%. Ofwel, analyseren de bacteriesuspensie in de buis onmiddellijk na extractie of pellet de bacteriën door 2 min centrifugeren in een centrifuge bij kamertemperatuur bij 15.000 xg en bewaar bij -80 ° C voor latere analyse.
Let op: alle cultuur en biochemische analyses zijn onmiddellijke; DNA of eiwit-extractie kan uit bevroren monsters. - Om een gut microbiome monster te verkrijgen, eerst de vis te plaatsen in een steriele petrischaal. Euthanaseren de vis door het doorsnijden van de cervicale ruggenmerg direct achter het hoofd met chirurgische schaar, gevolgd door pithingEn vervolgens extern ontsmetten het lichaam met 70% ethanol doekjes.
- Na dissectie, verwijder de hele darm door te snijden na de slokdarm en voor de anus.
- Snij de darm in kleine secties 1-2 mm in de lengte en plaats alle lagen in twee ml PBST oplossing in een conische buis. Na vortexen gedurende 1 min, verwijder supernatant in een andere schone buis (neem voorzichtig om niet het opstellen van de darm secties).
Opmerking: Het supernatant bevat geëxtraheerd darmbacteriën die ofwel kunnen worden gebruikt voor directe analyse of gepelleteerd door De genoemde huidmonsters vorige methode.
4. Besmetting Model Voorbereiding en Bath van een specifiek Pathogeen
- Het verkrijgen van een besmettelijke stam van Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) en hou de cultuur bewaard bij -80 ° C. Strain 93-146 gebruikt in deze studie, geïsoleerd van een besmette meerval, werd verkregen van Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University.
- Streak E. ictaluri voorraad op een selectieve en differentiële media genoemd E. ictaluri media (EIM) agar 19 tot en cultuur van de bacteriën en incubeer gedurende 2 dagen bij 27 ° C.
- Transfer zuivere geïsoleerde kolonie van de kweek en enten een 150 ml kolf die 40 ml voedingsbodem (NB; 5 g / l pepton, 4 g / l vleesextract). Cuvette in een schudapparaat ingesteld op 150 rpm gedurende 2 dagen bij 27 ° C.
- Na incubatie, verdun een monster van de cultuur in PBST een spectrometer lezing van 0,2 OD bij 650 nm E. ictaluri cultuur kalibreren gewenste infectieuze dosis volumes.
- Volgende overdracht zowel behandeld (na 3 d van antibiotica blootstelling) en onbehandelde vis groepen in afzonderlijke plastic bekers met daarin 130 ml vers kunstmatige vijver water of APW gedurende ongeveer 10 uur voor de goedkeuring van geneesmiddelen uit vis weefsels.
- Dan wordt uit beide groepen, de overdracht weer elke vis in 8-ounce plastic bekers met daarin 130 ml schoon APW. Geef elke vis een dodelijke dosis met 2,8 x 10 6 CFU / ml E. ictaluri cultuur in de APW (bad infectie model) en bewaar in een 27 ° C incubator gedurende 24 uur.
- Na de E. ictaluri bad, breng vis afzonderlijk in nieuwe cups met 130 ml van APW.
- Naar aanleiding van water vervangen, opnemen vissterfte over de duur van een week. Vissen worden niet gevoerd over deze periode. In tegenstelling meerval, Gambusia vertonen geen uiterlijke tekenen van infectie, daarom is het essentieel om letaliteit als experimentele eindpunt.
5. polymicrobiologische Challenge met Uitwerpselen & Soil
- uitwerpselen Treatment
- Verkrijgen verse menselijke feces van een gezonde vrijwilliger patiënt die geen antibiotica heeft gekregen in de voorgaande twee weken, met steriele handschoenen en een steriele 50 ml conische buis.
- Bij het verzamelen, het verzamelen van fecale materie in een steriele plastic zak en vervolgens over in een steriele 15 ml conical buis. Maak een voorraad concentratie van schorsing van uitwerpselen in PBST om een voorraad oplossing van 500 te geven - 800 mg / ml. Deze dikke mengsel best overbrengen met een 1 ml of grotere plastic pipetpunt die onderaan stuurde met steriele scharen zodat de opening groter.
