Artigo de método

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e In Situ Proximidade Ligadura Assay

DOI:

10.3791/55218

⸱

16 de janeiro de 2017

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As interações proteína-proteína podem ocorrer tanto no núcleo quanto no citoplasma de uma célula. Para investigar essas interações, a co-imunoprecipitação tradicional e o ensaio moderno de ligação de proximidade são aplicados. Neste estudo, comparamos esses dois métodos para visualizar a distribuição das interações NF90-RBM3 no núcleo e no citoplasma.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As interações proteína-proteína estão envolvidas em milhares de processos celulares e ocorrem em contextos espaciais distintos. Tradicionalmente, a co-imunoprecipitação é uma técnica popular para detectar interações proteína-proteína. A análise subsequente de Western blot é o método mais comum para visualizar proteínas co-imunoprecipitadas. Recentemente, o ensaio de ligação de proximidade tornou-se uma ferramenta poderosa para visualizar as interações proteína-proteína in situ e oferece a possibilidade de quantificar as interações proteína-proteína por esse método. Semelhante à imunocitoquímica convencional, a técnica de ensaio de ligação de proximidade também se baseia na acessibilidade de anticorpos primários aos antígenos, mas, em contraste, o ensaio de ligação de proximidade detecta interações proteína-proteína com uma técnica única envolvendo PCR de círculo rolante, enquanto a imunocitoquímica convencional mostra apenas co-localização de proteínas.

O fator nuclear 90 (NF90) e a proteína 3 do motivo de ligação ao RNA (RBM3) foram previamente demonstrados como parceiros de interação. Eles estão predominantemente localizados no núcleo, mas também migram para o citoplasma e regulam as vias de sinalização no compartimento citoplasmático. Aqui, comparamos a interação NF90-RBM3 tanto no núcleo quanto no citoplasma por co-imunoprecipitação e ensaio de ligação de proximidade. Além disso, discutimos as vantagens e limitações dessas duas técnicas na visualização das interações proteína-proteína em relação à distribuição espacial e às propriedades das interações proteína-proteína.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fator nuclear 90 (NF90) é uma proteína multi-isoforma com inúmeras funções, incluindo a resposta à infecção viral, a regulação de interleucina-2 pós-transcrição e regulação do miRNA biogênese 1-3. RBM3 é uma proteína de ligação a ARN, envolvidos na tradução e miARN biogénese e pode ser induzida por vários factores de stress incluindo a hipoxia e hipotermia 4-6. Recentemente, encontramos NF90 e RBM3 em um complexo de proteínas 7. A interacção de NF90 e RBM3 é essencial para modular a actividade de proteína quinase-ARN como retículo endoplasmático quinase (PERK) em resposta proteína desdobrada 7. Ambos NF90 e RBM3 estão local....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Co-imunoprecipitação

  1. Semente HEK293 células a 2 x 10 5 células por cavidade em uma placa de 6 cavidades em 2 ml de modificação Médio suplemento (DMEM) de Eagle da Dulbecco com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) .
  2. Crescer as células durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
  3. Lavar as células com soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS) três vezes. Células colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. A preparação das fracções nuclear e citoplasmática usando reagentes de extracção nuclear e citoplasmática comerciais. Siga as instruções....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Figura 1 demonstra que NF90 e RBM3 são ambos proteínas nucleares e apenas uma pequena fracção está presente no citoplasma. Notavelmente, existem três diferentes bandas coradas positivas para RBM3. O menor logo abaixo de 20 kDa reflecte o tamanho correcto de RBM3 (o peso molecular previsto de 17 kDa é RBM3). A origem das duas outras bandas continua a ser investigado. experiências de co-imunoprecipitação com RBM3 como a proteína isca revelou que as interações NF90-RBM3 s.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Há vários benefícios, bem como deficiências para ambos os métodos. Como uma técnica relativamente nova, uma vantagem óbvia de ensaio de proximidade de ligação é a viabilidade para elucidar as interacções proteína-proteína ao nível de uma única célula em vez de um lote de células heterogéneas. Imagens com alta magnitude e resolução (por exemplo, através de microscópio confocal) prever a possibilidade de quantificação contando manchas fluorescentes individuais. Em contraste, a combinação convencional de técnica d.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pela Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Águia modificada de Dulbecco' s Medium (DMEM)SigmaD6429Glicose alta
4.500 mg/L
Soro fetal bovino (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Penicilina-Estreptomicina (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER Reagentes de Extração Nuclear e CitoplasmáticaThermo Fisher Scientific78833
1,4-Ditiotreitol (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90 / NF110) anticorpoBD Transduction Laboratories612154uso 1: 1.000 para WB e 1: 100 para anticorpo ICC / PLA
RBM3ProteinTech14363-1-APuso 1: 1.000 para WB e 1: 100 para ICC / PLA
Lamin A / C anticorpoTecnologiade sinalização celular#2032use 1:1.000 para WB 
anticorpo anti-GAPDHAbcamab8245use 1:1.000 para WB 
IgG de coelho normalSanta Cruzsc-2027
IgG anti-coelho, anticorpo secundário ligado a HRPTecnologia de Sinalização Celular#7074use 1:5,000 para WB 
anticorpo secundário HRP anti-camundongoCarl Roth4759.1use 1:5,000 para WB 
Substrato de Blotting Western ECLClarity Bio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 membrana PVDFGE Healthcare Life Sciences10600021
Poli-D-Lisina 8 Lâmina de Cultura de PoçosCorning BioCoat354632
Paraformaldeído (PFA)SigmaP6148
Soro de cabra normal (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
IgG anti-rato de cabra (anticorpo H+L), conjugado Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
IgG anti-coelho de cabra (anticorpo H+L), conjugado Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
4′, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)SigmaD9542
Sonda Duolink PLA Anti-rato PLUSSigmaDUO92001
Duolink PLA  sonda Anti-coelho MENOSSigmaDUO92005
Reagentes de Detecção Duolink RedSigmaDUO92008
Duolink Wash Buffers FluorescênciaSigmaDUO82049
Duolink Meio de Montagem com DAPISigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
MicroscópioOlympusAX-70
Câmera CCDSPOTInsight 2MP Firewire
Filme de raio-XFujifilmSuper RX
Máquina de processamento de filmeFujifilmFPM-100A

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Fra es Nucleocitoplasm ticasAn lise por Western BlotImunocitoqu micaC lulas HEK293Intera o NF90 RBM3An lise de Compartimento CelularMicroscopia de Fluoresc ncia

Artigos relacionados