Artigo de método

Analisando Synaptic Modulação da Drosophila melanogaster Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

DOI:

10.3791/55176

⸱

10 de fevereiro de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós mostramos como quantificar o número ea distribuição espacial das zonas ativas sinápticas em fotorreceptores de Drosophila melanogaster, destacou com um marcador molecular geneticamente codificado, e sua modulação após a exposição prolongada à luz.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sistema nervoso tem a notável capacidade de se adaptar e responder a vários estímulos. Este ajuste neural é em grande parte alcançado através de plasticidade no nível sináptico. A zona activa (AZ) é a região na membrana pré-sináptica que medeia a libertação de neurotransmissores e é composto de uma colecção de proteínas densa de andaime. AZs de Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorreceptores submetidos a remodelação molecular após a exposição prolongada à luz ambiente natural. Assim, o nível de atividade neuronal pode reorganizar a composição molecular do AZ e contribuem para a regulação da saída funcional.

A partir da exposição à luz preparação set-up para a imuno-histoquímica, os detalhes deste protocolo como quantificar o número, a distribuição espacial, eo nível de deslocalização de moléculas sinápticas em AZs em fotorreceptores de Drosophila. Usando análise de imagem software, foram identificados grupos de o componente AZ fundido-GFP Bruchpilot para cada fotorreceptor R8 (R8) axônio terminal. manchas Bruchpilot detectados foram atribuídos automaticamente a axônios R8 individuais. Para calcular a distribuição de frequência local ao longo do axônio, implementamos um plug-in de software personalizado. -Ponto de partida de cada axônio e ponto final foram definidas manualmente e a posição de cada ponto Bruchpilot foi projetada na linha de conexão entre início e ponto final. Além do número de aglomerados Bruchpilot, nós também quantificado o nível de deslocalização Bruchpilot-GFP dentro dos aglomerados. Estas medidas refletem em detalhe a dinâmica sinápticas espacialmente resolvidos em um único neurônio sob diferentes condições ambientais aos estímulos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A modulação da função sináptica contribui para a notável capacidade do sistema nervoso para responder ou se adaptar às mudanças estímulos ambientais com precisão. Ajustar a probabilidade de liberação de vesículas pré-sináptica é uma forma de controlar a força sináptica 1. Libertação das vesículas sinápticas tem lugar na zona activa (AZ), uma região especializadas da membrana pré-sináptica 2. O AZ caracteriza-se por uma cassete de proteínas específicas 3, 4. A maioria das proteínas que contribuem para a montagem AZ são altamente conservadas em nematóides, insectos e mamíferos 5. Estudos recentes sugerem que o nível de actividade neuronal regula a composição molecular do AZ, que por sua vez contribui para a regulação da saída funcional tanto in vitro como in vivo, 6, 7,> 8. Nós já descobriram que AZs fotorreceptoras submetidos a remodelação molecular em Drosophila após a exposição prolongada à luz ambiente 9 natural. Nesta condição, observou-se que o número de Bruchpilot (Brp) AZs -positivo foi reduzida nos axônios fotorreceptoras.

As proteínas Brp / cast / família ELKS são blocos de construção fundamentais da AZs em vertebrados e invertebrados sinapses 10. Em mutantes BRP Drosophila, evocado liberação da vesícula é suprimida 11, 12. Os resíduos de aminoácido 17 do terminal C da BRP são essenciais para o agrupamento de vesícula sináptica na junção neuromuscular de Drosophila (JNM) 13, 14. Estes estudos demonstraram o papel central desta molécula na organização e na função AZ. Com uma ferramenta genética desenvolvida recentemente, Synaptic Tagging com Recombinação (estrela), a BRPpode ser observado in vivo em tipos específicos de células, a níveis de expressão endógenos e a uma única resolução sinapse 15. Esta ferramenta faz com que seja possível avaliar os dinâmica endógena de sinapses quantitativamente no sistema nervoso central complexo.