- Na de initiële antibiotische blootstelling van behandelde en onbehandelde groepen vis, scheiden in afzonderlijke plastic cups fecale suspensie in eindconcentraties van hetzij 15 mg / ml of 10 mg / ml in APW met een totaal volume van 130 ml. Houd bekers in een incubator bij 25 ° C.
- Record vissterfte tijdens fecal blootstelling door nauwe observatie over 2 d.
- Soil Treatment
- Verzamel 1-2 kg van de rijke organische bovengrond (moet de hoogste dichtheid en diversiteit van microben bevatten) ongeveer 7-15 cm in de diepte en plaats in een schone plastic container. Merk op dat de bodem moet worden gebruikt binnen twee dagen na de verzameling.
- verschrikkelijkctly na de eerste periode de blootstelling, scheiden beide groepen antibiotica behandelde en onbehandelde vis in individuele plastic bekertjes met 18,2 g van de bodem in 130 ml van APW. Meng de bodem in het water goed met de hand voor het toevoegen van de vis. De meeste van de deeltjes niet schorten en verblijf in de bodem van de beker.
- Expose vis voor een duur van 3 dagen bij 25 ° C en sterfte opnemen.
6. osmotische stress Challenge
- Na behandeling gevolgd door een 10 h rusttijd zoals hierboven beschreven, individualiseren vis in aparte bekers bevattende NaCI bij 17,5 mg / ml (300 mmol) in 150 ml APW. Dit is de helft van de gemiddelde zoutgehalte van zeewater, strookt niet altijd dodelijk (<50%) voor vis controleren, maar sterk belastend, dat effectieve osmoregulatie.
- Let op voor vissterfte over een duur van 36 uur.
7. Nitraat toxiciteit Challenge
- Rest vis voor een 10 uur periode na antibiotica expoure, en vervolgens gescheiden in afzonderlijke vis cups natriumnitraat een concentratie van hetzij 10 mg / ml (118 mM) of 17,5 mg / ml (206 mmol) in 130 ml APW.
- Record voor sterfte meer dan 4 d voor lage dosis en 1 d voor een hoge dosis.
8. De groei analyse van geïndividualiseerd of gegroepeerde Fish
- Volledige blootstelling antibioticum of controleperiode 3 d als groepen in emmers.
- Voor Individuele, vul 8-oz piepschuim cups met 150 ml APW elk, dragen een afzonderlijke vis in de beker en neem het totale lichaamsgewicht voor de eerste beoordeling.
- Herhaal dit voor alle vissen in zowel behandelde en onbehandelde groepen. Gebruik witte Styrofoam kopjes in plaats van heldere plastic bekers, omdat vis niet te eten wanneer in het heldere cups.
- Voeden vis per dag bij de standaard dieet van twee pellets per vis. Pellets werden gebruikt in plaats van vlokken, omdat pellets hebben lage variantie in individuele massa (3,53 ± 0,42 mg per stuk, of 8% variatie), resulting in vis ontvangen van soortgelijke hoeveelheden voedsel. Monitor consumptie door visueel opnemen van niet opgegeten pellets. Consumptie prijzen waren meestal boven de 80%.
- Aan het einde van elke week gedurende 4 weken, bepaald gewicht vis. Bereid een nieuwe cup met verse APW, te plaatsen op een evenwicht, en vervolgens opnemen van het gewicht. Dan, giet er een vis in een dip net uit de originele beker en de overdracht naar de nieuwe beker, die vervolgens weer wordt gewogen. Vissen worden niet behandeld om stress te vermijden.
- Voor groepen, plaatsen 2 L van APW in een 19 L emmer en tarra de schaal. Houd vissen samen in beide groepen bij het overbrengen naar nieuwe APW emmers vervolgens opnemen totaalgewicht groep. Record vis groep gewicht elke week meer dan een maand tijdspanne door de overdracht naar een nieuwe emmer.
