Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

Resumo

O uso de moléculas de polidesoxinucleotídeo (aptâmero de 44 meros) para detectar o íon gadolínio (III) não quelado em uma solução aquosa é descrito. A presença do íon é detectada por meio de um aumento na emissão de fluorescência do sensor.

Resumo

Um método para determinar a presença de íon gadolínio trivalente não quelado (Gd³⁺) em solução aquosa é demonstrado. O Gd³⁺ está frequentemente presente em amostras de agentes de contraste à base de gadolínio como resultado de reações incompletas entre o ligante e o íon, ou como um produto de dissociação. Como o íon é tóxico, sua detecção é de importância crítica. Aqui, o projeto e o uso de um sensor baseado em aptâmero (sensor Gd) para Gd³⁺ são descritos. O sensor produz uma mudança de fluorescência em resposta ao aumento das concentrações do íon e tem um limite de detecção na faixa nanomolar (~ 100 nM com uma relação sinal-ruído de 3). O ensaio pode ser executado em um tampão aquoso em pH ambiente (~ 7 - 7,4) em uma microplaca de 384 poços. O sensor é relativamente não reativo em relação a outros íons metálicos fisiologicamente relevantes, como íons sódio, potássio e cálcio, embora não seja específico para Gd³⁺ em relação a outros lantanídeos trivalentes, como európio (III) e térbio (III). No entanto, os lantanídeos não são comumente encontrados em agentes de contraste ou nos sistemas biológicos, e o sensor pode, portanto, ser usado para determinar seletivamente o Gd³⁺ não quelatado em condições aquosas.

Introdução

A importância crescente das imagens de ressonância magnética (MRI) em diagnóstico clínico, que é limitada pela sensibilidade inerente da técnica, resultou no rápido crescimento de investigação para o desenvolvimento de novos agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs ^1). GBCAs são moléculas que são administrados para melhorar a qualidade da imagem, e eles tipicamente têm a estrutura química de um ião trivalente gadolínio (Gd ³⁺⁾ coordenado a um ligando polidentado. Esta complexação é de importância crítica como D'us não quelatada ³⁺ é tóxico; tem sido implicado no desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica, em alguns pacientes com doença renal ou falha ^2. Consequentemente, a detecção do íon livre aquosa é fundamental para garantir a segurança dos GBCAs. A presença de não quelatada ^{Gd3 +} em soluções GBCA é muitas vezes o resultado de uma reacção incompleta entre o ligando e o ião, a dissociação do complexo, ou displacement por outros cátions metálicos biológicos ^3.

Entre as várias técnicas usadas atualmente para determinar a presença de D'us ^3+, aqueles que dependem de cromatografia e / ou classificação espectrometria mais alto em termos de versatilidade e aplicabilidade ^4. Entre as suas vantagens são de alta sensibilidade e precisão, a capacidade de analisar diferentes matrizes de amostras de soro humano (incluindo ^5, urina e cabelo ^{6, 7} de águas residuais, e formulações de agentes de contraste ^8), e a quantificação simultânea de múltiplos complexos Gd ³⁺ (um perfil de estudos antes de 2013 é descrito em uma revisão abrangente por Telgmann et al.) ^4. O único inconveniente é que vários destes métodos requerem instrumentação (tais como espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado) ⁴ que alguns laboratórios não podem ter acesso. Dentro do contexto da nova descoberta GBCA na investigação e níveis prova-de-conceito, ARmétodo baseado em espectroscopia elatively mais conveniente, rápido e de baixo custo (por exemplo, absorção de UV-Vis ou de fluorescência) pode servir como uma alternativa valiosa. Com esses aplicativos em mente, um sensor baseado em aptâmero fluorescente para aquosa ^{Gd3 +} foi desenvolvido ^9.