Houve diversos estudos, incluindo quantificações sinapse com base em dados obtidos a partir de microscopia confocal. alterações sinápticas foram avaliadas medindo o comprimento, a área, o volume, a densidade e contagem do número baseado em aplicações de software sofisticadas. Por exemplo, o ImageJ gratuito fornece um método de quantificação para o total de área sináptica e medidas de densidade sinápticas no Drosophila JNM 16. O número de sites de co-localização de marcadores pré e pós-sinápticos foram quantificados usando o plugin "puncta Analyzer", disponível na plataforma de software ImageJ 17. Alternativamente, um multi-parprograma baseado adigm ambiente de computação numérica, Synapse Detector (SYND), pode traçar automaticamente dendrites dos neurónios marcados com um marcador fluorescente, e, em seguida, quantifica os níveis de proteína sinápticas como uma função da distância a partir do corpo da célula 18. O software Synaptic puncta Análise (SynPAnal), foi projetado para a rápida análise de imagens 2D de neurônios adquiridos de microscopia confocal ou fluorescente. A principal função deste software é a quantificação automática e rápida da densidade e intensidade dos puncta proteína 19. Recentemente, um algoritmo de detecção automática de sinapse à base de aprendizagem tem sido gerado para a quantificação do número de sinapses em 3D 20, aproveitando-se do software de análise 3D Visualization Assistida (Vaa3D) 21.

comercial da imagem de software de análise também são ferramentas poderosas para quantificações sinápticas. Por exemplo, a fluorescênciareceptores de neurotransmissores marcados ou um componente pré-sináptico AZ foram quantificados em três dimensões com resolução-sinapse único em C. elegans 22 ou o sistema de Drosophila olfactory 23, 24, permitindo que centenas de sinapses para ser caracterizado rapidamente dentro de uma única amostra.

Aqui, nós apresentamos um método, por um software de análise de imagem personalizada plug-in implementada num ambiente de computação numérica multi-paradigma que permite analisar semi-automaticamente os múltiplos aspectos da AZs, incluindo o seu número, a distribuição e o nível de enriquecimento de componentes moleculares de o AZ. Assim, esta análise complexa nos permitiu avaliar a dinâmica de componentes sinápticas em terminais do axônio sob diferentes condições ambientais. Investigou-se o efeito da exposição à luz nas sinapses de fotorreceptores mosca adulta de saída. O procedimento é realizado em três etapas: 1)preparação para a exposição à luz, 2) dissecção, imuno-histoquímica e de imagem confocal, e 3) análise de imagem.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo envolvem exclusivamente trabalhar com Drosophila e não estão sujeitas a leis de protecção dos animais na Alemanha e no Japão.

1. As condições de exposição à luz

  1. Prepare moscas que carregam sensless-flipase (sens-flp) e bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 para a visualização Brp-GFP em neurónios R8 fotorreceptoras (R8). A BRP locus de codificação genómica dentro de um cromossoma bacteriano artificial (BAC) foi modificado para gerar esta construção-brp-FSF GFP. Nas moscas portadoras deste modificado BAC a expressão da BRP-GFP está sob o controlo das sequências reguladoras endógenas, mas limitado a R8 fotorreceptores após sensless-flipase remoção mediada FRT da cassete de FRT-Stop-15. Note-se que sens-flp raramente expressa flipase em R7s.
  2. Mantenha as moscas em um 12 h light / 12 h ciclo de escuro (LD) a 25 ° C desde a fase de larva até eclosão (Figura 1A).
  3. Recolher as moscas 0 - 6 h após a eclosão e colocá-los em um novo frasco contendo alimentos mosca.
  4. Definir os frascos em uma cremalheira transparente feito de resina acrílica com três passos (uma altura de 41 cm, uma base de 21 cm, uma espessura de 4 cm e uma altura de 13 cm para cada passo) (Figura 1B).
  5. Ajustar a distância entre a prateleira e um painel de LED para proporcionar a iluminação com uma intensidade média de 1.000 lux usando um medidor digital de luz (Figura 1C).
  6. Manter as moscas para 1-3 d sob uma das condições seguintes: escuridão constante (DD), 12 h 12 h ciclo de luz / escuro (LD), ou a luz constante (LL) a 25 ° C numa pequena incubadora (Figuras 1A e 1C).