9. Gut Transit Time
- Gebruik fluoresceïne-gelabelde 70 kDa anionische dextran. Dextraan is geen significant verteerd en te groot om te worden geabsorbeerd in de darmen laag, waardoor passage doorgangstijd door de darm te meten.Gelabeld dextran werd opgenomen in visvoer.
- In een steriele 1,7 mL buis, voeg 360 ul steriel gedeïoniseerd water en 52 mg gelatine (13% oplossing) en plaats de buis op een 60 ° C warmteblok totdat de smelt en gelatine volledig is opgelost.
- Grind goud vis eten flakes tot een fijn poeder met een mortier en stamper en voeg 40 mg van dit poeder aan de buis, samen met 20 ul van visolie. Na mengen wordt met 1,6 mg FITC-dextran.
- Verdeel de hete vloeistof mengsel in 20 pl druppels op Parafilm op de labtafel en laat ze snel afkoelen en stollen. Druppels kunnen worden bewaard tot 4 d voordat ze te moeilijk voor vis te eten geworden. WINKEL druppels in de koelkast Door de Parafilm op helft van een petrischaal, dat vervolgens wordt geïntroduceerd op steriel water in een afgesloten kunststof, de druppels bevochtigd houdt.
- Net voor het voeden, druppels kwartaal in secties met behulp van een scheermesje. Acclimatiseren de vis aan de Styrofoam cups afzonderlijk voor 2 dagen zonder voeden (Let op: alleen onbelichte controle vissen werden gebruikt). Plaats vier kwartalen van het voedsel in de beker met de vis, en let op de vis voor 30 minuten voor hoeveel stuks van het voedsel dat ze elk eten.
- Om de controleperiode begint, over te dragen vis afzonderlijk in kopjes met 80 ml van APW met behulp van een dip net. Elke 2 uur zachtjes wervelen de APW met de hand, en neem dan een 1 ml monster en op te slaan in een gelabelde 1,7 ml buis bij 4 ° C. Monsters te nemen voor 36 uur.
- Fluorescentie plaat, met een fluorescentie spectrofotometer, van alle monsters tegelijkertijd na voltooiing van de test. Plaats het gehele 1 ml monster in een cuvet en de fluorescentie gemeten met excitatie bij 495 nm en emissie bij 520 nm op te nemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een algemeen schema van het experimentele systeem om vis ontvangende effecten van antibiotica blootstelling 13 studie is weergegeven in figuur 1A en omvat de techniek voor het extraheren van de huid (Figuur 1B) en dierlijke (figuur 1C) microbiomes uit de vis. Drie dagen werd geselecteerd als het antibioticum periode van blootstelling omdat eerdere gegevens blijkt dat, terwijl de totale huid kweekbare aantal in het begin van de behandeling daalt, is het teruggekeerd naar het niveau van voor de behandeling na 3 d. Intussen is de gemeenschapssamenstelling, zoals bepaald door 16S profilering, is sterk veranderd. Daarom moet de periode van 3 dagen optimaal voor het analyseren van de effecten van een veranderd door ongeveer dezelfde dichtheid. Merk op dat cultuuranalyse, middels kolonie aantallen op agarplaten, kunnen weglaten van een aantal soorten. Efficiëntie van de huid microbiome dispersie methode (Figuur 1B 10 april - 10 mei CFU / g vis gewicht) aan kolonieaantal van verschillende vissen aan dezelfde suspensie procedure nogmaals (alle resterende kwantificeren bacteriën). Tellingen van deze tweede schorsing waren lager dan 100 CFU / g, wat suggereert dat de schorsing methode effectief is (niet gepubliceerd).
