Method Article

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

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Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Abstract

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Os cardiomiócitos são propensos a variações do ciclo celular, como endoreduplicação (rodadas contínuas de síntese de DNA sem cariocinese e citocinese) e mitose acitocinética (cariocinese, mas sem citocinese). Tais variações atípicas do ciclo celular resultam em células poliplóides e multinucleadas, em vez de divisão celular. Portanto, para determinar a renovação e regeneração cardíaca, é de crucial importância identificar corretamente os núcleos dos cardiomiócitos, o número de núcleos por célula e seu estado no ciclo celular. Isso é especialmente verdadeiro para o uso de marcadores nucleares para identificar a atividade do ciclo celular, como análogos da timidina Ki-67, PCNA ou pHH3. Aqui, apresentamos métodos para reconhecer cardiomiócitos e sua nuclearidade e para determinar sua atividade do ciclo celular. Usamos dois sistemas transgênicos publicados: a linha de camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e a linha de camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular. Combinados, esses dois sistemas facilitam o estudo da regeneração cardíaca e da plasticidade.

Introduction

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A correta identificação dos núcleos dos cardiomiócitos e o estado do ciclo celular é de importância crucial para a determinação do volume de negócios do músculo cardíaco e regeneração. Isto é especialmente verdadeiro para a utilização de marcadores nucleares, tal como pHH3, Ki-67, ou análogos de timidina, para identificar actividade do ciclo celular. Como a capacidade proliferativa dos cardiomiócitos de mamíferos adultos é muito pequeno 1, uma falsa identificação de um núcleo positivo para um marcador de proliferação de um núcleo de cardiomiócitos pode fazer uma diferença fundamental no resultado de um ensaio de proliferação. Além disso, os ca....

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Protocol

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Todos os procedimentos deste protocolo envolvendo animais estavam de acordo com os padrões éticos da Universidade de Bonn e respeitadas as diretrizes da Directiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu sobre a protecção dos animais utilizados para fins científicos.

1. In Vitro Visualização da actividade do ciclo celular em pós-natal Cardiomyocytes

  1. dissociação cardiomiócitos pós-natal
    1. preparações pré-experimental
      1. Preparar meios de cultura (IMDM, 1% de Penicilina / Estreptomicina, aminoácidos não essenciais a 1%, 0,1% β-mercaptoetanol); Meio 1: adicionar FCS a 2%; meio a 2: adicionar FCS a 20%.
      2. Re....

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Results

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De modo a analisar os efeitos dos siRNAs / miARNs sobre a actividade do ciclo celular de cardiomiócitos pós-natal in vitro, os cardiomiócitos de ratos Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin duplo-transgénicos foram isolados no dia pós-natal 3 (P3) e transfectadas com actividade indutora de miR199 5, p27 siRNA, e siRNA Fzr1 ciclo celular. Em comparação com o controlo negativo (Figura 1A), as imagens de miR199- (Figura 1B) e p27- .......

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Discussion

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Há uma controvérsia sobre se os cardiomiócitos são capazes de reentrar no ciclo celular e dividir após a lesão e durante a homeostase do tecido. Os valores para o volume de base de cardiomiócitos foram dadas no intervalo entre 1% e 1 80% 7. Também após uma lesão cardíaca, a indução da actividade do ciclo celular e a geração de novos cardiomiócitos tem sido relatado na zona de fronteira, com valores entre 0,0083% 8 e 25 - 40% 7.

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

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Agradecemos a S. Grünberg (Bonn, Alemanha) e P. Freitag (Bonn, Alemanha) por sua assistência técnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de Petri de 10 cmSarstedt821472
100 µ filtro de células mBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
Monóxido de 2,3-butanodiona (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ cânula de injeção, StericanBraun, Melsungen4657519
agulha de calibre 20Becton Dickinson GmbH301300
Placas de 24 poçosBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Metil-butanoCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
Solução de formaldeído a 37%AppliChem GmbH A0936,1000
torneira de 3 viasB. Braun Medical Inc.Seringa 16494C
50 mLB. Braun Medical Inc.8728810F
70% etanolOtto Fischar GmbH27669
Anticorpo secundário conjugado com Alexa-FluorJackson ImmunoResearch115-605-205
Alfa-Aktinina EA-53, IgG de camundongoSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Microplaca de cultura de células, 96 poços, Half AreaGreiner bio-one675986
Collagenase BRoche11088815001
microscópio confocal Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SSoro de burro Leica
Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
soro fetal para bezerrosPromoCell,
(4%)PanReac AppliChemA3697
Gelatina de pele suína, Tipo ASigma-Aldrich, lamínulas de vidro SteinheimG2500
VWR631-0146
Tubode extensão Glucose Sigma-AldrichG7021
HeidelbergerIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparina-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESLâminas de microscópio Sigma-AldrichH3375
HistoBondMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Seringa de insulinaBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModificadoDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mouse IgG Cy5 (burro)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
tubo de microcentrífugaSarstedt72690
Mini shakerVWR12620-940
miRNA mirVana mimic, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negativo controle(RNA embaralhado)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Kit de Dissociação Cardíaca NeonatalMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
Aminoácidos não essenciais, NEAAGibco / Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Soro Reduzido MeioGibco51985-026
P21-siRNAAmbion / Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion / Thermo Fischer Scientific4390771
Penicilina / EstreptomicinaGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Meio de montagem de álcool polivinílico com DABCO®, antidesvanecimentoSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
recipientes de amostraVitlab80731
Pipeta sorológicaGreiner607180
software NIS ElementsNikon
SacaroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompostoSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 iodeto (642/661)Molecular sondas/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TripsinaSigma-AldrichT1426
Aglutinina de gérmen de trigo (WGA) Fluoresceína marcadaVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
anticorpo &alfa;-actininaSigma-AldrichA7811
β-mercaptoetanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
de solução de formaldeído Heidelberg

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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