O aptâmero (Gd-aptâmero) é uma molécula de ADN de 44 bases de comprimento de cadeia simples com uma sequência específica de bases que foi isolado por meio do processo de evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial (SELEX) ^9. Para adaptar o aptâmero em um sensor fluorescente, um fluoróforo está ligado ao terminal 5 'da cadeia, que é então hibridado com uma cadeia de têmpera (QS), através de 13 bases complementares (Figura 1). O QS é marcado com uma molécula quencher escuro no terminal 3 '. Na ausência de ^{Gd3 +,} o sensor (Gd-sensor), composta de uma mistura 1: 2 proporção molar de Gd-aptâmero e QS respectivamente, terá de emissão de fluorescência mínima devido tO transferência de energia do fluoroforo para o inibidor. A adição de solução aquosa ^{Gd3 +} irá deslocar o QS do Gd-aptâmero, resultando num aumento da emissão de fluorescência.

Figura 1. O sensor (Gd-sensor) que consiste no longo aptâmero 44-base (Gd-aptâmero) marcados com fluoresceína (um fluoróforo) e a cadeia de 13 bases de comprimento têmpera (QS) etiquetada com DABCYL (um inibidor escuro) . Na ausência de não quelatada ^{Gd3 +,} a fluorescência do sensor é mínima. Com adição de ^{Gd3 +,} o deslocamento do QS ocorre e um aumento na emissão de fluorescência é observado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não existe, actualmente, um método baseado em espectroscopia vulgarmente utilizado para detectaring aquosa ³⁺ D'us. Este ensaio utiliza o alaranjado de xilenol molécula, que sofre uma mudança no comprimento de onda máximo de absorção 433-573 nm após a quelação com o ião ^10. A razão entre estes dois valores máximos de absorvância pode ser usado para quantificar a quantidade de não quelatada ^{Gd3 +.} O sensor de aptâmero é uma alternativa (também pode ser complementar) para o ensaio de laranja de xilenol, como os dois métodos têm diferentes condições de reacção (tais como o pH e a composição das soluções tampão utilizadas), selectividades alvo, gamas lineares de quantificação, e as modalidades de detecção ^9.

Protocolo

NOTA: água de qualidade para biologia molecular é utilizado em todas as preparações de amortecimento e de solução. Todos os tubos descartáveis ​​(microcentrífuga e PCR) e pontas de pipeta são DNase e RNase. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) para todos os produtos químicos antes da utilização. Uso de equipamento de proteção individual (EPI) é fortemente recomendado.

1. Preparação de Soluções de Stock aptâmero

1. Comprar 2 fios de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas as cadeias com purificação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
   Vertente 1 (Gd-aptâmero):
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Strand 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. Dissolver cada vertente na água para fazer 100 mm soluções stock individuais do Gd-aptâmero e o QS.
3. Armazenar as soluções à temperatura de -20 ° C. As soluções são estáveis ​​até agora, durante 3 anos.
4. Para minimizar Freezciclos e-descongelamento, armazenar as soluções de estoque em 10 mL alíquotas.