Vissen met een antibioticum-gewijzigde microbiome vatbaarder voor een infectie dan E. ictaluri controlevissen (figuur 2) zijn. Het verschil in gemiddelde tijd tot overlijden van 56,1 ± 15 uur voor de behandelde groep en 98,5 ± 48 uur voor controlevissen was niet statistisch significant (tweezijdig t-toets, p = 0,12). Dit is waarschijnlijk te wijten aan de kleine groepsgrootte (behandeld n = 6, controle n = 5). Groepsgrootte van ten minste een dozijn worden daarom aanbevolen. Een voordeel van deze infectie model is de bath protocol, dat geen naalden voor infectie of het bijhouden van de voedselinname vereist. E. ictaluri valt natuurlijk meerval uit de waterkolom. Veiligheid staat hoog omdat E. ictaluri is temperatuurgevoelig en dus slecht besmettelijk voor de mens. Andere studies hebben aangetoond dat de tijd tot overlijden in G. affinis correleert met de initiële dosis bacteriën. De incubatietemperatuur van 27 ° C werd geselecteerd als optimaal voor zowel bacteriën en vis.
Behandeld of controle vis leverde geen significante verschillen in overleving in het water verontreinigd met hoge tellingen van gemengde microben hebben. Geen mortaliteit werd waargenomen gedurende 4 dagen voor de controle (n = 8) of behandeld (n = 9) vis wanneer de bodem werd gebruikt als microbiële bron. Terwijl sommige mortaliteit voorkwamen met menselijke faeces als bron van microben (tabel 1), antibiotica maakte geen verschil. Wanneer de concentratie van ontlasting in APW was 20 mg / ml, 40 - 50%van de vis stierf. Echter, de concentratie van opgeloste zuurstof was slechts 10% (in vergelijking met> 80% in emmers of aquaria), waardoor de hypoxische omstandigheden overtuigde de interpretatie. Bij lagere 16 of 10 mg / ml werden gebruikt, werden de overlevingskansen afgestemd (tweezijdige Fisher's exact test, p = 0,95 of groter is voor een verschil tussen groepen). Opgeloste zuurstofgehalte in deze twee studies waren 65% of hoger. Gambusia zijn een zeer winterharde invasieve soorten die in een lage kwaliteit van het water kan leven. Het zou interessant zijn om deze assays van de natuurlijke microbiële blootstelling gebruiken om het voortbestaan van andere soorten te meten met een uitdaging van besmet water. Watermonsters uit specifieke milieu plaatsen, met name onderworpen aan eutrofiëring, kunnen worden gebruikt in dezelfde assay, maar waterkwaliteit (opgelost O 2, nitraat, zoutgehalte, enz.) Zouden moeten worden bepaald, als een potentieel verwarrende factor.
Fish eXposed tegen rifampicine waren gevoeliger voor osmotische stress dan controlevissen (figuur 3). De log-rank test waargenomen een significant verschil (p = 0,049) in het overlevingspercentage (43% sterfte in de controlegroep en 88% dood in behandelde groep, n = 9 voor beide groepen) bij provocatie met verhoogde zoutgehalte. De resultaten van deze test was het met een bepaling van 18,1 mg / ml als de LC 50 voor NaCl met G. affinis na 24 uur in zoet water 20. Tekenen van zout stress die vis exposeren omvatten roodheid rond de kieuwen en verminderde zwemmen beweging. Met deze assay, zoutgehalte niveaus boven 18 mg / ml resulteerde in een snelle vissterfte.
Bij blootstelling aan het toxine nitraat in de waterkolom, heeft pre-blootstelling aan antibioticum laat overleving (tabel 2). Voor elke proef, werd dood opgenomen met zowel een korte als lange tijd punt, wat neerkomt op acute en chronische effecten. de concentratievan 10 mg / mL werd gekozen op basis van het feit dat de LD 50 voor G. affinis in zoet water in 48 uur 21. Resultaten van deze test waren in overeenstemming met deze LD 50 waarde, waarbij een 50% letaliteit in zowel behandelde en controlegroepen na 90 uur. Een grotere uitdaging nitraat (17,5 mg / ml) werd onderzocht, wat leidt tot een snellere dood. Opnieuw was er geen verschil in behandelingsgroepen. Nitriet aanzienlijk toxischer dan nitraat G. affinis met een LD 50 van 0,0015 mg / ml op 48 uur 22. Door biochemische analyse met behulp van Analytical Profile Index systeem (niet gepubliceerd) blijkt dat de vissenhuid microbiota heeft het potentieel om nitraat te reduceren. Echter, nitriet niveaus in de APW tijdens beide studies beneden de detectiegrens (0,001 mg / ml). Deze uitdaging methode kan worden gebruikt met elke kleine oplosbare chemicaliën.
