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Artigo de método

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e

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DOI:

10.3791/55218

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16 de janeiro de 2017

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

Neste artigo

Resumo

As interações proteína-proteína podem ocorrer tanto no núcleo quanto no citoplasma de uma célula. Para investigar essas interações, a co-imunoprecipitação tradicional e o ensaio moderno de ligação de proximidade são aplicados. Neste estudo, comparamos esses dois métodos para visualizar a distribuição das interações NF90-RBM3 no núcleo e no citoplasma.

Resumo

As interações proteína-proteína estão envolvidas em milhares de processos celulares e ocorrem em contextos espaciais distintos. Tradicionalmente, a co-imunoprecipitação é uma técnica popular para detectar interações proteína-proteína. A análise subsequente de Western blot é o método mais comum para visualizar proteínas co-imunoprecipitadas. Recentemente, o ensaio de ligação de proximidade tornou-se uma ferramenta poderosa para visualizar as interações proteína-proteína in situ e oferece a possibilidade de quantificar as interações proteína-proteína por esse método. Semelhante à imunocitoquímica convencional, a técnica de ensaio de ligação de proximidade também se baseia na acessibilidade de anticorpos primários aos antígenos, mas, em contraste, o ensaio de ligação de proximidade detecta interações proteína-proteína com uma técnica única envolvendo PCR de círculo rolante, enquanto a imunocitoquímica convencional mostra apenas co-localização de proteínas.

O fator nuclear 90 (NF90) e a proteína 3 do motivo de ligação ao RNA (RBM3) foram previamente demonstrados como parceiros de interação. Eles estão predominantemente localizados no núcleo, mas também migram para o citoplasma e regulam as vias de sinalização no compartimento citoplasmático. Aqui, comparamos a interação NF90-RBM3 tanto no núcleo quanto no citoplasma por co-imunoprecipitação e ensaio de ligação de proximidade. Além disso, discutimos as vantagens e limitações dessas duas técnicas na visualização das interações proteína-proteína em relação à distribuição espacial e às propriedades das interações proteína-proteína.

Introdução

Fator nuclear 90 (NF90) é uma proteína multi-isoforma com inúmeras funções, incluindo a resposta à infecção viral, a regulação de interleucina-2 pós-transcrição e regulação do miRNA biogênese 1-3. RBM3 é uma proteína de ligação a ARN, envolvidos na tradução e miARN biogénese e pode ser induzida por vários factores de stress incluindo a hipoxia e hipotermia 4-6. Recentemente, encontramos NF90 e RBM3 em um complexo de proteínas 7. A interacção de NF90 e RBM3 é essencial para modular a actividade de proteína quinase-ARN como retículo endoplasmático quinase (PERK) em resposta proteína desdobrada 7. Ambos NF90 e RBM3 estão localizados predominantemente no núcleo, mas uma pequena proporção de NF90 e de transporte RBM3 para o citoplasma e se ligam uns aos outros para lá para funções específicas, por exemplo, para regular a actividade de vantagem. Portanto, é importante para visualizar a distribuição de interacções NF90-RBM3 no compartimento subcelular, que pode indicarseus vários papéis no respectivo compartimento.

Décadas atrás, dois híbridos de levedura (Y2H) foi desenvolvido para detectar a interacção entre duas proteínas 8. No entanto, devido à construção artificial de proteínas fundidas, falsos resultados positivos têm restringido a aplicação deste método. Durante muito tempo, a co-imunoprecipitação foi a principal técnica para analisar interacções proteína-proteína, especialmente em condições endógenas 9. Para analisar o complexo de proteína de co-imunoprecipitada, Western blot é a técnica mais conveniente, enquanto a espectrometria de massa é usada quando super-sensibilidade e precisão são desejados. Nos últimos anos, ensaio de proximidade de ligação foi desenvolvida como um método novo para a detecção de interacções proteína-proteína em ambas as células e tecidos in situ 10,11.

Aqui, nós comparamos o método de co-imunoprecipitação mais popular e método de ensaio de proximidade de ligação relativamente nova na captura NF9interacção 0-RBM3 em fracções subcelulares. Também discutimos as vantagens e limitações de ambas as técnicas.