2. Preparação da Solução 2x Gd-Sensor

1. Prepara-se o tampão de ensaio (HEPES 20 mM, MgCl 2 ₂ mM, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajustar o pH para ~ 7,4 com NaOH e HCl, e filtrar através de filtros para frascos estéreis descartáveis ​​com 0,2 m de membrana PES. Armazenar em garrafas estéreis. Se filtrada e armazenada correctamente (à temperatura ambiente), o tampão é estável até agora, durante 2 anos.
2. Dilui-se 1 mL da solução de estoque de Gd-aptâmero (a partir do passo 1.2) e 2 uL da solução de estoque QS (a partir do passo 1.2) em 497 uL de tampão de ensaio. Misturar bem utilizando um vortex. Suas concentrações na solução de Gd-sensor de 2x são 200 nm e 400 nm, respectivamente.
   NOTA: O volume da solução de Gd-sensor de 2x preparado neste passo é de 500 mL, o que é suficiente para testar 6 - 7 concentrações variáveis de ^{Gd3 +} para a curva de calibração e as soluções de agente de contraste(passo 3). Cada amostra irá dar poços duplicados de uma placa de 384 poços.
   1. Ajustar o volume da solução de Gd-sensor de 2x de acordo com o número de soluções Gd ^3+, que necessita de ser testado.
3. Transferir a solução de Gd-sensor de 2x em 9 tubos de PCR, com 50 uL a cada tubo. Colocar os tubos num ciclizador térmico.
4. Definir o programa no termociclador para aquecer a solução nos tubos a 95 ° C, mantida durante 5 min, e em seguida arrefecer lentamente a solução até 25 ° C ao longo de ~ 15 min (a uma taxa de ~ 0,05-0,1 ° C / s). O ciclo de aquecimento e arrefecimento é assegurar a hibridação óptima entre o Gd-aptâmero e QS. resultados parciais de hibridação em têmpera incompleta e um fundo mais elevado de fluorescência do sensor. Se um termociclador não está disponível, realizar este processo utilizando um banho de água quente em vez disso.
5. Uma vez arrefecida a 25 ° C, utilizar imediatamente a solução, ou manter-se no termociclador (até cerca de 2 h) até que esteja pronto para serusava. Quando um banho de água é utilizado para o aquecimento, deixam os tubos no banho como a água arrefece-se lentamente até à temperatura ambiente.

3. a obtenção da curva de calibração de fluorescência e detectar a presença de não quelatada ^{Gd3 +} em solução de Gd agente de contraste

1. Dissolve-se ₃ GdCl sólido no tampão de ensaio (o mesmo tampão como no passo 2.1).
2. Através da diluição em série, preparar 100 mL cada um de 6 soluções de Gd ³⁺ diferentes em tubos de microcentrífuga com o dobro das concentrações finais desejadas para a curva de calibração (2x soluções).
   1. Por exemplo, para construir uma calibração para 0 (apenas tampão sem GdCl _3), 50, 100, 200, 400, e 800 nM de ^{Gd3 +,} preparar soluções contendo 0, 100, 200, 400, 800 e 1600 nM do ião. Certifique-se sempre incluir o "vazio" com 0 nM Gd ³⁺ como controle negativo.
3. Dissolve-se o agente de contraste a ser testeed no tampão de ensaio. Preparar 2 ou 3 diferentes concentrações das soluções de agente de contraste, por diluição em série.
   Nota: Os testes 3 diferentes concentrações da solução de agente de contraste é recomendado. Isto é para assegurar que estas concentrações estão dentro do intervalo linear. Se as amostras testadas não exibem uma relação linear, reduzir as concentrações do agente de contraste utilizado.
4. Tome os tubos de PCR contendo a solução 2x Gd-Sensor do passo 2.5 do termociclador.
5. Adicionar 50 mL de cada solução Gd ^{3 +} a partir do passo 3.2 em 6 dos tubos de PCR 9 contendo a solução 2x Gd-sensor. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Cada tubo de PCR agora contém a concentração desejada de ^{Gd3 +} a ser testado, com 100 nM de Gd-aptâmero e QS 200 nm.
6. Para os restantes tubos de PCR contendo a solução de Gd-sensor de 2x, adicionar 50 uL das soluções de agente de contraste a partir do passo 3.3. Misture bem, pipetando para cima e para baixo algumas vezes.
7. Incubar as solutions nos tubos de PCR de cerca de 5 min a temperatura ambiente. Eles podem ser deixados em repouso durante até 30 min.
8. Transferir 45 uL de cada tubo numa placa de 384 poços. Cada tubo de PCR dará poços duplicados.
9. Gravar a fluorescência de cada poço num leitor de placas. O fluoróforo (FAM) usada no projeto Gd-sensor tem excitação e emissão máximos de 495 e 520 nm, respectivamente, conforme listado no site do fornecedor. Escolha comprimentos de onda ou filtros de excitação e emissão adequados, dependendo se o leitor de placas é monochromator- ou baseado em filtro.
10. Traçar o gráfico da fluorescência em unidades de fluorescência arbitrárias (AFU) contra concentração de Gd ^{3 +.}
11. Traçar o gráfico como a mudança de fluorescência vezes contra a concentração de Gd ^{3 +.} Calcule a variação de fluorescência vezes dividindo o AFU de cada concentração pela AFU da solução "vazio" (com 0 nM de D'us ^3+). A alteração de fluorescência de dobragem vai permitir a Normalization dos resultados, caso a exibição AFU alguns periódica (dias diferentes, etc.) variações.
12. Comparar a emissão de fluorescência da solução que contém o agente de contraste e o "branco", que é a solução contendo 0 nM GdCl ₃ (tampão apenas).
    NOTA: A maior fluorescência da solução GBCA implica a presença de não quelatada ^{Gd3 +,} o que pode necessitar de purificação adicional do agente de contraste. A quantidade de não quelatada Gd ³⁺ presente pode ser estimada utilizando a curva de calibração construída na etapa 3.10 ou 3.11.