Toen geïndividualiseerd in cups en fed thij evenveel elke vis voor een maand, een trend werd waargenomen voor de met antibiotica behandelde vis gewicht en controlevissen niet krijgen, zonder statistisch significant verschil (gegevens niet getoond). Om de stress van individualisering te vermijden, werden vissen samen gehuisvest als een groep voor behandelde en onbehandelde vis in emmers voor een maand en gezien paste hoeveelheden voedsel. De beperking van deze opstelling is dat vis niet kan worden ontvangen hetzelfde voedsel op individuele basis. Echter, in de groep model, behandeld vis op gemiddeld verloren gewicht en controle vis gemiddeld opgedaan gewicht (tabel 3). De hoeveelheid voedsel die de vissen werden in beslag lijkt niet te worden beïnvloed door eerdere antibiotica blootstelling, dus onderdrukking van de eetlust is een onwaarschijnlijke kandidaat verklaring voor het ontbreken van gewichtstoename. Talrijke andere factoren kunnen bijdragen, waaronder veranderingen in ontsteking in de darm, niveaus van slijmproductie, darm permeabiliteit en / of darmmotiliteit. Een groot voordeel van deze test te meten Voedingssubstraatonal effecten is de eenvoud. Het is goedkoop en vereist slechts een laboratoriumweegschaal als instrumentatie. Het is geschikt voor het screenen op een effect, waardoor andere betrokken experimenten te bepalen mechanisme.
Een voorbeeld factor gerelateerd aan vis gewichtstoename worden onderzocht voedsel reistijd, die gerelateerd is aan motiliteit darm. -FITC gelabelde dextran kan in gegeleerde levensmiddelen worden opgenomen en niet-dodelijke de vis. Meten fluorescentie in het omringende water in de tijd geeft aan hoe snel de FITC-dextran is die door de darm. Fluorescentie boven de achtergrond kan zodra 2 uur worden gedetecteerd met een maximum bereikte na 16 uur na het voeden (figuur 4). Dit resultaat is met controle-vis uit een aquarium. Betrouwbare resultaten antibiotica behandelde groep nog niet verkregen. Een beperking van deze procedure is dat een 2-d verhongering periode vereist voor vissen om het voedsel te eten. een adv antage van het protocol hoge gevoeligheid (laag achtergrondfluorescentie), vis eten slechts één voedselsectie kan resultaten, hoewel de gegevens beter aansluit wanneer twee secties worden gegeten. Dit protocol is eenvoudiger dan een soortgelijke werkwijze en dodelijk voor muizen 23.
Figuur 1: Schematisch overzicht van het gemeenschappelijk Experimentele Protocol. A is een stroomdiagram, van links naar rechts, vissen overgebracht van aquariumtank, gescheiden in antibiotica behandeld (vertegenwoordigers rood water) of controle (blauw), waarna vervolgens in afzonderlijke bekers fenotypes volgen. B en C tonen het proces van het extraheren van de vis huid en darmen microbiomes. Na het vortexen, worden bacteriën gesuspendeerd in de oplossing voor de analyse van de microbiële gemeenschap.55.170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ziekteverwekker Gevoeligheid. Een survival curve tijdens de blootstelling aan E. ictaluri voor vis die vooraf zijn behandeld met rifampicine (rode lijn) of een onbehandelde controlegroep (zwarte lijn) vis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gevoeligheid voor osmotische stress. Een overlevingscurve tijdens blootstelling aan hoge zoutgehalte van vissen in beide antibiotica behandelde en onbehandelde groepen. Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Food Transit Time. Fluorescentie na verloop van tijd in het water van twee vissen gevoed FITC-dextran. Fish Een aten twee gelatine voedsel secties en vis B aten één. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Gevoeligheid voor High Microbiële Environments. Blootstelling aan menselijke fecale materie werd op 3 verschillende concentraties. Overlijden verhouding x: y geeft het aantal dode vissen op het aangegeven tijdstip x opzichte van het totale aantal vissen in de experimentele groep y.