2. Dissecção, imuno-histoquímica e imagem

  1. Dissecar cérebros da mosca com uma pinça, corrigi-los com 4% de formaldehyde e imunocoloração com o anticorpo primário contra Chaoptin (01:50) e um segundo anticorpo para a visualização de fotorreceptores com base em procedimentos experimentais anteriores 25. resumidamente:
    1. Prepare 0,1% de Triton X-100 em PBS (0,1% PBT). Esta solução é usada para melhorar a penetração no tecido anticorpo.
    2. Anestesiar moscas em uma almofada de CO 2, resolver o genótipo correta e transferi-los para uma placa de petri preenchida com 0,1% de PBT.
    3. Furar a pinça sob a tromba e retirar os olhos direito e esquerdo, respectivamente, com os outros fórceps.
    4. Remover a tromba e a traqueia ligado ao cérebro.
    5. Transferir o cérebro com a pinça para um tubo de 1,5 mL contendo 150 uL de 0,1% de PBT à TA.
    6. Dentro de 10 min de repetição 2.1.3 - 2.1.5 para obter o máximo de cérebros quanto possível.
    7. Adicionar 50 ul de 16% de formaldeído para o tubo e misturar por pipetagem.
    8. Incubar o cérebro em fixador na salatemperatura durante 50 min.
    9. Lavar três vezes com 200 uL de 0,1% de PBT com uma micropipeta, prestando atenção para deixar os cérebros no tubo.
    10. Após a última lavagem, remover o PBT 0,1% e adicionar a solução de anticorpo primário, preparado como se segue: adicionar 196 uL de 0,3% de PBT (0,3% de Triton X-100 em PBS) 4 uL de anticorpo anti-Chaoptin (diluição final 1 : 50) para visualização dos fotorreceptores.
    11. Incubar os cérebros na solução de anticorpo primário a 4 ° CO / N.
    12. Lavar 3x com 200 uL de 0,1% de PBT com uma micropipeta.
    13. Após a última lavagem, remover o PBT 0,1% e adicionar 200 uL de 0,3% a PBT contendo um anticorpo secundário.
    14. Incubar no escuro a 4 ° CO / N.
    15. Lavar três vezes com 200 uL de 0,1% de PBT com uma micropipeta.
  2. Para a montagem, colocar duas pequenas gotas (2 mL cada) de um meio de montagem com uma micropipeta no centro de uma lâmina de microscópio em aproximadamente 2 cm distaNCE um do outro.
  3. Coloque duas lamelas, um em cada gota e deixar uma abertura estreita entre as lamelas de aproximadamente 0,2 mm.
  4. Colocar 15 mL de um meio de montagem na parte superior da lamela e adicionar os cérebros com uma micropipeta para o meio de montagem.
  5. Sob um microscópio de dissecação, a posição do cérebro com o lado ventral para cima para dentro do intervalo estreito entre as duas lamelas (Figura 2).
  6. Coloque uma lamela em cima e selar as bordas da lamela usando unha polonês claro para corrigir a amostra (Figura 2).
  7. Obtenção de imagens do cérebro com um microscópio confocal. Use uma lente de 63X de imersão em óleo objectivo (1,4 NA) e um zoom digital 2,6X. Gerar mais de 20 seções ópticas da segunda medula gânglio óptico com um tamanho de passo de 0,5 mm.