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Protocolo

1. Co-imunoprecipitação

  1. Semente HEK293 células a 2 x 10 5 células por cavidade em uma placa de 6 cavidades em 2 ml de modificação Médio suplemento (DMEM) de Eagle da Dulbecco com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) .
  2. Crescer as células durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
  3. Lavar as células com soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS) três vezes. Células colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. A preparação das fracções nuclear e citoplasmática usando reagentes de extracção nuclear e citoplasmática comerciais. Siga as instruções do fabricante, com algumas modificações.
    1. Use 3 X 10 6 células para uma experiência de co-imunoprecipitação (aproximadamente com 90% de confluência de 3 poços de uma placa de 6 poços). Adicionar 300 ul solução fria citoplasmática de extração (CER I) e vortex por 15 segundos na velocidade mais alta.
    2. Incubar durante 30 min em gelo. Durante a incubação, vorteX 5 s por cada 10 min.
    3. Adicionar 16,5 ul extracção a frio citoplasmática solução II (CER II), vortex durante 5 segundos e incubar por 5 min em gelo.
    4. Vortex durante 5 segundos e centrifugar a 16000 xg durante 5 min a 4 ° C.
    5. Transferir o sobrenadante (extracto citoplásmico) para um novo tubo de pré-gelada, e manter em gelo até ser utilizada.
    6. Lavar peletes insolúveis (núcleos) que contêm três vezes com PBS frio 1 ml de cada vez por pipetagem para cima e para baixo cinco vezes. Remover PBS após lavagem.
    7. Adicionar 150 mL solução de extracção a frio nuclear (NER), vortex durante 15 seg e incubar 1 hora em gelo. Durante a incubação, vortex durante 15 seg e pipeta de 10 vezes com uma ponta de 200 ul a cada 10 min.
    8. Vortex durante 15 segundos e centrifugar a 16000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    9. Transferir o sobrenadante (extracto nuclear) para um novo tubo de pré-gelada, manter em gelo até à sua utilização.
  5. Retire 10% do volume de extractos nucleares e citoplasmáticos como entradas cada.
  6. UMAdd PBS frio para os restantes extractos para um volume final de 1 ml. Manter em gelo até à sua utilização.
    NOTA: Pré-compensação não é essencial quando se utiliza a proteína G conjugada esferas magnéticas. No entanto, se o fundo é alta, realizar pré-limpeza por incubação de 40 ul de esferas de proteína G-conjugados magnéticos (pasta a 50%) e 1 ml de lisado diluído a partir deste passo, a 4 ° C durante 30 min num agitador rotativo. sobrenadante separado (lisado pré-limpo) de grânulos com cremalheira magnética. Descarte as contas.
  7. Para o anticorpo primário par com esferas magnéticas Proteína G-conjugados, incubar 40 ul de proteína esferas magnéticas L-conjugados (pasta a 50%) com o anticorpo 4 ug policlonal de coelho anti-RBM3 ou IgG de coelho (controlo negativo) em 200 ul de PBS mais Tween 20 (PBST, 0,02% de Tween 20) à temperatura ambiente (TA) durante 40 min num agitador rotativo.
  8. grânulos e sobrenadante separado anticorpo acoplado com uma cremalheira magnética, e desprezar o sobrenadante. Lavam-se as esferas uma vez com 200 uL de PBST (0,02%).
  9. Adicione 1ml diluída lisados ​​(ou, se necessário, os lisados ​​pré-limpo) para os grânulos, e incubar num agitador rotativo a 4 ° C durante a noite.
  10. No dia seguinte, separar as esferas e o sobrenadante por uma cremalheira magnética, e desprezar o sobrenadante. Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBST (0,02%) para cada tubo a 4 ° C num agitador rotativo com uma velocidade fixa de 20 rpm.
  11. Eluir proteínas a partir dos grânulos através da adição de tampão de amostra de 40 ul (tampão de amostra comercial 1x e 1,4 mM de ditiotreitol-50 (DTT)). Aquece-se a 70 ° C durante 10 min. Spin down e líquidos de transferência para um novo tubo de 1,5 ml.
  12. Dilui-se lisados ​​de entrada em tampão de amostra (concentração final: tampão de amostra comercial 1x e DTT 50 mM) e aquece-se a 70 ° C durante 10 min. entradas de carga e as proteínas imunoprecipitadas a partir do último passo de um gel pré-moldado de 4-12% Bis-Tris. O volume de carga de cada cavidade não deve exceder 20 ul. Efectuar a electroforese em tampão de corrida 1x comercial em gelo durante 35 min.
    NOTA: Carga nuclear e extrato citoplasmáticos numa proporção de 1: 2 (V / V), o que reflecte a mesma quantidade inicial de células.
  13. Transferência de proteínas para uma membrana de PVDF em tampão de transferência comercial 1x a 30 V durante 2 horas a 4 ° C.
  14. Bloco de membrana com 5% de leite desnatado em PBST (0,1% de Tween 20) à temperatura ambiente durante 40 minutos num agitador.
  15. Incubar membrana com anticorpos primários (ambos diluídos em 1: 1000) em PBST (0,1%) a 4 ° C durante a noite.
  16. Lavar 3 x 10 min com PBST (0,1%) à temperatura ambiente num agitador.
  17. Incubar membrana com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários anti-murganho ou anti-coelho (ambos diluídos em 1: 5000) em PBST (0,1%) à temperatura ambiente durante 1 h.
  18. Lavar 3 x 10 min com PBST (0,1%) à temperatura ambiente num agitador.
  19. Use 0,2 ml quimioluminescência aumentada (ECL) de uma mistura de substrato por membrana cm 2, incubar à TA durante 5 min. Evite toda a luz a partir desta etapa em diante, exceto luzes vermelhas.
  20. Descartar líquido e expor a um filme de raios-X em uma cassete de película. Desenvolver filme usando uma pr filme automáticamáquina ocessing.