Tabel 2: Nitraat toxiciteit Challenge. Opgenomen tijd van de vissterfte in de behandelde en controlegroepen gedurende de blootstelling aan een toxische nitraatconcentratie. Overlijden verhouding x: y geeft het aantal dode vissen op het aangegeven tijdstip x opzichte van het totale aantal vissen in de experimentele groep y.
Tabel 3: Groei analyse. Veranderingen in het totale lichaamsgewicht na één maand na antibioticum of controle behandeling. Het percentage verschil in de initiële gemiddelde lichaamsgewicht (voor de vissen in dat proces-groep) in vergelijking tot de uiteindelijke gemiddelde lichaamsgewicht is de kolom Δweight. N is het aantal vissen in die groep. Het gemiddelde gewicht per vis aan het einde van de proef is ondergewicht / vis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sommige uitdagingen vereisen een rustperiode in schone APW na behandeling met antibiotica voor de drug te worden uitgeput in vis weefsels. Indien de rusttijd wordt overgeslagen dan antibioticum aanwezig kan verwarren de resultaten, vooral wanneer de bepaling omvat blootstelling aan bacteriën. Om de effecten van een veranderde microbiome samenstelling zonder grote veranderingen in het aantal microben op de host, voorlopige experimenten controle microbiome samenstelling (16S profiling of volledige genoomsequenties) en bevolkingsdichtheid (16S kwantificering via qPCR) tijdens antibiotische blootstelling onderzoeken zou vereist. Terwijl 3 d optimaal in dit systeem, het veranderen van de gastheer en / of antibiotica zouden herkalibratie vereist.
Typische van het biomedisch onderzoek, wordt het muismodel gewoonlijk gebruikt voor microbiome studies. De meest voorkomende vis model is zebravis. Om een beter begrip van de algemene eigenschappen van de structuur en functie van mucosale Microb krijgeniomes en gastheer interacties, nieuwe en atypische modellen noodzakelijk. Onze WT vis model fungeert als een authentieke bron voor het bestuderen van gastheer-microbiome interacties door het opnemen van natuurlijke gastheer genetische variatie die de andere modellen hebben verloren als gevolg van generaties-lab verhoogde dier inteelt 24. Een groot voordeel van de experimentele Gambusia is hun hardy aard, het gedogen van een breed scala van omstandigheden. Hoge overlevingskansen zijn waargenomen in het water waar de temperatuur (4-38 ° C), zoutgehalte (0-17 mg / ml), opgelost zuurstof (110-25%) en pH (4-8). Hierdoor kan niet alleen veel onderzoek omgevingscondities, maar ook meerstaps experimentele procedures die vaak te belastend voor andere vissoorten.
De hier gepresenteerde procedures zijn geschikt voor snelle screening gastheer effecten van een bepaalde behandeling te ontdekken. Follow-up studies zijn nodig om directe causaliteit en het mechanisme te bepalen. Voorbeeld uitbreiding studies de vis microbiome ontvangende effecten omvatten: meten darmontsteking, onderzoek visgezondheid door het kwantificeren vetopslag, en meting van slijm verdiepingen op de huid en de darm. Een gnotobiotische systeem wordt ontwikkeld om te studeren in detail schakels van specifieke microben aan bepaalde gastheer fenotypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | Calbiochem | 557303-1GM | |
| Sodium Nitrate | Sigma Aldrich | S5506 | |
| Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets | Calbiochem | 6500-OP | tablets dissolve in water to make PBS |
References
- Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9 (4), 95476 (2014).
- Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
- Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).
- Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).
- Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).
- Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).
- Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. , 22 (2015).
- Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).
- Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
- Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
- Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).
- Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).
- Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).
- Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
- Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
- Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
- Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
- Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).