3. Geração dos pontos, objetos de superfície, Start-pontos e pontos finais

  1. Para quantificar o número, distribution e o nível de deslocalização da BRP-GFP pontos lacrimais, abrir a pilha obtidas por microscopia confocal de software de análise de imagem e reconstituir imagens 3D (Figura 3A). Note-se que o passo neste estudo foi realizado com Imaris.
  2. Identificar o puncta Brp-GFP pelo módulo de detecção de ponto para cada terminal axônio R8.
    1. Selecione "Adicionar novos Spots".
    2. Selecione "Segmento de apenas uma região de interesse" nas configurações do algoritmo. Escolha um terminal axônio R8 na medula manualmente.
    3. Selecione o canal de origem do sinal Brp-GFP.
      NOTA: Os axónios fotorreceptoras R7 e R8 foram immunolabeled com anti-Chaoptin (Figura 3A). Apenas a R8, embora, contém Brp-GFP pontos lacrimais e poderia, assim, ser facilmente distinguidas (Figura 3A). Além disso, o ponto de extremidade de R8 pode ser identificado pelo desbaste dos axónios anti-Chaoptin-positivos no ponto de entrada para a camada de medula M3.
    4. Definir o diâmetro XY estimada to 0,35 mm e verificar off "subtração" na detecção de ponto.
    5. Seleccione "Qualidade" no tipo de filtro e filtrar automaticamente. Em seguida, clique em Concluir.
    6. Repita a partir do 3.2.1 t- 3.2.5 para outros axônios R (Figura 3B).
  3. Para medir o nível de deslocalização da BRP-GFP nos axônios R8, gerar objetos de superfície com a função de "Surface" para cada axônio (Figura 3C).
    1. Selecione "Adicionar novas superfícies".
    2. Selecione "Segmento de apenas uma região de interesse" nas configurações do algoritmo. Em seguida, selecione uma terminais do axônio R8 na medula manualmente.
    3. Selecione o canal de origem dos fotorreceptores.
    4. Verifique fora "Smooth".
    5. Seleccionar "intensidade absoluta" no limiar.
    6. Marque a opção "Ativar". "Pontos de origem" de diâmetro é de 0,5 uM.
    7. Selecionar tipo de filtro "Qualidade" e "Número de voxels", e depois filtrar automaticacamente.
    8. Vá em "Editar" e excluir os pedaços de superfícies geradas em outros axônios não interessantes.
    9. Repita a partir do 3.3.1 - 3.3.8 para outros axônios R (Figura 3C). Nota Alguns objetos de superfície foram interrompidos por causa da magreza e o sinal fraco em fotorreceptores na camada M2, mas eles ainda eram considerados como um único objeto do início ao pontos finais.
  4. Para identificar a distribuição dos puncta Brp-GFP ao longo de cada neurônio na neurópilo medula, definir o ponto de partida e ponto-final com a função de ponto de medição (Figura 3D).
    1. Selecione "Adicionar novos pontos de medição". Em seguida, selecione "Editar" e selecione "Superfície do objeto" a interseção com a parte superior dos objetos de superfície.
    2. Coloque pontos de medição em cima dos objetos de superfície de axônios R na camada M1 em ordem. Estas são agora definidos como start-pontos (Figura 3D).
    3. Selecione "Adicionar novos pontos de medição".Em seguida, selecione "Editar" e selecione "Superfície do objeto" a interseção com a parte inferior dos objetos de superfície.
    4. Coloque pontos de medição na parte inferior dos objectos de superfície de axónios R em camada M3 em ordem. Estas são agora definidos como pontos finais (Figura 3D).
  5. Para subtrair o sinal de fundo do canal de GFP, gerar objetos de superfície, manchas, começar pontos e pontos finais de dois axônios R na camada M6 (Figura 3E).
    1. Selecione "Adicionar novas superfícies".
    2. Selecione "Segmento de apenas uma região de interesse" nas configurações do algoritmo. Em seguida, selecione um terminal axônio R7 entre a camada M5 e M6 manualmente.
    3. Selecione o canal de origem do fotorreceptor.
    4. Verifique fora "Smooth".
    5. Seleccionar "intensidade absoluta" no limiar.
    6. Escolha um filtro do tipo "Qualidade" e "Número de voxels", em seguida, filtrar automaticamente.
    7. Selecione "Adicionar novos Spots";.
    8. Selecione "Ir criação automática, editar manualmente".
    9. Selecione "Centro de Objeto" e adicionar um local na área interna do objeto de superfície gerada a partir de 3.5.1 - 3.5.6.
    10. Repita a partir do 3.5.1 - 3.5.9 para outro terminal axônio R7.
    11. Selecione "Adicionar novos pontos de medição". Em seguida, selecione "Editar" e colocar pontos de medição na parte superior dos dois objetos de superfície da ponta do axônio terminal R7 na camada M6. Estas são agora definidos como start-pontos.
    12. Selecione "Adicionar novos pontos de medição". Em seguida, selecione "Editar" e colocar pontos de medição na parte inferior dos dois objetos de superfície da ponta do axônio terminal R7 na camada M6. Estas são agora definidos como pontos finais (Figura 3E).

4. Cálculo do número de manchas, Distribuição da Frequência Spot e nível de enriquecimento da BRP-GFP com uma imagem personalizada Software de Análise de Dados

  1. Copie o arquivo"XtquantifySynapseSNR.m" e a pasta "funções" para a pasta Matlab Imaris XT. Observe que o cálculo neste estudo foi realizado com um plug-in personalizado implementado em Matlab. Faça o download do plug-in no website ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
  2. Abra um conjunto de dados com n pontos, on superfícies e 2 objetos de ponto de medição, cada uma contendo pontos de medição n (preparados a partir de 3,1 - 3,4). O primeiro objeto de ponto de medição define as posições de início para todos os axônios. O segundo objeto ponto de medição define a posição final de todos os axônios. Ambos os objectos ponto de medição precisa de ter o mesmo número de pontos de medição (que é o número de axónios).
  3. Executar o processamento de imagem >> CUSTOM> atsushis detecção sinapse Vs 6.
  4. Verifique metadados e alterar o tamanho do pixel em software de análise de imagem no caso, não é correto.
  5. Escolha um canal para o performance da análise da intensidade das regiões pontos e regiões citoplasmáticos (o canal com Brp-GFP).
  6. Definir o nome do arquivo para exportar os resultados.
  7. Definir o número de caixas e comprimento do axônio em por cento. Digite o número de caixas como "10" e conjunto de posições como "100%" (Figuras 4A e 4B).
  8. Definem as regiões de as manchas e as outras regiões citoplasmáticas para a análise deslocalização Brp-GFP. Introduza pontos RADIUS como "0,35 mm" e largura da área como "50 mm" circundante. O raio pontos define a região para o sinal de puncta GFP (0,35 mm de diâmetro, centrado em um punctum). A largura da área circundante define a região para o sinal de GFP no domínio citoplasmático (50 um de diâmetro, centrado no ponto lacrimal, mas inclui apenas R8 e excluindo todas as áreas especiais no citoplasma) (Figuras 4A e 4C).
  9. Espere até que todas as máscaras de neurônios são processadose exportados como arquivos PDF (Figuras 4B e 4C) e uma mesa de CSV para posterior análise em uma planilha. A tabela CSV inclui o número dos pontos, a intensidade média do sinal na "área citoplasmática" e a intensidade máxima do sinal no "spot" em cada caixa para todos os axónios R8.
  10. Abra um conjunto de dados preparados em 3,5 para a subtração do sinal de fundo.
  11. Executar o processamento de imagem como descrito 4,3-4,9.
  12. Calcule a média do número total e a distribuição do puncta Brp-GFP em uma planilha (Figuras 4D e 4E).
  13. Calcula-se a média da deslocalização do sinal Brp-GFP em uma folha de cálculo, a razão entre a intensidade média na "área citoplasmática" dividida pela intensidade máxima no "spot" subtraída pela intensidade média do sinal de fundo (Figura 4F) .