2. Imunocitoqu�ica e proximidade Ligadura Assay

  1. Semente células HEK293 em 1.5 x 10 4 culas por câmara em uma câmara de 8-poli-D-lisina lâmina revestida em 0,4 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e 100 U / ml de Pen-Strep.
  2. Crescer as células durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
  3. Aspirar o meio, e fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 10 min à TA.
  4. Aspirar PFA, e lavagem de 3 x 10 min com 0,5 ml de PBS por câmara.
  5. Permeabilizar as células e de bloco com 0,5% de Triton X-100 e 5% de soro de cabra normal (NGS) em PBS à temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Incubar com anticorpos primários em 0,1% de Triton X-100 e 5% em PBS, NGS num agitador a 4 ° C durante a noite. Diluir monoclonal de ratinho anti-NF90 e anticorpo policlonal de coelho anti-anticorpo RBM3 1: 100 em PBS durante dupla coloração. Para controlo negativo, omitir independentemente, qualquer um dos dois anticorpos primários, e omitir ambos os anticorpos em um terceiro controlo.
    NOTA: Não utilize o bloqueio comercial e reagentes de diluição.
  7. Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBS por câmara.
  8. Sujeito a imunocitoquímica ou de proximidade protocolos de ensaio ligadura
    1. imunocitoquímica
      1. Incubar com 1: 500 diluído fluorescente acoplado-corante verde anti-ratinho e de anticorpos acoplados à corantes fluorescentes vermelhas anti-coelho secundário à TA durante 1 h. Evite luz a partir desta etapa em diante.
      2. contracoloração núcleos com 4 ', 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) diluído 1: 5000 em PBS à temperatura ambiente durante 10 min.
      3. Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBS por câmara.
      4. Retirar as câmaras da lâmina de vidro e seco. Monte com 250 μ, médio por lâmina de montagem.
    2. ensaio de ligação de proximidade
      1. Prepare proximidade sondas de ensaio de ligação. Misture e diluir sondas de ensaio ligadura dois proximidade (anticorpos secundários anti-ratinho e anti-coelho ligados com diferentes oligonucleotídeos que pode ligar tháspera a adição de dois outros oligonucleótidos em solução de ligação) ambos 1: 5 em 0,1% de Triton X-100 e 5% de NGS em PBS, com um volume total de 320 ul de uma lâmina de 8 câmaras (aproximadamente 40 ul por cm 2) . Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
      2. Retirar as câmaras da lâmina de vidro e adicionar as sondas diluído. Incubar numa incubadora de humidade a 37 ° C durante 1 h.
      3. Preparar a solução de ligação. Misture 8 ul ligase, 64 ul da ligadura 5 x e 248 mL de H 2 O.
      4. Toque o líquido a partir do slide, e lava-se 2 x 5 minutos em 1x tampão de lavagem A (fornecido com o kit).
      5. Adicionar a solução de ligação, e incubar numa incubadora de humidade a 37 ° C durante 30 min.
      6. Preparar a solução de amplificação. Misture 4 ul polimerase, da ampliação de 5x 64 ul e 252 ul H 2 O. Evite luz a partir desta etapa em diante.
      7. Toque off líquido a partir do slide, e lave 2 x 2 min em 1x tampão de lavagem A.
      8. Adicione o amplification solução e incubar numa incubadora de humidade escuro a 37 ° C durante 100 min.
      9. Toque o líquido a partir do slide, e lava-se 2 x 10 minutos em 1x tampão de lavagem B (fornecido com o kit). Lavar durante 1 min em 0.01x Wash Buffer B.
      10. Seque o slide e montagem com 250 mL de um meio de montagem comercial (com DAPI) por slide.
  9. Examine sinais fluorescentes sob um microscópio utilizando uma lente ocular 10X e 20X lente objetiva. Aquisição de imagens por uma câmera CCD.