Resultados

Uma mudança de fluorescência típica da solução de Gd-sensor na presença de não quelatada ^{Gd3 +} é mostrada na Figura 2. A emissão pode ser representada graficamente como a mudança de fluorescência vezes (Figura 2A) ou a fluorescência em bruto leitura (Figura 2B) em unidades arbitrárias (AFU). Ambos os lotes se obter curvas de calibração muito semelhantes, com um intervalo linear de concentrações de Gd ³⁺ abaixo de 1 ...

Discussão

Usando o Gd-sensor baseado em aptâmero, um aumento na emissão de fluorescência que é proporcional à concentração de não quelatada ^{Gd3 +} é observada. Para minimizar a quantidade de amostra utilizada, o ensaio pode ser executado numa microplaca de 384 cavidades com um volume total de amostra de 45 uL por poço. Neste design, a escolha de fluoresceína (FAM) e dabcil (DAB) baseou-se principalmente sobre o custo dos reagentes; para modificar o comprimento de onda de emissão, um emparelhamento diferente de fluorófor...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gd-aptâmero	IDTDNA	Sequência de entrada e modificação do fluoróforo na forma de pedido	Um fluoróforo com um comprimento de onda de emissão diferente pode ser usado. O aptâmero também pode ser encomendado a outra empresa.
Fita de têmpera	IDTDNA	Sequência de entrada e modificação do atenuador no formulário de pedido	Um atenuador diferente para transferência de energia ideal do fluoróforo pode ser usado. O aptâmero também pode ser encomendado a outra empresa.
		de grau de biologia molecular	Nenhum fabricante específico, tanto o DEPC quanto o não tratado com DEPC funcionam igualmente bem
Cloreto de gadolínio (III) anidro	Strem	936416	Tóxico
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Cloreto de magnésio anidro	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Cloreto de Sódio	Acros Organics
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	P333-500
Hidróxido de sódio, pellets	Fisher Scientific	BP359
Ácido clorídrico	Fisher Scientific	SA49	Placas NBS de
poliestireno de fundo plano preto de flange baixa de 384 poços tóxico e corrosivo Placas NBS	Corning	3575	que são adequadas para fluorescência leitura são obrigatórias.
Filtro de topo de garrafa descartável estéril Nalgene Rapid-Flow	Thermo Scientific	5680020	A tampa da garrafa está equipada com membrana PES de 0,2 mícron
Frascos estéreis descartáveis 250 mL	Corning	430281	Pode ser usada uma garrafa maior ou menor Tubos
		microcentrífuga de 1,5 mL	Nenhum fabricante específico, desde que sejam livres de DNAse e RNAse
Tubos			de PCR de 0,2 mLNenhum fabricante específico, desde que sejam Micropipetas
			Nenhum fabricante específico
Pontas de pipeta (sem filtro) de tamanhos apropriados			Nenhum fabricante específico, desde que sejam livres de DNAse e RNAse
EquipamentoLeitor de
placas	Biotek Synergy H1		Leitores de placas de outros fabricantes funcionariam igualmente bem