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O olho composto de Drosophila compreende ~ 780 ommatidia, cada um contendo oito tipos de fotorreceptores (R1-8). R7 e R8 projeto de seus axônios para o segundo gânglio óptico, a medula, onde formam sinapses em camadas M6 e M3, respectivamente 26. Para investigar o efeito da exposição prolongada à luz sobre a composição molecular de fotorreceptoras R8 zonas ativas, tiramos vantagem do método STaR 15. Os níveis de expressão endógenos...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, nós mostramos como preparar as condições de luz para expor as moscas a uma intensidade de luz iguais. Foram quantificados não só o número de pontos lacrimais um marcador sináptica, mas também poderia resolver espacialmente a densidade de sinapses ao longo dos axónios e medir o nível de deslocalização da proteína marcador em áreas citoplasmáticos. Estas três avaliações nos permitem avaliar os detalhes da dinâmica sinápticas no único nível neuronal em diferentes condições ambientais. Nosso protocolo pode ser...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somos gratos a T. Sturner para correções votos, discussões e comentários sobre o manuscrito; SL Zipursky para fornecer estoques de mosca; M à escolarização para a realização de processamento de imagem. Parte da análise de imagem foi realizado no laboratório de A. Kakita. Este trabalho foi financiado pela Fundação Alexander von Humboldt e JSPs Bolsas de Investigação no exterior (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In-Aid para Start-up (24.800.024), em áreas inovadoras (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Fundações Toray (TS), DZNE de financiamento principal (GT) e DZNE Microscopia de Luz Facility (CM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
FrascoHightech, JapãoMKC-20
PlugThermo Fisher Sciehtific, EUAAS-275
Rack transparente personalizado feito de resina acrílica Shin-Shin Corporation, Japãouma altura de 41 cm, uma base de 21 cm, uma espessura de 4 cm e uma altura de 13 cm para cada degrau
Incubadora legalMITSUBISHI ELECTRIC, JapãoCN-40A
MISUMI, JapãoLEDXC170-W
Medidor de luz digitalCEMDT-1301
Fly padTokken, JapãoTK-HA03-S
Placa de Petri (35 x 10 mm)Greiner Bio-One International, Alemanha627102
tablet PBSTakara, JapãoT900
Triton X-100Wako, Japão160-24751
Dumont #5 FórcepsFine Science Tools11251-20
Tubo de 1,5 mLSarstedt, AlemanhaA. 152X
Formaldeído 16%NEM, Japão3152
Pipetman P-200GilsonF123601 
Pipetman P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
anticorpo anti-chaoptinDSHB24B10
Anticorpo anti-camundongo conjugado com Alexa568Life TechnologiesA-11031
VECTASHIELD Montagem Medium VectorLaboratories, Inc.Lâmina de microscópio H-1000
(76 x 26 mm)Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Alemanha
Lamínula (18 x 18 mm, 0,17 mm)Zeiss, Alemanha474030-9000-000
Microscópios IndustriaisOlympus, JapãoSZ61-C-SET
Microscópio Estéreo IluminaçãoOlympus, JapãoKL 1600 LED
microscopia confocalZeiss, AlemanhaLSM780
ImarisBitplane, SuíçaVersão 7.6.4 ou superior
MatlabThe MathWorks, Inc., USA
Excel para Mac Microsoft
Painel de LED

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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