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Resultados

A Figura 1 demonstra que NF90 e RBM3 são ambos proteínas nucleares e apenas uma pequena fracção está presente no citoplasma. Notavelmente, existem três diferentes bandas coradas positivas para RBM3. O menor logo abaixo de 20 kDa reflecte o tamanho correcto de RBM3 (o peso molecular previsto de 17 kDa é RBM3). A origem das duas outras bandas continua a ser investigado. experiências de co-imunoprecipitação com RBM3 como a proteína isca revelou que as interações NF90-RBM3 s...

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Discussão

Há vários benefícios, bem como deficiências para ambos os métodos. Como uma técnica relativamente nova, uma vantagem óbvia de ensaio de proximidade de ligação é a viabilidade para elucidar as interacções proteína-proteína ao nível de uma única célula em vez de um lote de células heterogéneas. Imagens com alta magnitude e resolução (por exemplo, através de microscópio confocal) prever a possibilidade de quantificação contando manchas fluorescentes individuais. Em contraste, a combinação convencional de técnica d...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Águia modificada de Dulbecco' s Medium (DMEM)SigmaD6429Glicose alta
4.500 mg/L
Soro fetal bovino (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Penicilina-Estreptomicina (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER Reagentes de Extração Nuclear e CitoplasmáticaThermo Fisher Scientific78833
1,4-Ditiotreitol (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90 / NF110) anticorpoBD Transduction Laboratories612154uso 1: 1.000 para WB e 1: 100 para anticorpo ICC / PLA
RBM3ProteinTech14363-1-APuso 1: 1.000 para WB e 1: 100 para ICC / PLA
Lamin A / C anticorpoTecnologiade sinalização celular#2032use 1:1.000 para WB 
anticorpo anti-GAPDHAbcamab8245use 1:1.000 para WB 
IgG de coelho normalSanta Cruzsc-2027
IgG anti-coelho, anticorpo secundário ligado a HRPTecnologia de Sinalização Celular#7074use 1:5,000 para WB 
anticorpo secundário HRP anti-camundongoCarl Roth4759.1use 1:5,000 para WB 
Substrato de Blotting Western ECLClarity Bio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 membrana PVDFGE Healthcare Life Sciences10600021
Poli-D-Lisina 8 Lâmina de Cultura de PoçosCorning BioCoat354632
Paraformaldeído (PFA)SigmaP6148
Soro de cabra normal (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
IgG anti-rato de cabra (anticorpo H+L), conjugado Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
IgG anti-coelho de cabra (anticorpo H+L), conjugado Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
4′, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)SigmaD9542
Sonda Duolink PLA Anti-rato PLUSSigmaDUO92001
Duolink PLA  sonda Anti-coelho MENOSSigmaDUO92005
Reagentes de Detecção Duolink RedSigmaDUO92008
Duolink Wash Buffers FluorescênciaSigmaDUO82049
Duolink Meio de Montagem com DAPISigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
MicroscópioOlympusAX-70
Câmera CCDSPOTInsight 2MP Firewire
Filme de raio-XFujifilmSuper RX
Máquina de processamento de filmeFujifilmFPM-100A

Referências

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